CN114375204A - 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及吡咯并苯并二氮杂

Description

吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
早期申请
本申请要求2019年6月7日提交的英国申请号GB1908128.0的优先权。
技术领域
本公开涉及具有呈连向抗体的接头的形式的不稳定C2或N10保护基团的吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000012
(PBD)。
背景技术
吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000013
一些吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000014
(PBD)具有识别并且结合特定DNA序列的能力；优选序列为PuGPu。第一种PBD抗肿瘤抗生素安曲霉素(anthramycin)发现于1965年(Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.，87，5793-5795(1965)；Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.，87，5791-5793(1965))。自那以后，已报道了许多天然存在的PBD，并且已开发了用于各种类似物的10种以上的合成路线(Thurston等，Chem.Rev.1994，433-465(1994)；Antonow，D.和Thurston，D.E.，Chem.Rev.2011 111(4)，2815-2864)。家族成员包括赤霉素(abbeymycin)(Hochlowski等，J.Antibiotics，40，145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi等，J.Antibiotics，37，200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180 487；Thurston等，Chem.Brit.，26，767-772(1990)；Bose等，Tetrahedron，48，751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto等，J.Antibiotics，33，665-667(1980))、新茴霉素(neothramycin)A和B(Takeuchi等，J.Antibiotics，29，93-96(1976))、泊罗霉素(porothramycin)(Tsunakawa等，J.Antibiotics，41，1366-1373(1988))、普拉卡素(prothracarcin)(Shimizu等，J.Antibiotics，29，2492-2503(1982)；Langley和Thurston，J.Org.Chem.，52，91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara等，J.Antibiotics，41，702-704(1988)；Itoh等，J.Antibiotics，41，1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(sibiromycin)(Leber等，J.Am.Chem.Soc.，110，2992-2993(1988))以及托马霉素(tomamycin)(Arima等，J.Antibiotics，25，437-444(1972))。PBD具有以下一般结构：
Figure BDA0003397768530000021
它们的不同之处在于其芳族A环与吡咯并C环中的取代基的数目、类型和位置以及C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，所述N10-C11位置为负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物均在手性C11a位置处具有(S)-构型，当从C环朝向A环观察时，这为其提供右手扭转。这给予它们适当的三维形状以获得与B型DNA的小沟的同螺旋性(isohelicity)，从而使得在结合位点处紧密贴合(snug fit)(Kohn，Antibiotics III.Springer-Verlag，New York，第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter，Acc.Chem.Res.，19，230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使它们能够干扰DNA加工，因此使它们用作抗肿瘤剂。
一种特别有利的吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000023
化合物被Gregson等(Chem.Commun.1999，797-798)描述为化合物1，并且被Gregson等(J.Med.Chem.2001，44，1161-1174)描述为化合物4a。这种化合物也称为SG2000，如下所示：
Figure BDA0003397768530000022
WO 2007/085930描述了具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物的制备。接头存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
本发明人已在WO 2011/130613和WO 2011/130616中描述了具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物。这些化合物中的接头经由C2位置连接至PBD核心，并且通常因酶对接头基团的作用而裂解。在WO 2011/130598中，这些化合物中的接头连接至PBD核心上的可用N10位置中的一者，并且通常因酶对接头基团的作用而裂解。
抗体-药物缀合物
已建立抗体疗法用于靶向治疗患有癌症、免疫和血管生成病症的患者(Carter，P.(2006)Nature Reviews Immunology 6:343-357)。使用抗体-药物缀合物(ADC)(即免疫缀合物)局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即癌症治疗中用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)以将药物部分递送至肿瘤以及其中的细胞内累积为目标，而这些非缀合药物剂的全身施用可能会对正常细胞产生不可接受的毒性水平(Xie等(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtun等(2006)Cancer Res.66(6):3214-3121；Law等(2006)Cancer Res.66(4):2328-2337；Wu等(2005)Nature Biotech.23(9):1137-1145；Lambert J.(2005)CurrentOpin.in Pharmacol.5:543-549；Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15(9):1087-1103；Payne，G.(2003)Cancer Cell3:207-212；Trail等(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614)。
由此试图以最低的毒性达到最大的功效。设计和改进ADC的努力重点放在了单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物作用机制、药物连接、药物/抗体比(负载量)以及药物释放特性上(Junutula等，2008b Nature Biotech.，26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249；McDonagh(2006)ProteinEng.Design&Sel.19(7)：299-307；Doronina等(2006)Bioconj.Chem.17:114-124；Erickson等(2006)Cancer Res.66(8):1-8；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852；Jeffrey等(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070)。药物部分可通过包括微管蛋白结合、DNA结合、蛋白酶体和/或拓扑异构酶抑制的机制赋予它们的细胞毒性和细胞生长抑制作用。一些细胞毒性药物在缀合至大型抗体或蛋白质受体配体时倾向于失活或活性减小。
本发明人已开发特定的PBD二聚体抗体缀合物。
发明内容
本公开的第一方面包含一种式L-(DL)p的缀合物，其中DL具有式I或II：
Figure BDA0003397768530000041
其中：
L为如下文所定义的抗体(Ab)；
当C2’与C3’之间存在双键时，R12选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure BDA0003397768530000051
其中R21、R22以及R23中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure BDA0003397768530000052
其中R25a和R25b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure BDA0003397768530000053
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2'与C3'之间存在单键时，
R12为
Figure BDA0003397768530000054
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R26a和R26b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤基；
其中R和R'独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR'、硝基、Me3Sn以及卤基；
R″为C3-12亚烷基，所述链可由以下间断开：一个或多个杂原子，例如O、S；NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)；和/或芳族环，例如苯或吡啶；
Y和Y'选自O、S或NH；
R6'、R7'、R9'分别选自与R6、R7以及R9相同的基团；
[式I]
RL1'为用于连接至抗体(Ab)的接头；
R11a选自OH、ORA(其中RA为C1-4烷基)以及SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子；
R20和R21一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R20选自H和RC，其中RC为封端基团；
R21选自OH、ORA以及SOzM；
当C2与C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure BDA0003397768530000061
其中R11、R12以及R13中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R2基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure BDA0003397768530000062
其中R15a和R15b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure BDA0003397768530000071
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2与C3之间存在单键时，
R2为
Figure BDA0003397768530000072
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R16a和R16b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
[式II]
R22具有式IIIa、式IIIb或式IIIc：
(a)
Figure BDA0003397768530000073
其中A为C5-7芳基，并且
(i)Q1为单键，并且Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中Z选自单键、O、S以及NH，并且n为1至3；或
(ii)Q1为-CH＝CH-，并且Q2为单键；
(b)
Figure BDA0003397768530000074
其中；
RC1、RC2以及RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基；
(c)
Figure BDA0003397768530000075
其中Q选自O-RL2'、S-RL2'以及NRN-RL2'，并且RN选自H、甲基以及乙基
X选自包含以下的组：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、
Figure BDA0003397768530000081
NRNRL2’，其中RN选自包含H和C1-4烷基的组；
RL2’为用于连接至抗体(Ab)的接头；
R10和R11一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R10为H并且R11选自OH、ORA以及SOzM；
R30和R31一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R30为H，并且R31选自OH、ORA以及SOzM。
在一些实施方案中，缀合物不为：
ConjA
Figure BDA0003397768530000082
ConjB
Figure BDA0003397768530000083
ConjC：
Figure BDA0003397768530000091
ConjD
Figure BDA0003397768530000092
或
ConjE：
Figure BDA0003397768530000093
在其他实施方案中，可能优选的是缀合物选自式ConjA、ConjB、ConjC、ConjD以及ConjE的缀合物。
式I中的下标p为1至20的整数。因此，缀合物包含如下文所定义通过接头单元与至少一个药物单元共价连接的抗体(Ab)。下文更详细描述的配体单元为结合至靶标部分的靶向剂。因此，本公开还提供了用于治疗例如各种癌症和自身免疫疾病的方法。药物负载量由每个抗体的药物分子数目p表示。药物负载量可在每个抗体1至20个药物单元(DL)范围内。对于组合物，p表示组合物中缀合物的平均药物负载量，并且p在1至20范围内。
本公开的第二方面提供了一种制备根据本公开的第一方面的缀合物的方法，所述方法包括使式IL或IIL的化合物：
Figure BDA0003397768530000101
缀合至如下文所定义的抗体(Ab)，其中：
RL1为适合缀合至抗体(Ab)的接头；
R22L具有式IIIaL、式IIIbL或式IIIcL：
(a)
Figure BDA0003397768530000102
(b)
Figure BDA0003397768530000103
(c)
Figure BDA0003397768530000104
其中QL选自O-RL2、S-RL2以及NRN-RL2，并且RN选自H、甲基以及乙基
XL选自包含以下的组：O-RL2、S-RL2、CO2-RL2、CO-RL2、N＝C＝O-RL2、NHNH-RL2、CONHNH-RL2、
Figure BDA0003397768530000111
NRNRL，其中RN选自包含H和C1-4烷基的组；
RL2为适合缀合至抗体(Ab)的接头；
并且所有剩余基团如第一方面中所定义。
因此，在第二方面中可能优选的是，本公开提供了一种制备选自由ConjA、ConjB、ConjC、ConjD以及ConjE组成的组的缀合物的方法，所述方法包括使分别选自A：
Figure BDA0003397768530000112
B：
Figure BDA0003397768530000113
C：
Figure BDA0003397768530000114
D：
Figure BDA0003397768530000121
以及E：
Figure BDA0003397768530000122
的化合物与如下文所定义的抗体缀合。
WO 2011/130615公开了化合物26：
Figure BDA0003397768530000123
所述化合物为A的母体化合物。化合物A包含此具有用于连接至细胞结合剂的接头的PBD。细胞结合剂提供许多乙二醇部分以提供溶解性，溶解性在缀合物的合成中有用。
WO 2010/043380和WO 2011/130613公开了化合物30：
Figure BDA0003397768530000124
WO 2011/130613还公开了化合物51：
Figure BDA0003397768530000131
化合物B与化合物30的不同之处在于在PBD部分之间仅具有(CH2)3系链，而不是(CH2)5系链，这使所释放的PBD二聚体的亲脂性降低。连接基团在对位而不是间位连接至C2-苯基。
WO 2011/130613公开了化合物93：
Figure BDA0003397768530000132
化合物C在两个方面与此不同。细胞结合剂提供数量增加的乙二醇部分以提供在缀合物的合成中有用的溶解性，并且苯基取代基提供两个而不是一个氧原子，这也有助于溶解性。化合物C的结构也可能意味着它在小沟中的结合更强。
化合物A、B以及C在每个C环中都具有两个sp2中心，与每个C环中仅具有一个sp2中心的化合物相比，这可能允许在DNA小沟中更强的结合。
WO 2011/130598公开了化合物80：
Figure BDA0003397768530000133
化合物D与此不同之处在于包含用于连接至细胞结合剂的碘乙酰胺基团。此基团在结合至细胞结合剂时，在其稳定性方面可提供优于化合物80的优势(见下文)。化合物80中的马来酰亚胺基团可经历逆迈克尔反应(retro-Michael reaction)，从而变得从细胞结合剂去缀合(unconjugated)，并且因此容易被其他含硫醇的生物分子(诸如白蛋白和谷胱甘肽)清除。在化合物A情况下不会发生此类去缀合。此外，碘乙酰胺基团可避免其他不想要的副反应。
化合物E与先前公开的药物接头具有C2-3内双键的PBD二聚体的不同之处在于具有更小、亲脂性更低的C2取代基，例如4F-苯基、亚丙基。因此，化合物B的缀合物(见下文)在合成后不太可能聚集。此类缀合物聚集可通过尺寸排阻色谱法(SEC)来测量。
化合物D与E均在每个C环中具有两个sp2中心，与每个C环中仅具有一个sp2中心的化合物相比，这可能允许在DNA小沟中更强的结合。
WO 2010/043880、WO 2011/130613、WO 2011/130598以及WO2011/130616中公开的药物接头可用于本公开中，并且以引用的方式并入本文中。本文所描述的药物接头可如这些公开中所描述进行合成。
优选实施方案
一个优选实施方案为具有以下结构的缀合物：
Figure BDA0003397768530000141
其中抗体包含：(i)具有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域，以及(ii)具有SEQ IDNO:2的序列的VL结构域。
抗体可包含：(i)具有SEQ ID NO.3的序列的VH结构域，以及(ii)具有SEQ ID NO:4的序列的VL结构域。
附图说明
图1
要求保护的缀合物的体外细胞毒性
图2
TNBC MDA-MB-231异种移植模型中的体内功效研究
图3
SN12C肾癌异种移植模型中的体内功效研究
图4
卵巢癌PDX模型CTG-0703体内功效研究
图5
5A)卵巢癌PDX模型CTG-0252体内功效研究
5B)卵巢癌PDX模型CTG-1086体内功效研究
5C)卵巢癌PDX模型CTG-0711体内功效研究
5D)卵巢癌PDX模型CTG-1423体内功效研究
具体实施方式
本公开适合用于向受试者中的优选位点提供PBD化合物。缀合物允许释放不保留接头的任何部分的活性PBD化合物。不存在可能影响PBD化合物的反应性的残留(stub)。因此，ConjA将释放化合物RelA：
Figure BDA0003397768530000151
ConjB将释放化合物RelB：
Figure BDA0003397768530000161
ConjC将释放化合物RelC：
Figure BDA0003397768530000162
ConjD将释放化合物RelD：
Figure BDA0003397768530000163
ConjE将释放化合物RelE：
Figure BDA0003397768530000164
在本公开中，PBD二聚体与抗体之间的指定连接优选在细胞外为稳定的。在运输或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(ADC)优选为稳定的并且保持完整，即抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外为稳定的，并且可在细胞内部以某种有效速率裂解。有效接头将：(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即未裂解，直到缀合物已递送或运输至其靶位点；并且(iv)维持PBD药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞生长抑制作用。可通过诸如质谱法、HPLC以及分离/分析技术LC/MS等标准分析技术来测量ADC的稳定性。
在式ConjA、ConjB、ConjC、ConjD或ConjE的缀合物的所需活化位点通过酶(诸如组织蛋白酶)对连接基团并且特别是对缬氨酸-丙氨酸二肽部分的作用来实现式RelA、RelB、RelC、RelD或RelE的化合物的递送。
抗体
在一个方面中，抗体为结合至KAAG1的抗体。
抗体3A4
在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ IDNO:7的VH CDR3。在一些实施方案中，VH结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VH CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VH CDR3。在优选实施方案中，抗体包含具有根据SEQ IDNO:1的序列的VH结构域。
抗体还可包含VL结构域。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:10的VL CDR3。在一些实施方案中，VL结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:9的VL CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:9的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:10的VL CDR3。在优选实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的序列。
在优选实施方案中，抗体包含VH结构域和VL结构域。优选地，VH包含SEQ ID NO:1的序列并且VL结构域包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的序列。
一个或多个VH和VL结构域可配对以便形成结合KAAG1的抗体抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗体为包含与VL结构域配对的VH结构域的完整抗体，VH和VL结构域具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15配对的SEQ ID NO:1的序列。
在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:3的序列的重链，所述重链与具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链配对。在一些实施方案中，抗体为完整抗体，所述完整抗体包含两条具有SEQ ID NO:3的序列的重链，所述重链各自与具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链配对。
在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的重链，所述重链与具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链配对。在一些实施方案中，抗体为完整抗体，所述完整抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的重链，所述重链各自与具有SEQID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链配对。
在一个方面中，抗体为如下文所描述已进行修饰(或进一步修饰)的如本文所描述的抗体。在一些实施方案中，抗体为本文所公开的抗体的人源化、去免疫或表面重塑型式。
术语
术语“抗体”在本文中以广义使用并且具体来说涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、完整抗体(也描述为“全长”抗体)和抗体片段，只要它们展现所需生物活性，例如结合KAAG1的能力(Miller等(2003)Jour.ofImmunology 170:4854-4861)。抗体可为鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源于其他物种。抗体为由免疫系统产生的能够识别并且结合至特定抗原的蛋白质。(Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immuno Biology，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原通常具有由多个抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。每种特异性结合至不同表位的抗体具有不同结构。因此，一种抗原可具有超过一种对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合所关注的靶标的抗原的抗原结合位点的分子或其部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自体免疫疾病相关的自体免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD以及IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或亚类或同种异型(例如人G1m1、G1m2、G1m3、非G1m1[即不为G1m1的任何同种异型]、G1m17、G2m23、G3m21、G3m28、G3m11、G3m5、G3m13、G3m14、G3m10、G3m15、G3m16、G3m6、G3m24、G3m26、G3m27、A2m1、A2m2、Km1、Km2以及Km3)。免疫球蛋白可来源于任何物种，包括来源于人、鼠或兔。
如本文所用，“结合KAAG1”用于意指与非特异性配偶体(诸如牛血清白蛋白，BSA，Genbank登录号CAA76847，版本号CAA76847.1 GI:3336842，记录更新日期：2011年1月7日下午02:30)相比，抗体以更高亲和力结合KAAG1。在一些实施方案中，当在生理条件下测量时，抗体以比抗体对BSA的缔合常数高至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、105或106倍的缔合常数(Ka)结合CD25。本公开的抗体可以高亲和力结合KAAG1。举例来说，在一些实施方案中，抗体可以等于或小于约10-6M(诸如1×10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或10-14)的KD结合KAAG1。
KAAG1(肾脏相关抗原1)在睾丸和肾脏中表达，并且以较低水平在膀胱和肝脏中表达。它由高比例的各种组织学来源的肿瘤表达，包括黑素瘤、肉瘤以及结肠直肠癌。在一些实施方案中，KAAG1多肽对应于Genbank登录号AAF23613，版本号AAF23613.1。在一个实施方案中，编码KAAG1多肽的核酸对应于Genbank登录号AF181722，版本号AF181722.1。在一些实施方案中，KAAG1多肽具有SEQ ID NO:12的序列。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2以及scFv片段；双抗体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体、CDR(互补决定区)以及以上中的任一者的免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的个别抗体除可能以微小量存在的可能的天然存在的突变外为相同的。单克隆抗体为高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比之下，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定位。除它们的特异性之外，单克隆抗体为有利的，因为它们可为合成的，未由其他抗体污染。修饰词“单克隆”指示抗体的特征为获自基本上均质的抗体群体，并且不应被视为需要通过任何特定方法来制备抗体。举例来说，要根据本公开使用的单克隆抗体可通过由Kohler等(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法来制备，或可通过重组DNA方法(参见US4816567)来制备。还可使用Clackson等(1991)Nature，352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597中所描述的技术从噬菌体抗体文库分离或从携带完全人免疫球蛋白系统的转基因小鼠分离单克隆抗体(Lonberg(2008)Curr.Opinion 20(4):450-459)。
本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而其余一条或多条链与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现所需生物活性(US 4816567；以及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855)。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，灵长类化抗体包含来源于非人灵长类动物(例如旧大陆猴或猿)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列。
本文中的“完整抗体”为包含VL和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2以及CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应功能”，所述效应功能是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；以及下调细胞表面受体，诸如B细胞受体和BCR。
根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将完整抗体分配至不同“类别”。存在五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些主要类别中的若干可进一步分成“亚类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型为熟知的。
抗体的修饰
可对本文所公开的抗体进行修饰。举例来说，为使它们对人受试者的免疫原性更低。这可使用本领域技术人员熟悉的多种技术中的任一种来实现。下面更详细地描述了这些技术中的一些。
人源化
用于降低非人抗体或抗体片段的体内免疫原性的技术包括称为“人源化”的技术。
“人源化抗体”是指包含至少一部分的人抗体修饰可变区的多肽，其中可变区的一部分(优选为基本上小于完整人可变结构域的部分)已由来自非人物种的相应序列取代，并且其中修饰的可变区至少连接至另一蛋白质的另一部分，优选为人抗体的恒定区。表述“人源化抗体”包括其中一个或多个互补决定区(“CDR”)氨基酸残基和/或一个或多个框架区(“FW”或“FR”)氨基酸残基由来自啮齿动物或其他非人抗体中的类似位点的氨基酸残基取代的人抗体。表述“人源化抗体”还包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，所述免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR和基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。或者，从另一个角度来看，人源化抗体为还含有代替人序列的来自非人(例如鼠)抗体的所选序列的人抗体。人源化抗体可包括来自相同或不同物种的保守氨基酸取代或非天然残基，从而不会显著改变其结合和/或生物活性。此类抗体为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。
存在一系列人源化技术，包括‘CDR移植’、‘导向选择’、‘去免疫’、‘表面重塑’(也称为‘镶饰’)、‘复合抗体’、‘人字符串内容优化’以及框架重排。
CDR移植
在此技术中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自非人物种(供者抗体)(诸如小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔)的CDR的具有所需特性的残基置换(实际上，非人CDR被“移植”到人框架上)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应非人残基置换(在例如特定FR残基对抗原结合具有显著影响时这可能发生)。
此外，人源化抗体可包含既不存在于受者抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和最大化抗体性能。因此，通常，人源化抗体将包含至少一个(并且在一个方面中为两个)可变结构域的全部，其中所有或全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区为人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)或人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
导向选择
所述方法由以下组成：将对特定表位具特异性的给定非人抗体的VH或VL结构域与人VH或VL文库组合，以及针对所关注的抗原选择特定人V结构域。然后将此所选人VH与VL文库组合以产生完全人VH×VL组合。Nature Biotechnology(N.Y.)12，(1994)899-903中描述了所述方法。
复合抗体
在此方法中，将来自人抗体的两个或更多个氨基酸序列片段组合在最终抗体分子内。它们是通过将多个人VH和VL序列片段组合在一起而构建的，这限制或避开了最终复合抗体V区中的人T细胞表位。在需要时，通过将促成或编码T细胞表位的V区片段与避开T细胞表位的替代片段交换来限制或避开T细胞表位。US 2008/0206239 A1中描述了此方法。
去免疫
此方法涉及从治疗性抗体(或其他分子)的V区去除人(或其他第二物种)T细胞表位。通过例如与MHC结合基序的数据库(诸如www.wehi.edu.au上托管的“基序”数据库)比较来分析治疗性抗体V区序列中MHC II类结合基序的存在。或者，可使用计算机线程方法来鉴定MHC II类结合基序，诸如由Altuvia等设计的那些计算机线程方法(J.Mol.Biol.249244-250(1995))；在这些方法中，测试来自V区序列的连续重叠肽与MHC II类蛋白的结合能。然后可将此数据与关于涉及成功呈递的肽的其他序列特征(诸如两亲性、Rothbard基序以及组织蛋白酶B和其他加工酶的裂解位点)的信息组合。
在鉴定出潜在的第二物种(例如人)T细胞表位后，通过改变一个或多个氨基酸将其消除。修饰的氨基酸通常在T细胞表位本身内，但根据蛋白质的一级或二级结构也可能与表位相邻(并且因此，在一级结构中可能不相邻)。最通常通过取代进行改变，但在一些情况下，氨基酸添加或缺失将更合适。
所有改变都可通过重组DNA技术来完成，以便可通过使用完全确定的方法(诸如定点诱变)从重组宿主表达来制备最终分子。然而，使用蛋白质化学或任何其他分子改变手段也是可能的。
表面重塑
此方法涉及：
(a)通过构建非人抗体可变区的三维模型来确定非人(例如啮齿动物)抗体(或其片段)的可变区的构象结构；
(b)使用来自充足数目的非人和人抗体可变区重链和轻链的x-射线晶体学结构的相对可及性分布产生序列比对以给出一组重链和轻链框架位置，其中在98％的充足数目的非人抗体重链和轻链中比对位置为相同的；
(c)使用步骤(b)中产生的一组框架位置为要人源化的非人抗体鉴定一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基.
(d)从人抗体氨基酸序列鉴定与步骤(c)中鉴定的那组表面暴露的氨基酸残基最为接近的一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基，其中来自人抗体的重链和轻链为或不为天然配对的；
(e)在要人源化的非人抗体的氨基酸序列中，将步骤(c)中鉴定的那组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基用步骤(d)中鉴定的那组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基取代；
(f)构建由步骤(e)中指定的取代产生的非人抗体的可变区的三维模型；
(g)通过比较步骤(a)和(f)中构建的三维模型，从在步骤(c)或(d)中鉴定的组中鉴定在要人源化的非人类抗体的互补决定区的任何残基的任何原子5埃之内的任何氨基酸残基；
(h)将步骤(g)中鉴定的来自人的任何残基变为原始非人氨基酸残基，从而鉴定表面暴露的氨基酸残基的非人抗体人源化组；前提条件为不需要首先进行步骤(a)，但必须在步骤(g)之前进行。
超人源化
所述方法将非人序列与功能性人种系基因谱系进行比较。选择编码与非人序列相同或密切相关的规范结构的那些人基因。选择那些在CDR内具有最高同源性的所选人基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些人FR上。专利WO 2005/079479 A2中描述了此方法。
人字符串内容优化
此方法将非人(例如小鼠)序列与人种系基因的谱系进行比较，并且将差异评定为在潜在MHC/T细胞表位水平上定量序列的人字符串内容(HSC)。然后通过使其HSC最大化而不是使用整体同一性测量来使靶序列人源化以产生多种不同的人源化变体(在MolecularImmunology，44，(2007)1986–1998中有描述)。
框架重排
非人抗体的CDR在框内与涵盖所有已知重链和轻链人种系基因框架的cDNA库融合。然后通过例如淘选噬菌体展示抗体文库来选择人源化抗体。这在Methods 36，43-60(2005)中有描述。
定义
药学上可接受的阳离子
Berge等，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中讨论了药学上可接受的一价和二价阳离子的实例，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
药学上可接受的阳离子可为无机的或有机的。
药学上可接受的一价无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，诸如Na+和K+。药学上可接受的二价无机阳离子的实例包括但不限于碱土金属阳离子，诸如Ca2+和Mg2+。药学上可接受的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +))和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些适合的取代的铵离子的实例为源自于以下的那些取代的铵离子：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲胺、苯基苯甲胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见季铵离子的实例为N(CH3)4 +。
取代基
如本文所用的术语“任选取代的”是有关可为未取代或可为取代的母体基团。
除非另外说明，否则如本文所用的术语“取代的”是有关带有一个或多个取代基的母体基团。术语“取代基”在本文中以常规意义使用并且指共价连接或(如果适当)稠合至母体基团的化学部分。各种各样的取代基均为熟知的，并且它们的形成方法和引入各种母体基团的方法也为熟知的。
下文更详细地描述了取代基的实例。
C1-12烷基：如本文所用的术语“C1-12烷基”是有关通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子移除氢原子而获得的一价部分，所述一价部分可为脂族或脂环族，并且可为饱和的或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如本文所用的术语“C1-4烷基”是有关通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子移除氢原子而获得的一价部分，所述一价部分可为脂族或脂环族，并且可为饱和的或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下文讨论的烯基、炔基、环烷基等亚类。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)以及庚基(C7)。
饱和直链烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)以及正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)以及新戊基(C5)。
C2-12烯基：如本文所用的术语“C2-12烯基”是有关具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl)、-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基、-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)以及己烯基(C6)。
C2-12炔基：如本文所用的术语“C2-12炔基”是有关具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：如本文所用的术语“C3-12环烷基”是有关也是环基的烷基；即通过从环状烃(碳环)化合物的脂环族环原子移除氢原子而获得的一价部分，所述部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于源自于以下的那些环烷基：
饱和单环烃化合物：
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)以及甲基环己烷(C7)；
不饱和单环烃化合物：
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)以及甲基环己烯(C7)；以及
饱和多环烃化合物：
降蒈烷(C7)、降蒎烷(C7)、降莰烷(C7)。
C3-20杂环基：如本文所用的术语“C3-20杂环基”是有关通过从杂环化合物的环原子移除氢原子而获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个为环杂原子。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中1至4个为环杂原子。
在此情形中，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6等)表示环原子数目或环原子数目的范围，无论是碳原子还是杂原子。举例来说，如本文所用的术语“C5-6杂环基”是有关具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于源自于以下的那些单环杂环基：
N1：氮杂环丙烷(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异噁唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、氮杂
Figure BDA0003397768530000271
(C7)；
O1：环氧乙烷(C3)、氧杂环丁烷(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊烯(二氢呋喃)(C5)、氧杂环己烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂
Figure BDA0003397768530000281
(C7)；
S1：环硫乙烷(C3)、硫杂环丁烷(C4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(C5)、硫杂环己烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(C7)；
O2：二氧杂环戊烷(C5)、二噁烷(C6)以及二氧杂环庚烷(C7)；
O3：三噁烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二氮杂环戊烷(diazolidine))(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：氧硫杂环戊烷(C5)和氧硫杂环己烷(噻噁烷)(C6)；以及
N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括源自于环状形式的糖类的那些取代的单环杂环基，例如呋喃糖(C5)，诸如阿拉伯呋喃糖(arabinofuranose)、来苏呋喃糖(lyxofuranose)、呋喃核糖以及呋喃木糖；以及吡喃糖(C6)，诸如吡喃阿洛糖(allopyranose)、吡喃阿卓糖(altropyranose)、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃古洛糖(gulopyranose)、吡喃艾杜糖(idopyranose)、吡喃半乳糖以及吡喃太洛糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如本文所用的术语“C5-20芳基”是有关通过从芳族化合物的芳族环原子移除氢原子而获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子。如本文所用，术语“C5-7芳基”是有关通过从芳族化合物的芳族环原子移除氢原子而获得的一价部分，所述部分具有5至7个环原子，并且如本文所用，术语“C5-10芳基”，是有关通过从芳族化合物的芳族环原子移除氢原子而获得的一价部分，所述部分具有5至10个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在此情形中，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6、C5-10等)表示环原子数目或环原子数目的范围，无论是碳原子还是杂原子。举例来说，如本文所用的术语“C5-6芳基”是有关具有5或6个环原子的芳基。
环原子可全部为碳原子，如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括但不限于源自于以下的那些碳芳基：苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、并四苯(C18)以及芘(C16)。
包含稠环(其中至少一个为芳族环)的芳基的实例包括但不限于源自于以下的基团：二氢化茚(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(phenalene)(C13)、醋菲(acephenanthrene)(C15)以及醋蒽(aceanthrene)(C16)。
或者，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于源自于以下的那些单环杂芳基：
N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊烯)(C5)；
S1：噻吩(硫杂环戊二烯)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)；以及
N4：四唑(C5)。
包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：
C9(具有2个稠环)，源自于苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、吲哚嗪(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二氧杂环戊烯(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并三唑(N3)、苯并噻吩(benzothiofuran)(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
C10(具有2个稠环)，源自于色烯(O1)、异色烯(O1)、色满(O1)、异色满(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、萘啶(N2)、蝶啶(N4)；
C11(具有2个稠环)，源自于苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000301
(N2)；
C13(具有3个稠环)，源自于咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(perimidine)(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及C14(具有3个稠环)，源自于吖啶(N1)、呫吨(xanthene)(O1)、噻吨(thioxanthene)(S1)、氧杂蒽烯(O2)、吩噁噻(phenoxathiin)(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、邻二氮杂菲(N2)、吩嗪(N2)。
以上基团(单独或作为另一取代基的一部分)自身可任选用选自自身和以下所列的额外取代基的一个或多个基团进行取代。
卤基：-F、-Cl、-Br以及-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R为醚取代基，例如C1-7烷基(也称为C1-7烷氧基，下文讨论)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳氧基)，优选为C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R为烷基，例如C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)以及-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地为缩醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基，或者在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2与它们所连接的两个氧原子以及它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2以及-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1为半缩醛取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2如关于缩醛所定义，并且R为缩酮取代基而不是氢，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2以及-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1如关于半缩醛所定义，并且R为半缩酮取代基而不是氢，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。半缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)以及-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮基，-酮)：＝O。
硫酮(硫代酮)：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为氢或C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt以及＝NPh。
甲酰基(甲醛carbaldehyde/carboxaldehyde))：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R为酰基取代基，例如C1-7烷基(也称为C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环基酰基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳基酰基)，优选为C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)以及-C(＝O)Ph(苯甲酰基、苯酮)。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫醇羧基(硫醇羧酸)：-C(＝O)SH。
硫酮羧基(硫酮羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯(carboxylate/carboxylic acid ester)、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R为酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3以及-C(＝O)OPh。
酰氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R为酰氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph以及-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰基氧基：-OC(＝O)OR，其中R为酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3以及-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，例如氢、C1-7烷基(也称为C1-7烷基氨基或二-C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为H或C1-7烷基，或者在“环状”氨基的情况下，R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可为伯氨(-NH2)、仲氨(-NHR1)或叔氨(-NHR1R2)，并且在阳离子形式中可为季铵(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2以及-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮杂环丙烷基，氮杂环丁烷基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基以及硫代吗啉基。
酰胺基(氨基甲酰基、氨甲酰基、氨基羰基、甲酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基。酰胺基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3以及-C(＝O)N(CH2CH3)2以及R1和R2与它们连接的氮原子一起形成杂环结构的酰胺基，如在哌啶基羰基、吗啉基羰基、硫代吗啉基羰基以及哌嗪基羰基中。
硫代酰胺基(硫代氨甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基。酰胺基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2以及-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰胺基(酰基氨基)：-NR1C(＝O)R2，其中R1为酰胺取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为氢或C1-7烷基，并且R2为酰基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为氢或C1-7烷基。酰基酰胺基的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3以及-NHC(＝O)Ph。R1和R2可一起形成环状结构，如例如在琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基以及邻苯二甲酰亚胺基中。
Figure BDA0003397768530000331
氨基羰基氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基。氨基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2以及-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基，并且R1为脲基取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2以及-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳族环，
Figure BDA0003397768530000341
亚氨基：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe以及＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R为脒取代基，例如氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为H或C1-7烷基。脒基的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2以及-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈、甲腈)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
硫氰基(硫氰酰基)：-SCN。
异硫氰基(异硫氰酰基)：-NCS。
巯基(硫醇、氢硫基)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R为硫醚取代基，例如C1-7烷基(也称为C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R为二硫化物取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基(在本文中也称为C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
亚磺酰(Sulfine)(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R为亚磺酰取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。亚磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R为砜取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基，包括例如氟化或全氟化C1-7烷基。砜基的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲烷磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯基磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺酰基)、4-溴苯基磺酰基(溴苯磺酰基)、4-硝基苯基(硝苯磺酰基)、2-萘磺酸酯(萘磺酰基)以及5-二甲氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(亚磺酸的酯)：-S(＝O)OR；其中R为亚磺酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。亚磺酸酯基的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；亚磺酸甲酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；亚磺酸乙酯)。
磺酸酯(磺酸的酯)：-S(＝O)2OR，其中R为磺酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。磺酸酯基的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R为亚磺酰氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。亚磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R为磺酰氧基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R为硫酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰基(氨基磺酰基；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基。氨磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2以及-S(＝O)NHPh。
磺酰胺基(胺亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地为如关于氨基所定义的氨基取代基。磺酰胺基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2以及-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1为如关于氨基所定义的氨基取代基。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基：-NR1S(＝O)2R，其中R1为如关于氨基所定义的氨基取代基，并且R为磺酰氨基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1为如关于氨基所定义的氨基取代基，并且R为亚磺酰氨基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R为膦基取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2以及-P(Ph)2。
磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R为氧膦基取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2以及-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R为膦酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2以及-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R为磷酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2以及-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R为亚磷酸酯取代基，例如-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2以及-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为亚磷酰胺取代基，例如-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基的实例包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2以及-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为磷酰胺取代基，例如-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选为-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰胺基的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2以及-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烷基
C3-12亚烷基：如本文所用的术语“C3-12亚烷基”是关于通过从具有3至12个碳原子(除非另外指出)的烃化合物移除2个氢原子(从同一碳原子移除两个或从两个不同碳原子各移除一个)而获得的双齿物部分，所述双齿物部分可为脂族或脂环族，并且可为饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括下文所讨论的亚烯基、亚炔基、亚环烷基等亚类。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n为3至12的整数，例如-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)以及-CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-以及-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-以及-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-以及-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如亚环戊-1,3-基)和亚环己基(例如亚环己-1,4-基)。
脂环族部分不饱和C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-亚环戊烯-1,3-基)、亚环己烯基(例如2-亚环己烯-1,4-基；3-亚环己烯-1,2-基；2,5-亚环己二烯-1,4-基)。
氨基甲酸酯氮保护基团：术语“氨基甲酸酯氮保护基团”是关于掩蔽亚胺键中的氮的部分，并且这些部分为本领域中熟知的。这些基团具有以下结构：
Figure BDA0003397768530000391
其中R’10为如上文所定义的R。Greene，T.W.和Wuts，G.M.，Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1999在第503至549页描述了大量适合的基团，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
半氨基氮保护基团：术语“半氨基氮保护基团”是关于具有以下结构的基团：
Figure BDA0003397768530000392
其中R’10为如上文所定义的R。Greene，T.W.和Wuts，G.M.，Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1999在第633至647页将大量适合的基团描述为酰胺保护基团，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
氨基甲酸酯氮保护基团和半氨基氮保护基团可合称为“用于合成的氮保护基团”。
缀合物
本公开提供了一种包含经由接头单元连接至抗体的PBD化合物的缀合物。
在一个实施方案中，缀合物包含连接至间隔基连接基团的抗体、连接至触发物的间隔基、连接至自分解接头的触发物以及连接至PBD化合物的N10位置的自分解接头。以下说明此类缀合物：
Figure BDA0003397768530000401
其中Ab为如上文所定义的抗体并且PBD为如本文所描述的吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000402
化合物(D)。图示示出了在本公开的某些实施方案中对应于RL'、A、L1以及L2的部分。RL'可为RL1'或RL2'。D为移除了RL1'或RL2'的DL。
本公开适合用于向受试者中的优选位点提供PBD化合物。在优选实施方案中，缀合物允许释放不保留接头的任何部分的活性PBD化合物。不存在可能影响PBD化合物的反应性的残留(stub)。
接头通过一个或多个共价键将抗体连接至PBD药物部分D。“接头”为可用于将一个或多个药物部分(D)和抗体单元(Ab)连接以形成抗体-药物缀合物(ADC)的双功能或多功能部分。接头(RL')在细胞外部(即细胞外)可为稳定的，或它可因酶活性、水解或其他代谢条件而裂解。可方便地使用具有用于与药物部分以及与抗体结合的反应性官能团的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇或胺(例如N端或氨基酸侧链，例如赖氨酸)可与接头或间隔基试剂、PBD药物部分(D)或药物-接头试剂(DL，D-RL，其中RL可为RL1或RL2)的官能团形成键。
ADC的接头优选防止ADC分子聚集并且使ADC在水性介质中自由溶解并且保持单体状态。
ADC的接头优选在细胞外为稳定的。在运输或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(ADC)优选为稳定的并且保持完整，即抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外为稳定的，并且可在细胞内部以某种有效速率裂解。有效接头将：(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即未裂解，直到缀合物已递送或运输至其靶位点；并且(iv)维持PBD药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞生长抑制作用。可通过诸如质谱法、HPLC以及分离/分析技术LC/MS等标准分析技术来测量ADC的稳定性。
抗体和药物部分的共价连接要求接头具有两个反应性官能团，即反应意义上的二价。可用于连接两个或更多个功能或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原以及报告基团)的二价接头试剂为已知的，并且已描述了它们产生缀合物的方法(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，第234-242页)。
在另一实施方案中，接头可用调节聚集、溶解度或反应性的基团取代。举例来说，根据用于制备ADC的合成途径，磺酸酯取代基可增加试剂的水溶性并且促进接头试剂与抗体或药物部分的偶联反应，或促进Ab-L与DL或DL-L与Ab的偶联反应。
在一个实施方案中，L-RL’为以下基团：
Figure BDA0003397768530000411
其中星号表示与药物单元(D)的连接点，Ab为抗体(L)，L1为接头，A为将L1连接至抗体的连接基团，L2为共价键或与-OC(＝O)-一起形成自分解接头，并且L1或L2为可裂解接头。
L1优选为可裂解接头，并且可称为用于活化接头以便裂解的触发物。
L1和L2(在存在时)的性质可有很大差异。根据裂解特征来选择这些基团，这可由缀合物被递送到的位点的条件决定。通过酶的作用裂解的那些接头为优选的，不过也可使用因pH值(例如酸或碱不稳定)、温度或辐射时(例如光不稳定)的变化而可裂解的接头。在还原或氧化条件下可裂解的接头也可用于本公开中。
L1可包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可为酶裂解的靶底物，从而允许L-RL'从N10位置释放。
在一个实施方案中，L1为通过酶的作用可裂解的。在一个实施方案中，酶为酯酶或肽酶。
在一个实施方案中，L2存在并且与-C(＝O)O-一起形成自分解接头。在一个实施方案中，L2为酶活性的底物，从而允许L-RL'从N10位置释放。
在一个实施方案中，当L1通过酶的作用可裂解并且存在L2时，酶将L1与L2之间的键裂解。
L1和L2(如果存在)可由选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，以及
-NHC(＝O)NH-。
与L2连接的L1的氨基可为氨基酸的N端或可源自于氨基酸侧链(例如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基。
与L2连接的L1的羧基可为氨基酸的C端或可源自于氨基酸侧链(例如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基。
与L2连接的L1的羟基可源自于氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基。
术语“氨基酸侧链”包括存在于以下中的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，诸如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸；(ii)微量氨基酸，诸如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成类似物和衍生物；以及(iv)它们的所有对映异构体、非对映异构体、同分异构富集形式、同位素标记(例如2H、3H、14C、15N)形式、受保护形式以及外消旋混合物。
在一个实施方案中，-C(＝O)O-和L2一起形成以下基团：
Figure BDA0003397768530000431
其中星号表示与N10位置的连接点，波浪线表示与接头L1的连接点，Y为-N(H)-、-O-、-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O，并且n为0至3。亚苯基环任选用一个、两个或三个如本文所描述的取代基取代。在一个实施方案中，亚苯基任选用卤基、NO2、R或OR取代。
在一个实施方案中，Y为NH。
在一个实施方案中，n为0或1。优选地，n为0。
当Y为NH并且n为0时，自分解接头可称为对氨基苯甲基羰基接头(PABC)。
当远程位点被活化时，自分解接头将允许释放受保护的化合物，按照以下所示的路线进行(对于n＝0)：
Figure BDA0003397768530000441
其中L*为接头的其余部分的活化形式。这些基团的优势为将活化位点与受保护的化合物分开。如上文所描述，亚苯基可为任选取代的。
在本文所描述的一个实施方案中，基团L*为如本文所描述的接头L1，它可包括二肽基团。
在另一实施方案中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下的基团：
Figure BDA0003397768530000442
其中星号、波浪线、Y以及n如上文所定义。每个亚苯基环任选用一个、两个或三个如本文所描述的取代基取代。在一个实施方案中，具有Y取代基的亚苯基环为任选取代的，并且不具有Y取代基的亚苯基环为未取代的。在一个实施方案中，具有Y取代基的亚苯基环为未取代的，并且不具有Y取代基的亚苯基环为任选取代的。
在另一实施方案中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下的基团：
Figure BDA0003397768530000443
其中星号、波浪线、Y以及n如上文所定义，E为O、S或NR，D为N、CH或CR，并且F为N、CH或CR。
在一个实施方案中，D为N。
在一个实施方案中，D为CH。
在一个实施方案中，E为O或S。
在一个实施方案中，F为CH。
在一个优选实施方案中，接头为组织蛋白酶不稳定接头。
在一个实施方案中，L1包含二肽。二肽可表示为-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-和-CO-分别表示氨基酸基团X1和X2的N端和C端。二肽中的氨基酸可为天然氨基酸的任何组合。在接头为组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽可为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
此外，对于那些具有羧基或氨基侧链官能团的氨基酸基团，分别例如Glu和Lys，CO和NH可代表侧链官能团。
在一个实施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，
-Trp-Cit-
其中Cit为瓜氨酸。
优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-。
最优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可使用其他二肽组合，包括由Dubowchik等，Bioconjugate Chemistry，2002，13,855-869描述的那些二肽组合，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链为衍生的。举例来说，氨基酸侧链的氨基或羧基可为衍生的。在一个实施方案中，侧链氨基酸(诸如赖氨酸)的氨基NH2为选自由NHR和NRR'组成的组的衍生形式。
在一个实施方案中，侧链氨基酸(诸如天冬氨酸)的羧基COOH为选自由COOR、CONH2、CONHR以及CONRR'组成的组的衍生形式。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链受到化学保护。侧链保护基团可为如下文关于基团RL所讨论的基团。本发明人已确定受保护的氨基酸序列可由酶裂解。举例来说，已确定包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可由组织蛋白酶裂解。
氨基酸的侧链的保护基团为本领域中熟知的，并且在Novabiochem目录中有描述。Protective Groups in Organic Synthesis，Greene和Wuts中列出了额外的保护基团策略。
对于具有反应性侧链官能团的那些氨基酸，可能的侧链保护基团如下所示：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br。
在一个实施方案中，将侧链保护选择为与作为封端基团(如果存在)或作为封端基团的一部分提供的基团正交。因此，移除侧链保护基团不会移除封端基团或作为封端基团的一部分的任何保护基团官能团。
在本公开的其他实施方案中，所选的氨基酸为不具有反应性侧链官能团的那些氨基酸。举例来说，所述氨基酸可选自：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro以及Val。
在一个实施方案中，将二肽与自分解接头组合使用。自分解接头可连接至-X2-。
在存在自分解接头的情况下，-X2-直接连接至自分解接头。优选地，基团-X2-CO-连接至Y，其中Y为NH，从而形成基团-X2-CO-NH-。
-NH-X1-直接连接至A。A可包含官能团-CO-，从而与-X1-形成酰胺键。
在一个实施方案中，L1和L2与-OC(＝O)-一起构成基团NH-X1-X2-CO-PABC-。PABC基团直接连接至N10位置。优选地，自分解接头和二肽一起形成以下所示的基团-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-：
Figure BDA0003397768530000481
其中星号表示与N10位置的连接点，并且波浪线表示与接头L1的其余部分的连接点或与A的连接点。优选地，波浪线表示与A的连接点。Lys氨基酸的侧链可例如用如上文所描述的Boc、Fmoc或Alloc保护。
或者，自分解接头和二肽一起形成以下所示的基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-：
Figure BDA0003397768530000482
其中星号和波浪线如上文所定义。
优选地，自分解接头和二肽一起形成以下所示的基团-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-：
Figure BDA0003397768530000483
其中星号和波浪线如上文所定义。
在一个实施方案中，A为共价键。因此，L1与抗体为直接连接的。举例来说，在L1包含连续氨基酸序列的情况下，序列的N端可直接连接至抗体。
因此，在A为共价键的情况下，抗体与L1之间的连接可选自：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH-，
-C(＝O)NHC(＝O)-，
-S-，
-S-S-，
-CH2C(＝O)-，以及
＝N-NH-。
与抗体连接的L1的氨基可为氨基酸的N端或可源自于氨基酸侧链(例如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基。
与抗体连接的L1的羧基可为氨基酸的C端或可源自于氨基酸侧链(例如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基。
与抗体连接的L1的羟基可源自于氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基。
与抗体连接的L1的硫醇基可源自于氨基酸侧链(例如丝氨酸氨基酸侧链)的硫醇基。
以上关于L1的氨基、羧基、羟基以及硫醇基的解释也适用于抗体。
在一个实施方案中，L2与-OC(＝O)-一起表示：
Figure BDA0003397768530000491
其中星号表示与N10位置的连接点，波浪线表示与L1的连接点，n为0至3，Y为共价键或官能团，并且E为例如通过酶作用或光可活化从而产生自分解单元的基团。亚苯基环任选进一步用一个、两个或三个如本文所描述的取代基取代。在一个实施方案中，亚苯基任选进一步用卤基、NO2、R或OR取代。优选地，n为0或1，最优选为0。
对E进行选择，使得基团易于例如通过光或通过酶的作用活化。E可为-NO2或葡萄糖醛酸。前者可能对硝基还原酶的作用敏感，后者对β葡萄糖醛酸酶的作用敏感。
在此实施方案中，当E被活化时，自分解接头将允许释放受保护的化合物，按照以下所示的路线进行(对于n＝0)：
Figure BDA0003397768530000501
其中星号表示与N10位置的连接点，E*为E的活化形式，并且Y如上文所描述。这些基团的优势为将活化位点与受保护的化合物分开。如上文所描述，亚苯基可为任选进一步取代的。
基团Y可为连至L1的共价键。
基团Y可为选自以下的官能团：
-C(＝O)-
-NH-
-O-
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH，
-C(＝O)NHC(＝O)-，以及
-S-。
当L1为二肽时，Y优选为-NH-或-C(＝O)-，从而在L1与Y之间形成酰胺键。在此实施方案中，二肽序列不需要为酶活性的底物。
在另一实施方案中，A为间隔基团。因此，L1与抗体为间接连接的。
L1与A可由选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，以及
-NHC(＝O)NH-。
在一个实施方案中，基团A为：
Figure BDA0003397768530000511
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与抗体的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A为：
Figure BDA0003397768530000521
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与抗体的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A为：
Figure BDA0003397768530000522
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与抗体的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，并且最优选为4或8。在另一实施方案中，m为10至30，并且优选为20至30。或者，m为0至50。在此实施方案中，m优选为10-40并且n为1。
在一个实施方案中，基团A为：
Figure BDA0003397768530000523
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与抗体的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，并且最优选为4或8。在另一实施方案中，m为10至30，并且优选为20至30。或者，m为0至50。在此实施方案中，m优选为10-40并且n为1。
在一个实施方案中，抗体与A之间的连接是通过抗体的硫醇残基和A的马来酰亚胺基团实现的。
在一个实施方案中，抗体与A之间的连接为：
Figure BDA0003397768530000531
其中星号表示与A的其余部分的连接点，并且波浪线表示与抗体的其余部分的连接点。在此实施方案中，S原子通常源自于抗体。
在上述每个实施方案中，可使用替代官能团代替以下所示的马来酰亚胺衍生的基团：
Figure BDA0003397768530000532
其中波浪线表示与之前抗体的连接点，并且星号表示连至A基团的其余部分的键。
在一个实施方案中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团代替：
Figure BDA0003397768530000533
其中波浪线表示与抗体的连接点，并且星号表示连至A基团的其余部分的键。
在一个实施方案中，马来酰亚胺衍生的基团用选自以下的基团(任选与抗体一起)代替：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH，
-C(＝O)NHC(＝O)-，
-S-，
-S-S-，
-CH2C(＝O)-
-C(＝O)CH2-，
＝N-NH-，以及
-NH-N＝。
在一个实施方案中，马来酰亚胺衍生的基团用选自以下的基团(任选与抗体一起)代替：
Figure BDA0003397768530000541
其中波浪线表示与抗体的连接点或连至A基团的其余部分的键，并且星号表示与抗体的连接点或连至A基团的其余部分的键中的另一者。
WO 2005/082023中描述了适合将L1连接至抗体的其他基团。
在一个实施方案中，存在连接基团A，存在触发物L1并且不存在自分解接头L2。因此，L1与药物单元经由键直接连接。同样地，在此实施方案中，L2为键。当DL具有式II时，这可能特别适当。
L1与D可由选自以下的键连接：
-C(＝O)N<，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)N<，以及
-NHC(＝O)N<，
其中N<或O-为D的一部分。
在一个实施方案中，L1与D优选由选自以下的键连接：
-C(＝O)N<，以及
-NHC(＝O)-。
在一个实施方案中，L1包含二肽并且二肽的一端与D连接。如上文所描述，二肽中的氨基酸可为天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。在接头为组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽可为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。那么，二肽为组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，以及
-Trp-Cit-；
其中Cit为瓜氨酸。在此类二肽中，-NH-为X1的氨基，并且CO为X2的羰基。
优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，以及
-Val-Cit-。
最优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
所关注的其他二肽组合包括：
-Gly-Gly-，
-Pro-Pro-，以及
-Val-Glu-。
可使用其他二肽组合，包括上文描述的那些二肽组合。
在一个实施方案中，L1-D为：
Figure BDA0003397768530000561
-NH-X1-X2-CO-N<*
其中-NH-X1-X2-CO为二肽，-N<为药物单元的一部分，星号表示与药物单元的其余部分的连接点，并且波浪线表示与L1的其余部分的连接点或与A的连接点。优选地，波浪线表示与A的连接点。
在一个实施方案中，二肽为缬氨酸-丙氨酸并且L1-D为：
Figure BDA0003397768530000562
其中星号、-N<以及波浪线如上文所定义。
在一个实施方案中，二肽为苯丙氨酸-赖氨酸并且L1-D为：
Figure BDA0003397768530000571
其中星号、-N<以及波浪线如上文所定义。
在一个实施方案中，二肽为缬氨酸-瓜氨酸。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000572
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000573
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000574
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000581
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至7，优选为3至7，最优选为3或7。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000582
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000583
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000584
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000591
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000592
其中星号表示与L2或D的连接点，S为配体单元的硫基团，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A-L1为：
Figure BDA0003397768530000593
其中星号表示与L2或D的连接点，S为配体单元的硫基团，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000594
其中星号表示与L2或D的连接点，S为配体单元的硫基团，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000601
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至7，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000602
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000603
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，并且n为0至6。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000604
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
在一个实施方案中，基团A1-L1为：
Figure BDA0003397768530000611
其中星号表示与L2或D的连接点，波浪线表示与配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，并且m为0至30。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。
基团RL'可从基团RL衍生。可通过将抗体连接至RL的官能团来将基团RL转化为基团RL’。可采取其他步骤来将RL转换为RL'。这些步骤可包括移除保护基团(存在时)，或安装适当的官能团。
RL
接头可包括包含一个或多个氨基酸单元的蛋白酶可裂解肽部分。肽接头试剂可在自动合成仪(诸如Rainin Symphony肽合成仪(Protein Technologies，Inc.，Tucson，AZ)或Model 433(Applied Biosystems，Foster City，CA))上，通过肽化学领域中熟知的固相或液相合成方法来制备(E.
Figure BDA0003397768530000612
和K.Lübke，The Peptides，第1卷，第76-136页(1965)Academic Press)，包括t-BOC化学(Geiser等"Automation of solid-phase peptidesynthesis"，Macromolecular Sequencing and Synthesis，Alan R.Liss，Inc.，1988，第199-218页)和Fmoc/HBTU化学(Fields，G.和Noble，R.(1990)"Solid phase peptidesynthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids"，Int.J.PeptideProtein Res.35:161-214)。
示例性氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸以及微量氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可设计氨基酸接头组分并且在其由特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶)进行酶裂解的选择性方面进行优化。
氨基酸侧链包括天然存在的氨基酸以及微量氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸侧链包括氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苯甲基、对羟基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基以及以下结构：
Figure BDA0003397768530000621
当氨基酸侧链除氢(甘氨酸)外包括其他时，氨基酸侧链所连接的碳原子为手性的。氨基酸侧链所连接的每个碳原子独立地呈(S)或(R)构型，或呈外消旋混合物形式。因此，药物-接头试剂可为对映异构体纯的、外消旋的或非对映异构体的。
在示例性实施方案中，氨基酸侧链选自天然和非天然氨基酸的侧链，包括丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯乙酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸，α,α-二甲基γ-氨基丁酸、β,β-二甲基γ-氨基丁酸、鸟氨酸以及瓜氨酸(Cit)。
具有对氨基苯甲基氨基甲酰基(PAB)自分解间隔基的可用于构建用于缀合至抗体的接头-PBD药物部分中间体的示例性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有以下结构：
Figure BDA0003397768530000631
其中Q为C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；并且m为0-4范围内的整数。
具有对氨基苯甲基的示例性phe-lys(Mtr)二肽接试剂可根据Dubowchik等(1997)Tetrahedron Letters，38:5257-60制备，并且具有以下结构：
Figure BDA0003397768530000632
其中Mtr为单4-甲氧基三苯甲基，Q为C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；并且m为0-4范围内的整数。
“自分解接头”PAB(对氨基苯甲基氧基羰基)将药物部分连接至抗体药物缀合物中的抗体(Carl等(1981)J.Med.Chem.24:479-480；Chakravarty等(1983)J.Med.Chem.26:638-644；US 6214345；US20030130189；US20030096743；US6759509；US20040052793；US6218519；US6835807；US6268488；US20040018194；WO98/13059；US20040052793；US6677435；US5621002；US20040121940；WO2004/032828)。除PAB外的自分解间隔基的其他实例包括但不限于：(i)在电子方面类似于PAB基团的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)、噻唑(US 7375078)、多个延长的PAB单元(de Groot等(2001)J.Org.Chem.66:8815-8830)；以及邻氨基苯甲基缩醛或对氨基苯甲基缩醛；以及(ii)同系化的苯乙烯基PAB类似物(US 7223837)。可使用在酰胺键水解后经历环化的间隔基，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等(1995)ChemistryBiology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消除在甘氨酸处取代的含胺药物(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是可用于ADC中的自分解间隔基的实例。
在一个实施方案中，缬氨酸-瓜氨酸二肽PAB类似物试剂具有2,6二甲基苯基并且具有以下结构：
Figure BDA0003397768530000641
可用于本公开的抗体药物缀合物的接头试剂包括但不限于：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，以及双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-双马来酰亚胺二乙二醇(BM(PEO)2)以及1,11-双马来酰亚胺三乙二醇(BM(PEO)3)，它们可从PierceBiotechnology，Inc.、ThermoScientific，Rockford，IL以及其他试剂供应商商购获得。双马来酰亚胺试剂允许抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基以依序或同时方式连接至含硫醇的药物部分、标记物或接头中间体。除马来酰亚胺外与抗体的硫醇基、PBD药物部分或接头中间体具有反应性的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯以及异硫氰酸酯。
Figure BDA0003397768530000651
接头试剂的其他实施方案为：N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP，Carlsson等(1978)Biochem.J.173:723-737)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺化物盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。可用的接头试剂还可经由其他商业来源(诸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO))获得，或根据Toki等(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO 03/043583；以及WO 04/032828中所描述的程序合成。
接头可为用于通过分支的多功能接头部分将超过一个药物部分共价连接至抗体的树枝型接头(US 2006/116422；US 2005/271615；de Groot等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494；Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499；Shamis等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731；Sun等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King等(2002)Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。树枝状接头可增加药物与抗体的摩尔比，即负载量，这与ADC的效力有关。因此，在抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基的情况下，可通过树枝状或分支接头来连接多个药物部分。
树枝型接头的一个示例性实施方案具有以下结构：
Figure BDA0003397768530000661
其中星号表示与PBD部分的N10位置的连接点。
Rc，封端基团
本公开的第一方面的缀合物可在N10位置具有封端基团RC。化合物E可具有封端基团RC。
在一个实施方案中，在缀合物为每个单体具有式(A)的二聚体的情况下，单体单元中的一者中的基团R10为封端基团RC或为基团R10。
在一个实施方案中，在缀合物为每个单体具有式(A)的二聚体的情况下，单体单元中的一者中的基团R10为封端基团RC。
在一个实施方案中，在化合物E为每个单体具有式(E)的二聚体的情况下，单体单元中的一者中的基团RL为封端基团RC或为用于连接至抗体的接头。
在一个实施方案中，在化合物E为每个单体具有式(E)的二聚体的情况下，单体单元中的一者中的基团RL为封端基团RC。
基团RC可从PBD部分的N10位置移除，从而留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，在QR11为OSO3M的情况下，留下亚硫酸氢盐加合物、硫代甲醇胺、取代的硫代甲醇胺或取代的氨基甲胺(carbinalamine)。
在一个实施方案中，RC可为保护基团，所述保护基团可移除，从而留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，或者在QR11为OSO3M的情况下留下二硫化物加合物。在一个实施方案中，RC为可移除从而留下N10-C11亚胺键的保护基团。
基团Rc旨在为在与移除基团R10所需的条件相同的条件下可移除的，例如产生N10-C11亚胺键、甲醇胺等。封端基团充当预期在N10位置的官能团的保护基团。封端基团旨在对抗体不具反应性。举例来说，RC与RL不同。
在具有亚胺单体的二聚体的合成中可将具有封端基团的化合物用作中间体。或者，可将具有封端基团的化合物用作缀合物，其中在目标位置封端基团被移除以产生亚胺、甲醇胺、取代的甲醇胺等。因此，在此实施方案中，封端基团可指如在本发明人的早期申请WO 00/12507中所定义的治疗上可移除的氮保护基团。
在一个实施方案中，基团RC在裂解基团R10的接头RL的条件下为可移除的。因此，在一个实施方案中，封端基团可通过酶的作用裂解。
在一个替代实施方案中，封端基团在接头RL连接至抗体之前为可移除的。在此实施方案中，封端基团在不裂解接头RL的条件下为可移除的。
当化合物包括官能团G1以形成与抗体的连接时，封端基团在添加或暴露G1之前为可移除的。
可将封端基团用作保护基团策略的一部分，以确保二聚体中仅一个单体单元连接至抗体。
可将封端基团用作N10-C11亚胺键的掩蔽物。在诸如化合物中需要亚胺官能团时可移除封端基团。封端基团还是如上文所描述的甲醇胺、取代的甲醇胺以及亚硫酸氢盐加合物的掩蔽物。
RC可为N10保护基团，诸如本发明人的早期申请WO 00/12507中描述的那些基团。在一个实施方案中，RC为如本发明人的早期申请WO 00/12507中所定义的治疗上可移除的氮保护基团。
在一个实施方案中，RC为氨基甲酸酯保护基团。
在一个实施方案中，氨基甲酸酯保护基团选自：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
任选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在一个实施方案中，RC为缺乏用于连接至抗体的官能团的接头基团RL。
本申请特别考虑了那些是氨基甲酸酯的RC基团。
在一个实施方案中，RC为以下基团：
Figure BDA0003397768530000681
其中星号表示与N10位置的连接点，G2为末端基团，L3为共价键或可裂解接头L1，L2为共价键或与OC(＝O)一起形成自分解接头。
当L3与L2均为共价键时，G2与OC(＝O)一起形成如上文所定义的氨基甲酸酯保护基团。
L1如上文关于R10所定义。
L2如上文关于R10所定义。
下文描述了各种末端基团，包括基于熟知的保护基团的那些末端基团。
在一个实施方案中，L3为可裂解接头L1，并且L2与OC(＝O)一起形成自分解接头。在此实施方案中，G2为Ac(乙酰基)或Moc，或选自以下的氨基甲酸酯保护基团：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
任选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在另一个实施方案中，G2为酰基-C(＝O)G3，其中G3选自烷基(包括环烷基、烯基以及炔基)、杂烷基、杂环基以及芳基(包括杂芳基和碳芳基)。这些基团可为任选取代的。酰基与L3或L2(在适当时)的氨基一起可形成酰胺键。酰基与L3或L2(在适当时)的羟基一起可形成酯键。
在一个实施方案中，G3为杂烷基。杂烷基可包含聚乙二醇。杂烷基可具有与酰基相邻的杂原子，诸如O或N，从而在适当时与存在于基团L3或L2中(在适当时)的杂原子一起形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团。
在一个实施方案中，G3选自NH2、NHR以及NRR'。优选地，G3为NRR'。
在一个实施方案中，G2为以下基团：
Figure BDA0003397768530000691
其中星号表示与L3的连接点，n为0至6，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2以及卤基。基团OH、SH、NH2以及NHR受到保护。在一个实施方案中，n为1至6，并且优选地n为5。在一个实施方案中，G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'以及NRR'。在一个实施方案中，G4为OR、SR以及NRR'。优选地，G4选自OR和NRR'，最优选地，G4为OR。最优选地，G4为OMe。
在一个实施方案中，基团G2为：
Figure BDA0003397768530000692
其中星号表示与L3的连接点，并且n和G4如上文所定义。
在一个实施方案中，基团G2为：
Figure BDA0003397768530000701
其中星号表示与L3的连接点，n为0或1，m为0至50，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2以及卤基。在一个优选实施方案中，n为1并且m为0至10、1至2，优选为4至8，并且最优选为4或8。在另一实施方案中，n为1并且m为10至50，优选为20至40。基团OH、SH、NH2以及NHR受到保护。在一个实施方案中，G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'以及NRR'。在一个实施方案中，G4为OR、SR以及NRR'。优选地，G4选自OR和NRR'，最优选地，G4为OR。优选地，G4为OMe。
在一个实施方案中，基团G2为：
Figure BDA0003397768530000702
其中星号表示与L3的连接点，并且n、m以及G4如上文所定义。
在一个实施方案中，基团G2为：
Figure BDA0003397768530000703
其中n为1-20，m为0-6，并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'、NH2、NHR、NRR'、NO2以及卤基。在一个实施方案中，n为1-10。在另一实施方案中，n为10至50，优选为20至40。在一个实施方案中，n为1。在一个实施方案中，m为1。基团OH、SH、NH2以及NHR受到保护。在一个实施方案中，G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR'以及NRR'。在一个实施方案中，G4为OR、SR以及NRR'。优选地，G4选自OR和NRR'，最优选地，G4为OR。优选地，G4为OMe。
在一个实施方案中，基团G2为：
Figure BDA0003397768530000711
其中星号表示与L3的连接点，并且n、m以及G4如上文所定义。
在上述每个实施方案中，G4可为OH、SH、NH2以及NHR。这些基团优选受到保护。
在一个实施方案中，OH用Bzl、TBDMS或TBDPS保护。
在一个实施方案中，SH用Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保护。
在一个实施方案中，NH2或NHR用Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z或Alloc保护。
在一个实施方案中，基团G2与基团L3组合存在，所述基团为二肽。
封端基团不旨在用于连接至抗体。因此，二聚体中存在的另一单体充当经由接头连接至抗体的点。因此，封端基团中存在的官能团优选不可用于与抗体反应。因此，优选避免使用反应性官能团，诸如OH、SH、NH2、COOH。然而，如上文所描述，如果受到保护，那么此类官能团可存在于封端基团中。
实施方案
本公开的实施方案包括ConjA，其中抗体如上文所定义。
本公开的实施方案包括ConjB，其中抗体如上文所定义。
本公开的实施方案包括ConjC，其中抗体如上文所定义。
本公开的实施方案包括ConjD，其中抗体如上文所定义。
本公开的实施方案包括ConjE，其中抗体如上文所定义。
如上文所提到，本公开的一些实施方案排除ConjA、ConjB、ConjC、ConjD以及ConjE。
药物负载量
药物负载量为每个抗体(例如抗体)的PBD药物的平均数目。在本公开的化合物结合至半胱氨酸的情况下，药物负载量可在每个抗体1至8个药物(DL)范围内，即其中1、2、3、4、5、6、7以及8个药物部分共价连接至抗体。缀合物的组合物包括与1至8个的一系列药物缀合的抗体的集合。在本公开的化合物结合至赖氨酸的情况下，药物负载量可在每个抗体1至80个药物(DL)范围内，不过上限为40、20、10或8个可为优选的。缀合物的组合物包括与1至80、1至40、1至20、1至10或1至8个的一系列药物缀合的抗体的集合。
可通过常规手段(诸如UV、反向HPLC、HIC、质谱法、ELISA分析以及电泳)来表征在来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体的平均药物数目。还可确定以p表示的ADC数量分布。通过ELISA，可确定在特定ADC制剂中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，p(药物)值的分布因抗体-抗原结合和ELISA的检测限而不可识别。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA分析不能确定药物部分在什么位置连接至抗体，诸如重链或轻链片段或特定氨基酸残基。在一些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现均相ADC(其中p为来自具有其他药物负载量的ADC的特定值)的分离、纯化以及表征。此类技术也适用于其他类型的缀合物。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受到抗体上连接位点的数目的限制。举例来说，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个充足反应性硫醇基，通过所述硫醇基可连接至接头。较高药物负载量(例如p>5)可能引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶、毒性或丧失细胞渗透性。
通常，少于理论最大值的药物部分在缀合反应期间与抗体缀合。抗体可含有例如许多不与药物-接头中间体(D-L)或接头试剂反应的赖氨酸残基。仅最具反应性的赖氨酸基团才可与胺反应性接头试剂反应。此外，仅最具反应性的半胱氨酸硫醇基才可与硫醇反应性接头试剂反应。通常，抗体不含许多(若有)可连接至药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在，并且必须在部分或完全还原条件下用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP)还原。可以若干不同方式控制ADC的负载量(药物/抗体比)，包括：(i)限制药物-接头中间体(D-L)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。对于与接头试剂缀合，通过用诸如DTT(二硫苏糖醇)等还原剂处理可使抗体变得具反应性。因此，理论上每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂(Traut’s reagent))反应使得胺转化为硫醇来将额外的亲核基团引入抗体。可通过对1、2、3、4或更多个半胱氨酸残基进行工程化(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的突变抗体)将反应性硫醇基引入抗体(或其片段)。US 7521541教示了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来对抗体进行工程化。
可在抗体中并且不形成链内或分子间二硫键的反应位点处对半胱氨酸残基进行工程化(Junutula等，2008b Nature Biotech.，26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。工程化的半胱氨酸硫醇可与具有硫醇反应性、亲电基团(诸如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的本公开的接头试剂或药物-接头试剂反应以形成具有半胱氨酸工程化抗体和PBD药物部分的ADC。因此，可设计、控制并且知道药物部分的位置。由于工程化的半胱氨酸硫醇基通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或药物-接头试剂反应，所以可以控制药物负载量。通过在重链或轻链上的单个位点进行取代以引入半胱氨酸对IgG抗体进行工程化从而产生对称抗体上的两个新半胱氨酸。在缀合产物ADC的接近同质性的情况下，可实现接近2的药物负载量。
或者，如Axup等((2012)，Proc Natl Acad Sci U S A.109(40):16101-16116)所描述，可通过对抗体进行工程化以在其重链和/或轻链中含有非天然氨基酸来实现位点特异性缀合。非天然氨基酸提供了额外的优势，即可设计正交化学以连接接头试剂和药物。
在抗体的超过一个亲核或亲电基团与药物-接头中间体或接头试剂随后与药物试剂反应的情况下，那么所得产物为ADC化合物的混合物，其中连接至抗体的药物部分的分布为例如1、2、3个等。液相色谱法(诸如聚合物反相(PLRP)和疏水相互作用(HIC))可根据药物负载值分离混合物中的化合物。可分离具有单一药物负载值(p)的ADC制剂，然而，这些单一负载值ADC仍可能为异质混合物，因为药物部分可经由接头连接至抗体上的不同位点。
因此，本公开的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个PBD药物部分，并且其中药物部分可在不同氨基酸残基处连接至抗体。
在一个实施方案中，每个抗体的二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000741
基团的平均数目在1至20范围内。在一些实施方案中，所述范围选自1至8、2至8、2至6、2至4以及4至8。
在一些实施方案中，每个抗体有一个二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003397768530000742
基团。
包括其他形式
除非另外规定，否则在上文中包括这些取代基的熟知的离子、盐、溶剂合物以及受保护形式。举例来说，提到羧酸(-COOH)还包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂合物以及常规受保护形式。类似地，提到氨基包括氨基的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂合物(例如盐酸盐)以及氨基的常规受保护形式。类似地，提到羟基还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂合物以及常规受保护形式。
盐
可方便或可期望制备、纯化和/或处理活性化合物的对应盐，例如药学上可接受的盐。Berge等，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)讨论了药学上可接受的盐的实例。
举例来说，如果化合物为阴离子的或具有可为阴离子的官能团(例如-COOH可为-COO-)，那么可与适合的阳离子形成盐。适合的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，诸如Na+和K+；碱土金属离子，诸如Ca2+和Mg2+；以及其他阳离子，诸如Al+3。适合的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些适合的取代的铵离子的实例为源自于以下的那些取代的铵离子：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲胺、苯基苯甲胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见季铵离子的实例为N(CH3)4 +。
如果化合物为阳离子的或具有可为阳离子的官能团(例如-NH2可为-NH3 +)，那么可与适合的阴离子形成盐。适合的无机阴离子的实例包括但不限于源自于以下无机酸的那些无机阴离子：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸以及亚磷酸。
适合的有机阴离子的实例包括但不限于源自于以下有机酸的那些有机阴离子：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸以及戊酸。适合的聚合有机阴离子的实例包括但不限于源自于以下聚合酸的那些聚合有机阴离子：单宁酸、羧甲基纤维素。
溶剂合物
可方便或可期望制备、纯化和/或处理活性化合物的对应溶剂合物。术语“溶剂合物”在本文中以常规意义使用，用于指溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂为水，那么溶剂合物可方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
本公开包括溶剂添加跨越PBD部分的亚胺键的化合物，这在下文说明，其中溶剂为水或醇(RAOH，其中RA为C1-4烷基)：
Figure BDA0003397768530000761
这些形式可称为PBD的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如上文在关于R10的部分中所描述)。这些等式的平衡取决于发现化合物的条件以及所述部分本身的特性。
这些特定化合物可例如通过冻干以固体形式分离。
异构体
本公开的某些化合物可以以一种或多种特定的几何、光学、对映异构体、非对映异构体、差向异构体、阻转异构体、立体异构体、互变异构体、构象或端基异构体形式存在，包括但不限于顺式和反式；E形式和Z形式；c形式、t形式和r形式；内形式和外形式；R形式、S形式和内消旋形式；D形式和L形式；d形式和l形式；(+)和(-)形式；酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式；顺式形式和反式形式；顺错形式和反错形式；α形式和β形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭转式、信封式和半椅式；以及它们的组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
术语“手性”是指具有镜像配偶体不可重叠特性的分子，而术语“非手性”是指在镜像配偶体上可重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但关于原子或基团在空间上的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性以及反应性。可以高分辨率分析程序(诸如电泳和色谱法)分离非对映异构体的混合物。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠的镜像的两个立体异构体。
本文中所用的立体化学定义和惯例总体上遵循S.P.Parker编，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。本公开的化合物可含有不对称或手性中心，并且因此以不同的立体异构体形式存在。本公开的化合物的所有立体异构体形式(包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及它们的混合物，诸如外消旋混合物)旨在形成本公开的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。使用前缀d和l或(+)和(-)来指定由化合物引起的平面偏振光的旋转的符号，其中(-)或l意指化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体为相同的，除了它们为彼此的镜像。特定的立体异构体也可称为对映异构体，并且经常将这种异构体的混合物称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，外消旋混合物或外消旋体可在不具有立体选择性或立体特异性的化学反应或过程中产生。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构体物质的没有光学活性的等摩尔混合物。
注意，除了如下文关于互变异构体形式所讨论，从如本文所用的术语“异构体”特别排除了结构(或构造)异构体(即差异在于原子之间的连接而不仅在于原子在空间中的位置的异构体)。举例来说，提到甲氧基-OCH3不应解释为提到其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地，提到邻氯苯基不应解释为提到其结构异构体间氯苯基。然而，提到一类结构很可能包括在所述类型的范围内的结构异构体形式(例如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基以及叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基以及对甲氧基苯基)。
以上排除不涉及如例如以下互变异构体对中的互变异构体形式(例如酮基形式、烯醇形式以及烯醇化物形式)：酮/烯醇(以下说明)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮基以及硝基/异硝基。
Figure BDA0003397768530000781
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能量势垒可相互转化的不同能量的结构异构体。举例来说，质子互变异构体(也称为质子性互变异构体)包括经由质子迁移的相互转化，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重组发生的相互转化。
注意，术语“异构体”特别地包括具有一个或多个同位素取代的化合物。举例来说，H可呈任何同位素形式，包括1H、2H(D)以及3H(T)；C可呈任何同位素形式，包括12C、13C以及14C；O可呈任何同位素形式，包括16O和18O；等。
可合并至本公开的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟以及氯的同位素，诸如但不限于2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl以及125I。本公开的各种同位素标记化合物，例如其中合并了诸如3H、13C、14C等放射性同位素的那些同位素标记化合物。此类同位素标记化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术(诸如正电子发射断层成像术(PET)或单光子发射计算机断层成像术(SPECT))，包括药物或底物组织分布分析；或用于患者的放射性治疗中。本公开的氘标记或取代的治疗性化合物可具有改善的DMPK(药物代谢和药代动力学)特性，DMPK特性涉及分布、代谢以及排泄(ADME)。用更重的同位素(诸如氘)取代可提供因更大的代谢稳定性产生的某种治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低。18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。可大体上通过用容易获得的同位素标记试剂取代非同位素标记试剂进行下文所描述的方案或实施例和制备中所公开的程序来制备本公开的同位素标记化合物和其前药。另外，用更重的同位素(特别是氘，即2H或D)取代可提供由更大的代谢稳定性产生的某种治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低或治疗指数改善。应理解，上下文中的氘被视为取代基。这种更重同位素(尤其是氘)的浓度可通过同位素富集因子来确定。在本公开的化合物中，未具体指定为特定同位素的任何原子意在代表所述原子的任何稳定同位素。
除非另外指明，否则提到特定化合物包括所有此类异构体形式，包括它们的(全部或部分)外消旋混合物和其他混合物。用于制备(例如不对称合成)和分离(例如分级结晶和色谱手段)此类异构体形式的方法为本领域中已知的，或通过以已知方式调整本文所教示的方法或已知方法而容易获得的。
生物活性
体外细胞增殖分析
通常，如下测量抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：使具有受体蛋白的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中的ADC的抗体；培养细胞约6小时至约5天的时间；并且测量细胞活力。使用基于细胞的体外分析来测量本公开的ADC的活力(增殖)、细胞毒性以及细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
可通过细胞增殖分析来测量抗体-药物缀合物的体外效力。CellTiter-
Figure BDA0003397768530000791
发光细胞活力分析为可商购获得的(Promega Corp.，Madison，WI)基于鞘翅目(Coleoptera)荧光素酶的重组表达的同质分析方法(美国专利号5583024；5674713以及5700670)。此细胞增殖分析基于对存在的ATP的定量来确定培养物中的活细胞数目，存在的ATP为代谢活性细胞的指示物(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。在96孔格式中进行CellTiter-
Figure BDA0003397768530000801
分析，使其适用于自动高通量筛选(HTS)(Cree等(1995)AntiCancerDrugs 6:398-404)。同质分析程序涉及直接将单一试剂(CellTiter-
Figure BDA0003397768530000802
试剂)添加至在补充血清的培养基中所培养的细胞中。不需要细胞洗涤、移除培养基以及多个移液步骤。添加试剂并且混合之后，系统在10分钟内在384孔格式中检测到低至15个细胞/孔。可用ADC连续处理细胞，或可处理细胞并且将其与ADC分离。通常，简短处理(即3小时)的细胞显示出与连续处理的细胞相同的效力效果。
同质“添加-混合-测量”模式引起细胞溶解并且产生与存在的ATP的量成比例的发光信号。ATP的量与存在于培养物中的细胞的数目成正比。CellTiter-
Figure BDA0003397768530000803
分析产生由荧光素酶反应产生的“辉光型(glow-type)”发光信号，所述发光信号具有通常大于5小时的半衰期，这取决于使用的细胞类型和培养基。以相对发光单位(RLU)来反映活细胞。用重组萤火虫荧光素酶以氧化方式使底物甲虫荧光素脱羧基化，同时ATP转化为AMP并且产生光子。
还可通过细胞毒性分析来测量抗体-药物缀合物的体外效力。将培养的贴壁细胞(adherent cell)用PBS洗涤，用胰蛋白酶剥离、在含有10％FCS的完全培养基中稀释、离心、再悬浮于新鲜培养基中并且用血细胞计数器计数。直接对悬浮培养物进行计数。适合用于计数的单分散细胞悬浮液可能需要通过反复抽吸来搅拌悬浮液以打散细胞团块。
将细胞悬浮液稀释至所需接种密度并且分配(100μl/孔)至黑色96孔板中。将贴壁细胞系的板孵育过夜以使其贴壁。可在接种当天使用悬浮细胞培养物。
在适当的细胞培养基中制备ADC(20μg/ml)的储备溶液(1ml)。通过顺序转移100μl至900μl的细胞培养基，在15ml离心管中制备储备ADC的一系列10倍稀释液。
在先前涂铺有细胞悬浮液(100μl)的96孔黑色板中分配每种ADC稀释液(100μl)的四个重复孔，得到200μl的最终体积。对照孔接收细胞培养基(100μl)。
如果细胞系的倍增时间大于30小时，那么ADC孵育持续5天，否则进行四天孵育。
在孵育期结束时，用阿尔玛蓝(Alamar blue)分析评估细胞活力。将阿尔玛蓝(Invitrogen)分配在整个板上(20μl/孔)并且孵育4小时。在Varioskan快速读板器上以激发波长570nm、发射波长585nm测量阿尔玛蓝荧光。由与对照孔中的平均荧光相比ADC处理的孔中的平均荧光计算细胞存活百分比。
用途
可使用本公开的缀合物在目标位置提供PBD化合物。
目标位置优选为增殖细胞群体。抗体为针对存在于增殖细胞群体上的抗原的抗体。
在一个实施方案中，与存在于增殖细胞群体(例如肿瘤细胞群体)中的抗原的量相比，在非增殖细胞群体中抗原不存在或以降低的水平存在。
在目标位置，接头可裂解以便释放化合物RelA、RelB、RelC、RelD或RelE。因此，可使用缀合物选择性地将化合物RelA、RelB、Rel C、RelD或RelE提供至目标位置。
接头可由存在于目标位置的酶裂解。
目标位置可为体外、体内或离体。
本公开的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包括具有抗癌活性效用的那些抗体-药物缀合物化合物。特别地，化合物包括通过接头与PBD药物部分(即毒素)缀合(即共价连接)的抗体。当药物未与抗体缀合时，PBD药物具有细胞毒性作用。因此，通过与抗体缀合来调节PBD药物部分的生物活性。本公开的抗体-药物缀合物(ADC)选择性地将有效剂量的细胞毒性剂递送至肿瘤组织，由此可实现更大的选择性，即更低的有效剂量。
因此，在一个方面中，本公开提供了一种如本文所描述的供在治疗中使用的缀合物化合物。
在另一方面中，还提供了一种如本文所描述用于治疗增殖性疾病的缀合物化合物。本公开的第二方面提供了缀合物化合物在用于治疗增殖性疾病的药物的制造中的用途。
本领域技术人员能够容易地确定候选缀合物是否治疗任何特定细胞类型的增殖性疾患。举例来说，以下实施例中描述了可方便地用于评估由特定化合物提供的活性的分析。
术语“增殖性疾病”是有关体外或体内不需要的过量或异常细胞的不想要的或不受控制的细胞增殖，诸如赘生性或增生性生长。
增殖性疾患的实例包括但不限于良性、癌变前和恶性细胞增殖，包括但不限于赘瘤和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑素瘤)、淋巴瘤、白血病、银屑病、骨骼病、纤维增殖性病症(例如结缔组织的纤维增殖性病症)以及动脉粥样硬化。特别关注的癌症包括但不限于白血病和卵巢癌。
可治疗任何细胞类型，包括但不限于肺、胃肠道(包括例如肠、结肠)、乳房(乳腺细胞)、卵巢、前列腺、肝脏(肝细胞)、肾脏(肾细胞)、膀胱、胰腺、脑以及皮肤。
特别关注的病症包括但不限于癌症，包括转移性癌症和转移性癌细胞，诸如可被发现在诸如血液或淋巴液等体液中循环的循环肿瘤细胞。特别关注的癌症包括卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌以及肾癌。
其他所关注的疾病包括其中KAAG1过度表达或其中KAAG1拮抗作用将提供临床益处的任何疾患。这些疾患包括免疫病症、心血管病症、血栓形成、糖尿病、免疫检查点病症、纤维化病症(纤维化)或增殖性疾病，诸如癌症，特别是转移性癌症。
本公开的抗体-药物缀合物(ADC)预期可用于治疗例如以肿瘤抗原的过表达为特征的各种疾病或病症。示例性疾患或过度增殖性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液病以及淋巴恶性肿瘤。其他病症包括神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质细胞、囊胚腔、炎性、血管生成以及免疫病症，包括自身免疫病症。
通常，所要治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如癌症。本文中所要治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴系统恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症(包括胃肠道癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌症或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
治疗中可使用ADC化合物的自体免疫疾病包括风湿性病症(诸如类风湿性关节炎、休格兰氏综合征(
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syndrome)、硬皮病、狼疮(诸如SLE和狼疮性肾炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征以及银屑病性关节炎)、骨关节炎、自体免疫胃肠道和肝脏病症(诸如炎性肠道疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease))、自体免疫胃炎和恶性贫血、自体免疫肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎以及乳糜泻)、血管炎(诸如ANCA相关血管炎，包括查格-施特劳斯血管炎(Churg-Straussvasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)以及多动脉炎)、自体免疫神经病症(诸如多发性硬化、眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茨海默氏病(Alzheimer's disease)以及自体免疫多发性神经病变)、肾脏病症(诸如肾小球性肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)以及伯杰氏病(Berger's disease))、自体免疫皮肤病症(诸如银屑病、荨麻疹、风疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮以及皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜以及自体免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自体免疫听力疾病(诸如内耳疾病和听力损失)、白塞氏病(Behcet's disease)、雷诺氏综合征(Raynaud's syndrome)、器官移植以及自体免疫内分泌病症(诸如糖尿病性相关自体免疫疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison's disease)以及自体免疫甲状腺病(例如格雷夫斯病(Graves'disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、休格兰氏综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎以及肾小球性肾炎。
治疗方法
可将本公开的缀合物用于治疗方法中。还提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本公开的缀合物化合物。术语“治疗有效量”为足以对患者显示益处的量。此类益处可为至少改善至少一种症状。所施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正在治疗的目标的性质和严重程度。治疗的处方(例如剂量的确定)在全科医师和其他医生的职责范围内。
本公开的化合物可单独或与其他治疗组合根据所要治疗的病症同时或依序施用。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(施用活性剂，包括例如药物，诸如化学治疗剂)；手术；以及放射疗法。
“化学治疗剂”为可用于治疗癌症的化合物，无论作用机制如何。化学治疗剂的类别包括但不限于：烷基化剂、抗代谢物、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒性剂/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂以及激酶抑制剂。化学治疗剂包括“靶向疗法”和常规化学疗法中所用的化合物。
化学治疗剂的实例包括：厄洛替尼(erlotinib)(
Figure BDA0003397768530000841
Genentech/OSIPharm.)、多西他赛(docetaxel)(
Figure BDA0003397768530000851
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(gemcitabine)(
Figure BDA0003397768530000852
Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺-二胺、二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、帕西他赛(paclitaxel)(
Figure BDA0003397768530000853
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(
Figure BDA0003397768530000854
Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，
Figure BDA0003397768530000855
Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，
Figure BDA0003397768530000856
)以及多柔比星(doxorubicin)
Figure BDA0003397768530000857
Akti-1/2、HPPD以及雷帕霉素(rapamycin)。
更多化学治疗剂的实例包括：奥沙利铂(
Figure BDA0003397768530000858
Sanofi)、硼替佐米(
Figure BDA0003397768530000859
Millennium Pharm.)、索坦(sutent)(
Figure BDA00033977685300008510
SU11248，Pfizer)、来曲唑(
Figure BDA00033977685300008511
Novartis)、伊马替尼甲磺酸盐(imatinib mesylate)(
Figure BDA00033977685300008512
Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma、Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(
Figure BDA00033977685300008513
AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA00033977685300008514
Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA00033977685300008515
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH66336，Schering Plough)、索拉非尼(sorafenib)(
Figure BDA00033977685300008516
BAY43-9006，BayerLabs)、吉非替尼(gefitinib)(
Figure BDA00033977685300008517
AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(
Figure BDA00033977685300008518
CPT-11，Pfizer)、替匹法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛(Cremophor))、帕西他赛的白蛋白工程化纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，II)、凡德他尼(vandetanib)(rINN，ZD6474，
Figure BDA0003397768530000861
AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)、替西罗莫司(
Figure BDA0003397768530000862
Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(canfosfamide)(
Figure BDA0003397768530000863
Telik)、噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(
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Figure BDA0003397768530000865
)；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)以及哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)以及乌瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺以及三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；薯司他汀(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)以及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；伊斯罗宾(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥，诸如氮芥苯丁酸、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)以及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)、卡奇霉素γ1I、卡奇霉素ω1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素(dactinomycin)、柔红比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星以及脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、奈莫柔比星(nemorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、表硫雄醇、美雄酮(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；乙酰葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；多弗酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0003397768530000881
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A以及蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨
Figure BDA0003397768530000882
双羟蒽醌；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；卡培他滨(capecitabine)(
Figure BDA0003397768530000883
Roche)；依班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，诸如视黄酸；以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸以及衍生物。
“化学治疗剂”的定义中还包括：(i)起到调控或抑制激素对肿瘤的作用的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
Figure BDA0003397768530000884
他莫昔芬柠檬酸盐)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)以及
Figure BDA0003397768530000885
(托瑞米芬柠檬酸盐(toremifine citrate))；(ii)抑制调控肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA0003397768530000886
(甲地孕酮乙酸盐)、
Figure BDA0003397768530000887
(依西美坦(exemestane)；Pfizer)，福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、
Figure BDA0003397768530000888
(伏罗唑(vorozole))、
Figure BDA0003397768530000889
(来曲唑；Novartis)，以及
Figure BDA00033977685300008810
(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素剂，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)以及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，诸如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中所涉及的信号传导路径中的基因(例如PKC-α、RAF以及H-Ras)的表达的那些反义寡核苷酸，诸如奥利默森
Figure BDA0003397768530000891
Genta Inc.)；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0003397768530000892
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
Figure BDA0003397768530000893
以及
Figure BDA0003397768530000894
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如
Figure BDA0003397768530000895
Figure BDA0003397768530000896
rmRH；(ix)抗血管生成剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)(
Figure BDA0003397768530000897
Genentech)；以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸以及衍生物。
“化学治疗剂”的定义中还包括治疗性抗体，诸如阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、贝伐单抗(bevacizumab)(
Figure BDA0003397768530000898
Genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(
Figure BDA0003397768530000899
Imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(
Figure BDA00033977685300008910
Amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(
Figure BDA00033977685300008911
Genentech/Biogen Idec)、奥法木单抗(ofatumumab)(
Figure BDA00033977685300008912
GSK)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(PERJETATM、OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(
Figure BDA00033977685300008913
Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)以及抗体药物结合物奥星-吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)(
Figure BDA00033977685300008914
Wyeth)。
具有作为与本公开的缀合物组合的化学治疗剂的治疗潜能的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐单抗、莫星-比伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)、莫星-坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西弗丝妥珠单抗(cidfusituzumab)、西地妥珠单抗(cidtuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、奥星-吉妥珠单抗、奥星-艾诺妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺洛维珠单抗(nolovizumab)、奴马维珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、派弗西妥珠单抗(pecfusituzumab)、派妥珠单抗(pectuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、来利珠单抗(ralivizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、瑞利伟珠单抗(reslivizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、来西维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、芦利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、泰坦-他卡妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥珠单抗、妥考妥珠单抗(tucotuzumab)西莫白介素、土库西妥珠单抗(tucusituzumab)、恩维珠单抗(umavizumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)以及维西珠单抗(visilizumab)。
除活性成分(即缀合物化合物)外，根据本公开并且用于根据本公开的用途的药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应为无毒的并且不应妨碍活性成分的功效。载体或其他材料的准确特征将取决于施用途径，施用途径可为口服，或通过注射，例如经皮肤、皮下或静脉内注射。
用于口服施用的药物组合物可呈片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊可包含固体载体，诸如明胶。
对于静脉内、经皮肤或皮下注射或在痛苦位点注射，活性成分将呈肠胃外可接受的水溶液形式，所述肠胃外可接受的水溶液为无热原的并且具有适合的pH值、等渗性以及稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物来制备适合的溶液，诸如氯化钠注射液、林格氏注射剂(Ringer's Injection)、乳酸林格氏液注射剂。可按需要包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
制剂
虽然可单独使用(例如施用)缀合物化合物，但通常优选的是，以组合物或制剂形式呈现缀合物化合物。
在一个实施方案中，组合物为药物组合物(例如制剂(formulation/preparation)、药剂)，所述药物组合物包含如本文所描述的缀合物化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中，组合物为药物组合物，所述药物组合物包含如本文所描述的至少一种缀合物化合物以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填料、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、增香剂以及甜味剂。
在一个实施方案中，组合物还包含其他活性剂，例如其他治疗剂或预防剂。
在标准制药文本中可找到适合的载体、稀释剂、赋形剂等。参见例如Handbook of Pharmaceutical Additives，第2版(M.Ash和I.Ash编)，2001(Synapse InformationResources，Inc.，Endicott，New York，USA)，Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，pub.Lippincott，Williams&Wilkins，2000；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，1994。
本公开的另一方面是有关制备药物组合物的方法，所述方法包括混合至少一种[11C]放射性标记缀合物或缀合物样化合物(如本文所定义)以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，例如载体、稀释剂、赋形剂等。如果配制成离散单元(例如片剂等)，那么每个单元含有预定量(剂量)的活性化合物。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是有关在合理医学判断范围内适合用于与所考虑的受试者(例如人)的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、符合合理利益/风险比的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。每种载体、稀释剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须为“可接受的”。
制剂可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。此类方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。一般来讲，如下制备制剂：使活性化合物与载体(例如液体载体、微细固体载体等)均匀并且紧密地缔合在一起，然后使产品成形(如果有必要的话)。
可将制剂制备成用于提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或它们的组合。
适合用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括其中溶解、悬浮或以其他方式(例如以脂质体或其他微粒形式)提供活性成分的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液、悬浮液)。此类液体可另外含有其他药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂以及溶质，所述其他药学上可接受的成分使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗。赋形剂的实例包括例如水、乙醇、多元醇、甘油、植物油等。适合用于此类制剂中的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。通常，液体中活性成分的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可存储在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在即将使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。可从无菌粉末、颗粒以及片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
剂量
本领域技术人员将了解，缀合物化合物和包含缀合物化合物的组合物的适当剂量在不同受试者间可不同。确定最佳剂量通常将涉及平衡治疗益处水平与任何风险或有害副作用。所选剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、组合使用的其他药物、化合物和/或材料、疾患的严重程度以及患者的种类、性别、年龄、体重、状况、一般健康以及先前病史。化合物的量和施用途径将最终由医师、兽医或临床医师决断，不过通常剂量将被选择为在作用位点实现局部浓度，所述局部浓度实现所需效应而不会引起基本有害或不利的副作用。
施用可在整个疗程中以一个剂量、连续地或间断地(例如按适当的间隔以分开的剂量)实现。确定最有效的施用手段和剂量的方法为本领域技术人员熟知的，并且将随疗法中所用的制剂、疗法的目的、所处理的一种或多种靶细胞以及所治疗的受试者而改变。可进行单次或多次施用，并且由治疗医师、兽医或临床医师选择剂量水平和模式。
一般来说，活性化合物的适合的剂量在每千克受试者体重每天约100ng至约25mg(更通常为约1μg至约10mg)范围内。在活性化合物为盐、酯、酰胺、前药等的情况下，基于母体化合物来计算施用的量并且因此所用的实际重量成比例增加。
在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约100mg，每天3次。
在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约150mg，每天2次。
在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约200mg，每天2次。
然而，在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用缀合物化合物：约50或约75mg，每天3或4次。
在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用缀合物化合物：约100或约125mg，每天2次。
上文所描述的剂量可适用于缀合物(包括PBD部分和连至抗体的接头)或适用于有效量的所提供的PBD化合物，例如在接头裂解后可释放的量的化合物。
为预防或治疗疾病，本公开的ADC的适当剂量将取决于如上文定义的所要治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、分子是出于预防还是治疗目的施用、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。分子适合一次性或经历一系列治疗施用给患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的分子为用于向患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次分开施用还是通过连续输注。根据以上提到的因素，典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。要施用给患者的ADC的示例性剂量在每千克患者体重约0.1至约10mg范围内。对于历经若干天或更长时间的重复施用，根据疾患，治疗持续到出现所需疾病症状抑制为止。示例性剂量方案包括施用约4mg/kg的初始负载剂量随后每周、每两周或每三周施用额外剂量的ADC的疗程。其他剂量方案可能适用。通过常规技术和分析容易监测此疗法的进展。
治疗
如本文在治疗疾患的情形中所用，术语“治疗”通常是有关对人或动物(例如在兽医学应用中)的实现某种所需治疗作用(例如抑制疾患进展)的治疗和疗法，并且包括降低进展速率、阻止进展速率、疾患消退、疾患改善以及疾患治愈。还包括作为预防措施的治疗(即预防、防止)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是有关活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂量当根据所需治疗方案施用时有效产生某种所需治疗作用并且符合合理效益/风险比的量。
类似地，如本文所用，术语“预防有效量”是有关活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂量当根据所需治疗方案施用时有效产生某种所需预防作用并且符合合理效益/风险比的量。
药物缀合物的制备
可通过若干途径使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件以及试剂(包括抗体的亲核基团与药物-接头试剂的反应)来制备抗体药物缀合物。可使用此方法来制备本公开的抗体-药物缀合物。
抗体上的亲核基团包括但不限于侧链硫醇基，例如半胱氨酸。硫醇基为亲核的并且能够与接头部分(诸如本公开的那些接头部分)上的亲电基团反应以形成共价键。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用诸如DTT(克莱兰氏试剂(Cleland's reagent)，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz等(1999)Anal.Biochem.第273卷:73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)等还原剂处理来使抗体关于与接头试剂缀合具反应性。因此，理论上，每个半胱氨酸二硫桥将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂)反应使得胺转化为硫醇来将额外的亲核基团引入抗体。
受试者/患者
受试者/患者可为动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物(例如袋鼠、袋熊)、单孔目动物(例如鸭嘴兽)、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔类(例如兔子)、禽类(例如鸟)、犬类(例如狗)、猫类(例如猫)、马类(例如马)、猪类(例如猪)、绵羊类(例如绵羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴类(例如狨猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
此外，受试者/患者可为其发育形式中的任一者，例如胎儿。在一个优选实施方案中，受试者/患者为人。
其他优选项
以下优选项可适用于如上文所描述的本公开的所有方面，或者可涉及单一方面。优选项可以任何组合方式组合在一起。
在一些实施方案中，R6’、R7’、R9’以及Y’优选分别与R6、R7、R9以及Y相同。
二聚体链接
Y和Y'优选为O。
R”优选为没有取代基的C3-7亚烷基。更优选地，R”为C3、C5或C7亚烷基。最优选地，R”为C3或C5亚烷基。
R6至R9
R9优选为H。
R6优选选自H、OH、OR、SH、NH2、硝基以及卤素，并且更优选为H或卤素，并且最优选为H。
R7优选选自H、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'以及卤素，并且更优选独立地选自H、OH以及OR，其中R优选选自任选取代的C1-7烷基、C3-10杂环基以及C5-10芳基。R可更优选为可能取代或可能未取代的C1-4烷基。所关注的取代基为C5-6芳基(例如苯基)。7-位的特别优选的取代基为OMe和OCH2Ph。特别关注的其他取代基为二甲氨基(即–NMe2)；-(OC2H4)qOMe，其中q为0至2；含氮C6杂环基，包括吗啉基、哌啶基以及N-甲基-哌嗪基。
这些优选项分别适用于R9'、R6'以及R7'。
R12
当C2’与C3’之间存在双键时，R12选自：
(a)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(b)C1-5饱和脂族烷基；
(c)C3-6饱和环烷基；
(d)
Figure BDA0003397768530000971
其中R21、R22以及R23中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5；
(e)
Figure BDA0003397768530000972
其中R25a和R25b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(f)
Figure BDA0003397768530000973
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。
当R12为C5-10芳基时，它可为C5-7芳基。C5-7芳基可为苯基或C5-7杂芳基，例如呋喃基、噻吩基以及吡啶基。在一些实施方案中，R12优选为苯基。在其他实施方式中，R12优选为噻吩基，例如噻吩-2-基和噻吩-3-基。
当R12为C5-10芳基时，它可为C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可通过任何可用的环位置结合至PBD核。举例来说，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基以及喹啉-8-基。其中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可为优选的。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基以及异喹啉-8-基。其中，异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可为优选的。
当R12为C5-10芳基时，它可带有任何数量的取代基。它优选带有1至3个取代基，其中1和2个为更优选的，并且单一取代的基团为最优选的。取代基可在任何位置。
在R12为C5-7芳基的情况下，单一取代基优选在不与连至化合物其余部分的键相邻的环原子上，即它优选相对于连至化合物其余部分的键为β或γ。因此，在C5-7芳基为苯基的情况下，取代基优选在间位或对位，并且更优选在对位。
在R12为C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基的情况下，它可在喹啉或异喹啉环的任何位置带有任何数目的取代基。在一些实施方案中，它带有一个、两个或三个取代基，并且这些取代基可在近端环和远端环上或两者上(如果超过一个取代基)。
R12取代基，当R12为C5-10芳基时
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为卤基，那么它优选为F或Cl，更优选为Cl。
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为醚，那么它在一些实施方案中可为烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)，或者它在一些实施方案可为C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可进一步被取代，例如由氨基(例如二甲氨基)取代。
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为C1-7烷基，那么它可优选为C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为C3-7杂环基，那么它在一些实施方案中可为C6含氮杂环基，例如吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基。这些基团可经由氮原子结合至PBD部分的其余部分。这些基团可进一步由例如C1-4烷基取代。如果C6含氮杂环基为哌嗪基，那么所述另外的取代基可在第二个氮环原子上。
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为双氧基-C1-3亚烷基，那么此取代基优选为双氧基-亚甲基或双氧基-亚乙基。
如果当R12为C5-10芳基时R12上的取代基为酯，那么此取代基优选为甲基酯或乙基酯。
当R12为C5-10芳基时，特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基以及甲基-噻吩基。R12的其他特别优选的取代基为二甲氨基丙氧基和羧基。
当R12为C5-10芳基时，特别优选的取代的R12基团包括但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-双氧基亚甲基-苯基、4-甲基硫代苯基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基以及萘基。另一可能的取代的R12基团为4-硝基苯基。特别关注的R12基团包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-双氧基亚甲基-苯基。
当R12为C1-5饱和脂族烷基时，它可为甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。
在一些实施方案中，它可为甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在这些实施方案中的一些中，它可为甲基。在其他实施方案中，它可为丁基或戊基，所述丁基或戊基可为直链或支链的。
当R12为C3-6饱和环烷基时，它可为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一些实施方案中，它可为环丙基。
当R12为
Figure BDA0003397768530000991
时，R21、R22以及R23中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5。在一些实施方案中，R12基团中的碳原子总数不超过4或不超过3。
在一些实施方案中，R21、R22以及R23中的一者为H，并且另外两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在其他实施方案中，R21、R22以及R23中的两者为H，并且另一基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在一些实施方案中，不为H的基团选自甲基和乙基。在这些实施方案中的一些中，不为H的基团为甲基。
在一些实施方案中，R21为H。
在一些实施方案中，R22为H。
在一些实施方案中，R23为H。
在一些实施方案中，R21和R22为H。
在一些实施方案中，R21和R23为H。
一些实施方案中，R22和R23为H。
特别关注的R12基团为：
Figure BDA0003397768530001001
当R12为
Figure BDA0003397768530001002
时，R25a和R25b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。在一些实施方案中，不为H的基团为任选取代的苯基。如果苯基任选的取代基为卤基，那么它优选为氟基。在一些实施方案中，苯基为未取代的。
当R12为
Figure BDA0003397768530001003
时，R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。如果苯基任选的取代基为卤基，那么它优选为氟基。在一些实施方案中，苯基为未取代的。
在一些实施方案中，R24选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。在这些实施方案中的一些中，R24选自H和甲基。
当C2’与C3’之间存在单键时，
R12为
Figure BDA0003397768530001011
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R26a和R26b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯。
在一些实施方案中，优选R26a与R26b均为H。
在其他实施方案中，优选R26a与R26b均为甲基。
在其他实施方案中，优选R26a和R26b中的一者为H，并且另一者选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基为任选取代的。在这些其他实施方案中，可进一步优选的是，不为H的基团选自甲基和乙基。
R2
上述关于R12的优选项同样地适用于R2。
R22
在一些实施方案中，R22具有式IIa。
当R22具有式IIa时，其中的A可为苯基或C5-7杂芳基，例如呋喃基、噻吩基以及吡啶基。在一些实施方案中，A优选为苯基。
Q2-X可在C5-7芳基的任何可用环原子上，但优选在不与连至化合物其余部分的键相邻的环原子上，即它优选相对于连至化合物其余部分的键为β或γ。因此，在C5-7芳基(A)为苯基的情况下，取代基(Q2-X)优选在间位或对位，并且更优选在对位。
在一些实施方案中，Q1为单键。在这些实施方案中，Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中Z选自单键、O、S以及NH并且为1至3。在这些实施方案中的一些中，Q2为单键。在其他实施方案中，Q2为-Z-(CH2)n-。在这些实施方案中，Z可为O或S并且n可为1或n可为2。在这些实施方案中的其他实施方案中，Z可为单键并且n可为1。
在其他实施方案中，Q1为-CH＝CH-。
在其他实施方案中，R22具有式IIb。在这些实施方案中，RC1、RC2以及RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基；在一些优选实施方案中，RC1、RC2以及RC3全部为H。在其他实施方案中，RC1、RC2以及RC3全部为甲基。在某些实施方案中，C1、RC2以及RC3独立地选自H和甲基。
X为选自包含以下的列表的基团：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、
Figure BDA0003397768530001021
NRNRL2’，其中RN选自包含H和C1-4烷基的组。X可优选为：OH、SH、CO2H、-N＝C＝O或NHRN，并且可更优选为：O-RL2'、S-RL2'、CO2-RL2'、-NH-C(＝O)-RL2'或NH-RL2'。特别优选的基团包括：O-RL2'、S-RL2'以及NH-RL2'，其中NH-RL2'为最优选的基团。
在一些实施方案中，R22具有式IIc。在这些实施方案中，优选Q为NRN-RL2'。在其他实施方案中，Q为O-RL2’。在其他实施方案中，Q为S-RL2'。RN优选选自H和甲基。在一些实施方案中，RN为H。在其他实施方案中，RN为甲基。
在一些实施方案中，R22可为-A-CH2-X和-A-X。在这些实施方案中，X可为O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’以及NH-RL2’。在特别优选的实施方案中，X可为NH-RL2'。
R10、R11
在一些实施方案中，R10和R11一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
在一些实施方案中，R11为OH。
在一些实施方案中，R11为OMe。
在一些实施方案中，R11为SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子。
R11a
在一些实施方案中，R11a为OH。
在一些实施方案中，R11a为OMe。
在一些实施方案中，R11a为SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子。
R20、R21
在一些实施方案中，R20和R21一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
在一些实施方案中，R20为H。
在一些实施方案中，R20为RC。
在一些实施方案中，R21为OH。
在一些实施方案中，R21为OMe。
在一些实施方案中，R21为SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子。
R30、R31
在一些实施方案中，R30和R31一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
在一些实施方案中，R31为OH。
在一些实施方案中，R31为OMe。
在一些实施方案中，R31为SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子。
M和z
优选M为一价的药学上可接受的阳离子，并且更优选为Na+。
z优选为3。
本公开的第一方面的优选缀合物可具有式Ia的DL：
Figure BDA0003397768530001041
其中
RL1'、R20以及R21如上文所定义；
n为1或3；
R1a为甲基或苯基；并且
R2a选自：
(a)
Figure BDA0003397768530001042
(b)
Figure BDA0003397768530001043
(c)
Figure BDA0003397768530001044
(d)
Figure BDA0003397768530001045
(e)
Figure BDA0003397768530001046
(f)
Figure BDA0003397768530001047
(g)
Figure BDA0003397768530001048
以及
(h)
Figure BDA0003397768530001049
本公开的第一方面的优选缀合物可具有式Ib的DL：
Figure BDA00033977685300010410
其中
RL1'、R20以及R21如上文所定义；
n为1或3；并且
R1a为甲基或苯基。
本公开的第一方面的优选缀合物可具有式Ic的DL：
Figure BDA0003397768530001051
其中RL2'、R10、R11、R30以及R31如上文所定义
n为1或3；
R12a选自：
(a)
Figure BDA0003397768530001052
(b)
Figure BDA0003397768530001053
(c)
Figure BDA0003397768530001054
(d)
Figure BDA0003397768530001055
(e)
Figure BDA0003397768530001056
(f)
Figure BDA0003397768530001057
(g)
Figure BDA0003397768530001058
以及
(h)
Figure BDA0003397768530001059
氨基位于苯基的间位或对位。
本公开的第一方面的优选缀合物可具有式Id的DL：
Figure BDA0003397768530001061
其中RL2'、R10、R11、R30以及R31如上文所定义
n为1或3；
R1a为甲基或苯基；
R12a选自：
(a)
Figure BDA0003397768530001062
(b)
Figure BDA0003397768530001063
(c)
Figure BDA0003397768530001064
(d)
Figure BDA0003397768530001065
(e)
Figure BDA0003397768530001066
(f)
Figure BDA0003397768530001067
(g)
Figure BDA0003397768530001068
以及
(h)
Figure BDA0003397768530001069
本公开的第一方面的优选缀合物可具有式Ie的DL：
Figure BDA00033977685300010610
其中RL2'、R10、R11、R30以及R31如上文所定义
n为1或3；
R1a为甲基或苯基；
R12a选自：
(a)
Figure BDA0003397768530001071
(b)
Figure BDA0003397768530001072
(c)
Figure BDA0003397768530001073
(d)
Figure BDA0003397768530001074
(e)
Figure BDA0003397768530001075
(f)
Figure BDA0003397768530001076
(g)
Figure BDA0003397768530001077
以及
(h)
Figure BDA0003397768530001078
序列
SEQ ID NO:1[3A4 VH，CDR加下划线]
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:2[3A4 VL，CDR加下划线]
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:3[3A4重链]
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
N*表示Asn297
SEQ ID NO:4[3A4轻链]
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:5[3A4 VH CDR1]
GYTFTDDYMS
SEQ ID NO:6[3A4 VH CDR2]
DINPYNGDTN
SEQ ID NO:7[3A4 VH CDR3]
DPGAMDY
SEQ ID NO:8[3A4 VL CDR1]
RSSQSLLHSNGNTYLE
SEQ ID NO:9[3A4 VL CDR2]
TVSNRFS
SEQ ID NO:10[3A4 VL CDR3]
FQGSHVPLT
SEQ ID NO:11[3A4重链，末端K]
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
N*表示Asn297
SEQ ID NO:12[人KAAG1]
MDDDAAPRVEGVPVAVHKHALHDGLRQVAGPGAAAAHLPRWPPPQLAASRREAPPLSQRPHRTQGAGSPPETNEKLTNPQVKEK
SEQ ID NO:13[3A4-L2 VL，CDR加下划线]
DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:14[3A4-L2轻链]
DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:15[3A4-K4VL，CDR加下划线]
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSLLHSNGNTYLEWYQQKPGQPPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:16[3A4-K4轻链]
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSLLHSNGNTYLEWYQQKPGQPPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本公开的声明
1.一种式L-(DL)p的缀合物，其中DL具有式I或II：
Figure BDA0003397768530001101
其中：
L为结合至KAAG1的抗体(Ab)；
当C2’与C3’之间存在双键时，R12选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure BDA0003397768530001111
其中R21、R22以及R23中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure BDA0003397768530001112
其中R25a和R25b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure BDA0003397768530001113
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2'与C3'之间存在单键时，
R12为
Figure BDA0003397768530001114
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R26a和R26b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤基；
其中R和R'独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR'、硝基、Me3Sn以及卤基；
R″为C3-12亚烷基，所述链可由以下间断开：一个或多个杂原子，例如O、S；NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)；和/或芳族环，例如苯或吡啶；
Y和Y'选自O、S或NH；
R6'、R7'、R9'分别选自与R6、R7以及R9相同的基团；
[式I]
RL1'为用于连接至所述抗体(Ab)的接头；
R11a选自OH、ORA(其中RA为C1-4烷基)以及SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子；
R20和R21一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R20选自H和RC，其中RC为封端基团；
R21选自OH、ORA以及SOzM；
当C2与C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure BDA0003397768530001121
其中R11、R12以及R13中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R2基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure BDA0003397768530001122
其中R15a和R15b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure BDA0003397768530001131
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2与C3之间存在单键时，
R2为
Figure BDA0003397768530001132
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R16a和R16b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
[式II]
R22具有式IIIa、式IIIb或式IIIc：
(a)
Figure BDA0003397768530001133
其中A为C5-7芳基，并且
(i)Q1为单键，并且Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中Z选自单键、O、S以及NH，并且n为1至3；或
(ii)Q1为-CH＝CH-，并且Q2为单键；
(b)
Figure BDA0003397768530001134
其中；
RC1、RC2以及RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基；
(c)
Figure BDA0003397768530001135
其中Q选自O-RL2'、S-RL2'以及NRN-RL2'，并且RN选自H、甲基以及乙基
X选自包含以下的组：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、
Figure BDA0003397768530001141
NRNRL2’，其中RN选自包含H和C1-4烷基的组；
RL2’为用于连接至所述抗体(Ab)的接头；
R10和R11一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R10为H并且R11选自OH、ORA以及SOzM；
R30和R31一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R30为H，并且R31选自OH、ORA以及SOzM。
2.根据声明1所述的缀合物，其中所述缀合物不为：
ConjA
Figure BDA0003397768530001142
ConjB
Figure BDA0003397768530001143
ConjC：
Figure BDA0003397768530001151
ConjD
Figure BDA0003397768530001152
或
ConjE：
Figure BDA0003397768530001153
3.根据声明1或声明2所述的缀合物，其中R7选自H、OH以及OR。
4.根据声明3所述的缀合物，其中R7为C1-4烷氧基。
5根据声明1至4中任一项所述的缀合物，其中Y为O。
6.根据前述声明中任一项所述的缀合物，其中R”为C3-7亚烷基。
7.根据声明1至6中任一项所述的缀合物，其中R9为H。
8.根据声明1至7中任一项所述的缀合物，其中R6选自H和卤基。
9.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C5-7芳基。
10.根据声明9所述的缀合物，其中R12为苯基。
11.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C8-10芳基。
12.根据声明9至11中任一项所述的缀合物，其中R12带有一至三个取代基。
13.根据声明9至12中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基以及甲基-苯硫基。
14.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C1-5饱和脂族烷基。
15.根据声明16所述的化合物，其中R12为甲基、乙基或丙基。
16.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C3-6饱和环烷基。
17.根据声明16所述的缀合物，其中R12为环丙基。
18.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001161
19.根据声明18所述的缀合物，其中所述R12基团中的碳原子总数不超过4。
20.根据声明19所述的缀合物，其中所述R12基团中的碳原子总数不超过3。
21.根据声明18至20中任一项所述的缀合物，其中R21、R22以及R23中的一者为H，并且另外两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
22.根据声明18至20中任一项所述的缀合物，其中R21、R22以及R23中的两者为H，并且另一基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
23.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001171
24.根据声明23所述的缀合物，其中R12为以下基团：
Figure BDA0003397768530001172
25.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001173
26.根据声明25所述的缀合物，其中R24选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
27.根据声明26所述的缀合物，其中R24选自H和甲基。
28.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure BDA0003397768530001174
并且R26a与R26b均为H。
29.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure BDA0003397768530001181
并且R26a与R26b均为甲基。
30.根据声明1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure BDA0003397768530001182
R26a和R26b中的一者为H，并且另一者选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基为任选取代的。
[式I]
31.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C5-7芳基。
32.根据声明31所述的缀合物，其中R2为苯基。
33.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R1为C8-10芳基。
34.根据声明31至33中任一项所述的化合物，其中R2带有一至三个取代基。
35.根据声明31至34中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基以及甲基-苯硫基。
36.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C1-5饱和脂族烷基。
37.根据声明36所述的缀合物，其中R2为甲基、乙基或丙基。
38.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C3-6饱和环烷基。
39.根据声明38所述的缀合物，其中R2为环丙基。
40.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001191
41.根据声明40所述的缀合物，其中所述R2基团中的碳原子总数不超过4。
42.根据声明41所述的缀合物，其中所述R2基团中的碳原子总数不超过3。
43.根据声明40至42中任一项所述的缀合物，其中R11、R12以及R13中的一者为H，并且另外两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
44.根据声明40至42中任一项所述的缀合物，其中R11、R12以及R13中的两者为H，并且另一基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
45.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001192
46.根据声明45所述的缀合物，其中R2为以下基团：
Figure BDA0003397768530001193
47.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure BDA0003397768530001194
48.根据声明48所述的缀合物，其中R14选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
49.根据声明48所述的缀合物，其中R14选自H和甲基。
50.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure BDA0003397768530001201
并且R16a与R16b均为H。
51.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure BDA0003397768530001202
并且R16a与R16b均为甲基。
52.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure BDA0003397768530001203
R16a和R16b中的一者为H，并且另一者选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基为任选取代的。
53.根据声明1至52中任一项所述的缀合物，其中R11a为OH。
54.根据声明1至53中任一项所述的缀合物，其中R21为OH。
55.根据声明1至53中任一项所述的缀合物，其中R21为OMe。
56.根据声明1至55中任一项所述的缀合物，其中R20为H。
57.根据声明1至55中任一项所述的缀合物，其中R20为RC。
58.根据声明57所述的缀合物，其中RC选自由以下组成的组：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
60.根据声明57所述的缀合物，其中RC为以下基团：
Figure BDA0003397768530001211
其中星号表示与N10位置的连接点，G2为末端基团，L3为共价键或可裂解接头L1，L2为共价键或与OC(＝O)一起形成自分解接头。
61.根据声明60所述的缀合物，其中G2为Ac或Moc，或选自由以下组成的组：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
62.根据声明1至53中任一项所述的缀合物，其中R20和R21一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
[式II]
63.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa，并且A为苯基。
64.根据声明1至30和声明63中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIa，并且Q1为单键。
65.根据声明63所述的缀合物，其中Q2为单键。
66.根据声明63所述的缀合物，其中Q2为-Z-(CH2)n-，Z为O或S，并且n为1或2。
67.根据声明1至30和声明63中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa，并且Q1为-CH＝CH-。
68.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIb，并且RC1、RC2以及RC3独立地选自H和甲基。
69.根据声明68所述的缀合物，其中RC1、RC2以及RC3全部为H。
70.根据声明68所述的缀合物，其中RC1、RC2以及RC3全部为甲基。
71.根据声明1至30和声明63至70中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa或式IIIb，并且X选自O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、-N-C(＝O)-RL2’以及NH-RL2’。
72.根据声明71所述的缀合物，其中X为NH-RL2’。
73.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIc，并且Q为NRN-RL2’。
74.根据声明73所述的缀合物，其中RN为H和甲基。
75.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIc，并且Q为O-RL2’或S-RL2’。
76.根据声明1至30和声明63至75中任一项所述的缀合物，其中R11为OH。
77.根据声明1至30和声明63至75中任一项所述的缀合物，其中R11为OMe。
78.根据声明1至30和声明63至77中任一项所述的缀合物，其中R10为H。
79.根据声明1至30和声明63至75中任一项所述的缀合物，其中R10和R11一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
80.根据声明1至30和声明63至79中任一项所述的缀合物，其中R31为OH。
81.根据声明1至30和声明63至79中任一项所述的缀合物，其中R31为OMe。
82.根据声明1至30和声明63至81中任一项所述的缀合物，其中R30为H。
83.根据声明1至30和声明63至79中任一项所述的缀合物，其中R30和R31一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
84.根据声明1至83中任一项所述的缀合物，其中R6’、R7’、R9’以及Y’与R6、R7、R9以及Y相同。
85.根据声明1至84中任一项所述的缀合物，其中L-RL1’或L-RL2’为以下基团：
Figure BDA0003397768530001231
其中星号表示与PBD的连接点，Ab为抗体，L1为可裂解接头，A为将L1连接至所述抗体的连接基团，L2为共价键或与-OC(＝O)-一起形成自分解接头。
86.如声明85所述的缀合物，其中L1为酶可裂解的。
87.如声明85或声明86所述的缀合物，其中L1包含氨基酸的连续序列。
88.如声明87所述的缀合物，其中L1包含二肽，并且二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，
-Trp-Cit-。
89.根据声明88所述的缀合物，其中二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-。
90.根据声明89所述的缀合物，其中二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-、-Val-Ala-或-Val-Cit-。
91.根据声明88至90中任一项所述的缀合物，其中基团X2-CO-连接至L2。
92.根据声明88至91中任一项所述的缀合物，其中基团NH-X1-连接至A。
93.根据声明88至92中任一项所述的缀合物，其中L2与OC(＝O)一起形成自分解接头。
94.根据声明93所述的缀合物，其中C(＝O)O和L2一起形成以下基团：
Figure BDA0003397768530001241
其中星号表示与所述PBD的连接点，波浪线表示与所述接头L1的连接点，Y为NH、O、C(＝O)NH或C(＝O)O，并且n为0至3。
95.根据声明94所述的缀合物，其中Y为NH。
96.根据声明94或声明95所述的缀合物，其中n为0。
97.根据声明95所述的缀合物，其中L1和L2与-OC(＝O)-一起构成选自以下的基团：
Figure BDA0003397768530001242
或
Figure BDA0003397768530001251
其中星号表示与所述PBD的连接点，并且波浪线表示与所述接头L1的其余部分的连接点或与A的连接点。
98.根据声明97所述的缀合物，其中波浪线表示与A的连接点。
99.根据声明85至98中任一项所述的缀合物，其中A为：
(i)
Figure BDA0003397768530001252
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与所述抗体的连接点，并且n为0至6；或
(ii)
Figure BDA0003397768530001253
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与所述抗体的连接点，n为0或1，并且m为0至30。
100.根据声明1所述的缀合物，所述缀合物具有式ConjA：
Figure BDA0003397768530001254
ConjB：
Figure BDA0003397768530001261
ConjC：
Figure BDA0003397768530001262
ConjD：
Figure BDA0003397768530001263
或ConjE：
Figure BDA0003397768530001264
101.根据声明1至100中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VH CDR3；
任选地，其中所述VH结构域具有根据SEQ ID NO:1的序列。
102.根据声明1至101中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含：
VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:9的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:10的VL CDR3。
103.根据声明1至102中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的序列。
104.根据声明1至102中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2的序列。
105.根据声明1至104中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:3的序列的重链。
106.根据声明1至104中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的重链。
107.根据声明1至106中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链。
108.根据声明1至106中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:4的序列的轻链。
109.根据声明1至108中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完整抗体。
110.根据声明1至109中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为人源化的、去免疫的或表面重塑的。
111.根据声明1至108中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完全人单克隆IgG1抗体，优选为IgG1,κ。
112.根据声明1至111中任一项所述的缀合物，其中药物(D)相对于抗体(Ab)的药物负载量(p)为1至约8的整数。
113.根据声明112所述的缀合物，其中p为1、2、3或4。
114.根据声明112所述的缀合物，所述缀合物包含抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体-药物缀合物化合物的所述混合物中每个抗体的平均药物负载量为约2至约5。
115.根据声明1至114中任一项所述的缀合物，所述缀合物用于疗法中。
116.根据声明1至114中任一项所述的缀合物，所述缀合物用于治疗受试者的增殖性疾病。
117.根据声明116所述的缀合物，其中所述疾病为癌症。
118.一种药物组合物，所述药物组合物包含声明1至114中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
119.如声明118所述的药物组合物，所述药物组合物还包含治疗有效量的化学治疗剂。
120.根据声明1至114中任一项所述的缀合物在用于治疗受试者的增殖性疾病的药剂的制备中的用途。
121.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用声明118所述的药物组合物。
122.如声明121所述的方法，其中为所述患者施用化学治疗剂与所述缀合物的组合。
实施例
关于药物-接头和所释放化合物的制备和特性的实验方法
在例如WO2014/057119中可找到与本文所公开的药物-接头和所释放化合物的合成和特性有关的详细实施例(参见WO2014/057119的第106页开始的‘实施例部分，特别是实施例1至10)。
在此引用所述实施例，并且以引用的方式并入本文中。
实施例1：缀合物的形成
ADC的产生
通过以下方法将抗KAAG1抗体3A4(VH和VL序列分别为Seq 1和Seq 2)与药物接头E缀合以得到ADC×KAAG1。
将含3A4的30mM组氨酸、200mM蔗糖，pH 6.0用500mM Tris、25mM EDTA，pH 8.5调节至pH 7.5，并且通过在18-22℃下添加1.24摩尔当量的TCEP还原90min。
通过在18-22℃下添加4摩尔当量的10mM SG3249(又名药物接头E)的DMA溶液持续90min来进行缀合，并且通过在18-22℃下添加8摩尔当量的N-乙酰基半胱氨酸持续30min来中止反应。
通过添加400mM组氨酸-HCl，pH 4.0将pH值调节至6.2，并且将缀合物经0.2μM过滤器过滤。使用12渗滤体积(diavolume)的30mM组氨酸、175mM蔗糖，pH 6.0和Pellicon3Ultracell膜对缀合物进行渗滤。
用30mM组氨酸、175mM蔗糖，pH 6.0将ADC稀释至5mg/ml的最终蛋白质浓度，添加吐温-20(Tween-20)至最终浓度为0.02％(v/v)。最后经0.2μM过滤器过滤大块，并且储存在<-70℃下。
使用与药物-接头E缀合的B12抗HIV gp120抗体通过类似于上述方法的方法来产生对照非KAAG1靶向ADC。
DAR测定和纯度分析
ADC×KAAG1的最终DAR如通过HIC所测定为2.2，并且单体百分比如通过尺寸排阻色谱(SEC)所确定为95％。
实施例2：ADC的体外细胞毒性
细胞培养
使用PC3、SN12C以及SKOV3细胞。
体外细胞毒性分析
将80-90％汇合的指数生长的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)剥离(适当时)并且再悬浮于细胞特异性培养基中。然后将细胞稀释至6×104个细胞/ml，并且50μl/孔等分至标记过的白色96孔平底白色透明板中。
通过将过滤灭菌的ADC在细胞生长培养基中稀释，使每种ADC的400μl储备溶液的浓度为20μg/μl。
然后使用此储备溶液形成1:5倍稀释系列，从而产生一组7个稀释液；将50μl的每个ADC稀释液(包括储备溶液)分配至标记过的白色96孔平底板的2个重复孔中，其中含有50μl细胞悬浮液。
培养基对照：将100μl的细胞生长培养基分配至2个重复孔中。
细胞系对照：将50μl的细胞生长培养基+50μl细胞悬浮液分配至2个重复孔中。
然后将板在37℃下在CO2充气培养箱中孵育持续细胞系特定暴露时间；PC3和SN12C为3天，SKOV3为4天。
在孵育期结束时，通过CellTiter-Glo分析(Promega)测量细胞活力。将板从培养箱中移出并且使其平衡至室温持续10分钟，然后将100μl/孔的CellTiter-Glo添加至孔中。然后将板置于定轨振荡器上2分钟(轻轻摇动)，然后使其稳定10分钟。使用Envision读板器测量细胞发光。
由ADC处理的细胞的平均发光(使用2个重复孔)和未处理细胞(细胞对照孔)的平均发光来计算细胞存活百分比。由ADC处理的细胞的平均值(使用2个重复孔)和未处理细胞(细胞对照孔)的平均值来计算细胞存活百分比。使用GraphPad Prism对每个重复使用非线性曲线拟合算法由剂量反应数据确定IC50，由IC50计算平均IC50。将实验重复三次。
结果
IC50(ug/mL SKOV3 SN12C PC3
ADCxKAAG1 0.14 0.22 0.81
对照ADC 17.73 190.2 5.33
从图1中所示的曲线得到IC50数值。
实施例3-TNBC MDA-MB-231异种移植模型中的体内功效研究
在研究的第1天雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu，Charles River)为八周龄，体重(BW)范围为20.7至31.2g。将每只小鼠在右侧皮下(s.c.)注射5×106个MDA-MB-231肿瘤细胞。
使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并且使用下式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2×l/2
其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度(mm)。假设1mg相当于1mm3的肿瘤体积，可估计肿瘤重量。
十六天后(指定为研究的第1天)，将小鼠分选至治疗组中(n＝8)，个别肿瘤体积在108至144mm3范围内，并且组平均肿瘤体积为113-124mm3。
在研究的第1天，经由尾静脉注射以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。
每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到1500mm3的终点体积时或研究结束时(第59天)(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。
结果在图2中示出。
实施例4-SN12C肾癌异种移植模型中的体内功效研究
在研究的第1天雌性严重联合免疫缺陷小鼠(Fox Chase
Figure BDA0003397768530001311
CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，Charles River)为9周龄，并且体重(BW)范围为15.4至22.2g。在肿瘤植入当天，每只测试小鼠接受在右侧皮下植入的5×106个SN12C细胞(含50％
Figure BDA0003397768530001312
基质的磷酸盐缓冲盐水中的0.1mL细胞悬浮液)。
使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并且使用下式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝w2×l/2
其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度(mm)。假设1mg相当于1mm3的肿瘤体积，可估计肿瘤重量。
肿瘤生长经监测为平均尺寸接近100至150mm3的目标范围。在肿瘤细胞植入后二十三天时(指定为研究的第1天)，将动物分选至各组中(n＝8)，个别肿瘤体积为108至172mm3，并且组平均肿瘤体积为129mm3。
在研究的第1天，经由尾静脉注射以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。
每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到1000mm3的终点体积时或研究结束时(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。研究在第60天结束。
结果在图3中示出。
实施例5-卵巢癌PDX模型CTG-0703体内功效研究
开始给药时雌性无胸腺Nude-Foxn1nu(Envigo；Indianapolis，IN，USA)为至少8周龄，体重为约20克。将来自PDX模型CTG-0703的肿瘤细胞植入储备小鼠(Stock mice)。
在肿瘤达到1000-1500mm3后，收获它们并且将肿瘤碎片皮下植入雌性研究小鼠的左侧。每只动物都植入特定的传代批次(第7代)并且记录。
使用数显卡尺每周监测两次肿瘤生长，并且使用式(0.52×[长度×宽度2])计算肿瘤体积(TV)。
当TV达到约150-300mm3时，将动物按肿瘤尺寸相匹配并且分配至媒介物对照组(n＝8)或治疗组(n＝8)中，并且在第0天开始给药。以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)。
在第0天开始给药后，使用数字天平每周对动物称重两次，并且每周测量两次TV，并且在研究的最后一天或在对垂死动物实施安乐死的当天进行测量。
当媒介物对照组中的平均肿瘤体积达到约1500mm3时或直至第49天时(以先发生者为准)终止研究。将肿瘤尺寸>1700mm3的个别动物从研究中移除并且实施安乐死。
结果在图4中示出。
实施例6-4个其他卵巢癌PDX模型中的体内功效研究
PDX模型CTG-0252方法学研究
在给药开始时雌性无胸腺小鼠(Nude-Foxn1nu，Envigo)为至少6-8周龄，体重为至少18克。将每只小鼠在左侧皮下(s.c.)植入肿瘤碎片(约5×5×5mm3)。使用数显卡尺每周监测两次肿瘤生长，并且使用式(0.52×[长度x宽度2])计算肿瘤体积(TV)。
当TV达到约100-200mm3(平均组TV 200mm3)时，将动物按肿瘤尺寸相匹配并且随机化至媒介物对照组和治疗组中(n＝5/组)。在研究的第0天，开始给药；经由尾静脉注射以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到2000mm3的终点体积时或研究结束时(第58天)(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。
结果在图5A中示出。
PDX模型CTG-1086方法学研究
在给药开始时雌性无胸腺小鼠(Nude-Foxn1nu，Envigo)为至少6-8周龄，体重为至少18克。将每只小鼠在左侧皮下(s.c.)植入肿瘤碎片(约5×5×5mm3)。使用数显卡尺每周监测两次肿瘤生长，并且使用式(0.52×[长度×宽度2])计算肿瘤体积(TV)。
当TV达到约100-200mm3(平均组TV 140mm3)时，将动物按肿瘤尺寸相匹配并且随机化至媒介物对照组和治疗组中(n＝5/组)。在研究的第0天，开始给药；经由尾静脉注射以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到2000mm3的终点体积时或研究结束时(第61天(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。
结果在图5B中示出。
PDX模型CTG-0711方法学研究
在给药开始时雌性无胸腺小鼠(Nude-Foxn1nu，Envigo)为至少6-8周龄，体重为至少18克。将每只小鼠在左侧皮下(s.c.)植入肿瘤碎片(约5×5×5mm3)。使用数显卡尺每周监测两次肿瘤生长，并且使用式(0.52×[长度×宽度2])计算肿瘤体积(TV)。
当TV达到约100-200mm3(平均组TV 148mm3)时，将动物按肿瘤尺寸相匹配并且随机化至媒介物对照组和治疗组中(n＝5/组)。在研究的第0天，开始给药；经由尾静脉注射以单次注射(qd x 1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到2000mm3的终点体积时或研究结束时(第63天)(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。
结果在图5C中示出。
PDX模型CTG-1423方法学研究
在给药开始时雌性无胸腺小鼠(Nude-Foxn1nu，Envigo)为至少6-8周龄，体重为至少18克。将每只小鼠在左侧皮下(s.c.)植入肿瘤碎片(约5×5×5mm3)。使用数显卡尺每周监测两次肿瘤生长，并且使用式(0.52×[长度×宽度2])计算肿瘤体积(TV)。
当TV达到约100-200mm3(平均组TV 204mm3)时，将动物按肿瘤尺寸相匹配并且随机化至媒介物对照组和治疗组中(n＝5/组)。在研究的第0天，开始给药；经由尾静脉注射以单次注射(qd×1)静脉内(i.v.)施用药物。给药体积为每20克体重0.2mL(10mL/kg)，并且针对每只个别动物的体重按比例调整。每周使用卡尺测量肿瘤两次，并且当肿瘤达到2000mm3的终点体积时或研究结束时(第55天)(以先到者为准)，对每只动物实施安乐死。
结果在图5D中示出。
缩写
Ac 乙酰基
Acm 乙酰氨基甲基
Alloc 烯丙氧基羰基
Boc 二碳酸二叔丁酯
t-Bu 叔丁基
Bzl 苯甲基，其中Bzl-OMe为甲氧基苯甲基并且Bzl-Me为甲基苯
Cbz或Z 苯甲基氧基-羰基，其中Z-Cl和Z-Br分别为氯苯甲基氧基羰基和溴苯甲基氧基羰基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
Dnp 二硝基苯基
DTT 二硫苏糖醇
Fmoc 9H-芴-9-基甲氧基羰基
imp N-10亚胺保护基团：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸-Val-Ala-PAB
MC-OSu 马来酰亚胺基己酰基-O-N-琥珀酰亚胺
Moc 甲氧基羰基
MP 马来酰亚胺基丙酰胺
Mtr 4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基
PAB 对氨基苯甲基氧基羰基
PEG 亚乙基氧基
PNZ 氨基甲酸对硝基苯甲酯
Psec 2-(苯基磺酰基)乙氧基羰基
TBDMS 叔丁基二甲基硅烷基
TBDPS 叔丁基二苯基硅烷基
Teoc 2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基
Tos 甲苯磺酰基
Troc 2,2,2-三氯乙氧基羰基氯
Trt 三苯甲基
Xan 呫吨基
序列表
<110> ADC治疗有限公司(ADC THERAPEUTICS SA)
免疫医疗有限公司(MEDIMMUNE LIMITED)
<120> 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
<130> P21119202WP
<150> GB 1908128.0
<151> 2019-06-07
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VH
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VL
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4重链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> Xaa = Asn297
<400> 3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4轻链
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VH CDR1
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VH CDR2
<400> 6
Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VH CDR3
<400> 7
Asp Pro Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VL CDR1
<400> 8
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VL CDR2
<400> 9
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4 VL CDR3
<400> 10
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4重链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> Xaa = Asn297
<400> 11
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 12
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人KAAG1 (Homo sapiens KAAG1)
<400> 12
Met Asp Asp Asp Ala Ala Pro Arg Val Glu Gly Val Pro Val Ala Val
1 5 10 15
His Lys His Ala Leu His Asp Gly Leu Arg Gln Val Ala Gly Pro Gly
20 25 30
Ala Ala Ala Ala His Leu Pro Arg Trp Pro Pro Pro Gln Leu Ala Ala
35 40 45
Ser Arg Arg Glu Ala Pro Pro Leu Ser Gln Arg Pro His Arg Thr Gln
50 55 60
Gly Ala Gly Ser Pro Pro Glu Thr Asn Glu Lys Leu Thr Asn Pro Gln
65 70 75 80
Val Lys Glu Lys
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4-L2 VL
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4-L2轻链
<400> 14
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4-K4 VL
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3A4-K4轻链
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (121)

1.一种式L-(DL)p的缀合物，其中DL具有式I或II：
Figure FDA0003397768520000011
其中：
L为结合至KAAG1的抗体(Ab)；
当C2’与C3’之间存在双键时，R12选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure FDA0003397768520000012
其中R21、R22以及R23中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure FDA0003397768520000013
其中R25a和R25b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure FDA0003397768520000021
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2'与C3'之间存在单键时，
R12为
Figure FDA0003397768520000022
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R26a和R26b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤基；
其中R和R'独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR'、硝基、Me3Sn以及卤基；
R″为C3-12亚烷基，所述链可由以下间断开：一个或多个杂原子，例如O、S；NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)；和/或芳族环，例如苯或吡啶；
Y和Y'选自O、S或NH；
R6'、R7'、R9'分别选自与R6、R7以及R9相同的基团；
[式I]
RL1'为用于连接至所述抗体(Ab)的接头；
R11a选自OH、其中RA为C1-4烷基的ORA以及SOzM，其中z为2或3并且M为一价的药学上可接受的阳离子；
R20和R21一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R20选自H和RC，其中RC为封端基团；
R21选自OH、ORA以及SOzM；
当C2与C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)任选由一个或多个选自包含以下的组的取代基取代的C5-10芳基：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure FDA0003397768520000031
其中R11、R12以及R13中的每一者独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基，其中R2基团中的碳原子总数不超过5；
(ie)
Figure FDA0003397768520000032
其中R15a和R15b中的一者为H并且另一者选自：苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；并且
(if)
Figure FDA0003397768520000033
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选由选自卤基、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2与C3之间存在单键时，
R2为
Figure FDA0003397768520000034
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选由选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团取代；或当R16a和R16b中的一者为H时，另一者选自腈和C1-4烷基酯；
[式II]
R22具有式IIIa、式IIIb或式IIIc：
(a)
Figure FDA0003397768520000041
其中A为C5-7芳基，并且
(i)Q1为单键，并且Q2选自单键和-Z-(CH2)n-，其中Z选自单键、O、S以及NH，并且n为1至3；或
(ii)Q1为-CH＝CH-，并且Q2为单键；
(b)
Figure FDA0003397768520000042
其中：
RC1、RC2以及RC3独立地选自H和未取代的C1-2烷基；
(c)
Figure FDA0003397768520000043
其中Q选自O-RL2'、S-RL2'以及NRN-RL2'，并且RN选自H、甲基以及乙基；
X选自包含以下的组：O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、CO-RL2’、NH-C(＝O)-RL2’、NHNH-RL2’、CONHNH-RL2’、
Figure FDA0003397768520000044
NRNRL2’，其中RN选自包含H和C1-4烷基的组；
RL2’为用于连接至所述抗体(Ab)的接头；
R10和R11一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R10为H并且R11选自OH、ORA以及SOzM；
R30和R31一起形成它们所结合的氮原子与碳原子之间的双键；或
R30为H，并且R31选自OH、ORA以及SOzM。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物不为：
ConjA
Figure FDA0003397768520000051
ConjB
Figure FDA0003397768520000052
ConjC：
Figure FDA0003397768520000053
ConjD
Figure FDA0003397768520000054
或
ConjE：
Figure FDA0003397768520000061
3.根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中R7选自H、OH以及OR。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其中R7为C1-4烷氧基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中Y为O。
6.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中R”为C3-7亚烷基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中R9为H。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中R6选自H和卤基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C5-7芳基。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中R12为苯基。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C8-10芳基。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的缀合物，其中R12带有一至三个取代基。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基以及甲基-苯硫基。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C1-5饱和脂族烷基。
15.根据权利要求16所述的化合物，其中R12为甲基、乙基或丙基。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为C3-6饱和环烷基。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中R12为环丙基。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000071
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述R12基团中的碳原子总数不超过4。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述R12基团中的碳原子总数不超过3。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的缀合物，其中R21、R22以及R23中的一者为H，并且另外两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
22.根据权利要求18至20中任一项所述的缀合物，其中R21、R22以及R23中的两者为H，并且另一基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
23.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000072
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中R12为以下基团：
Figure FDA0003397768520000081
25.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在双键，并且R12为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000082
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中R24选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
27.根据权利要求26所述的缀合物，其中R24选自H和甲基。
28.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure FDA0003397768520000083
并且R26a与R26b均为H。
29.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure FDA0003397768520000084
并且R26a与R26b均为甲基。
30.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中在C2’与C3’之间存在单键，R12为
Figure FDA0003397768520000085
R26a和R26b中的一者为H，并且另一者选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基为任选取代的。
[式I]
31.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C5-7芳基。
32.根据权利要求31所述的缀合物，其中R2为苯基。
33.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R1为C8-10芳基。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的化合物，其中R2带有一至三个取代基。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟基、氯基、氰基、双氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基以及甲基-苯硫基。
36.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C1-5饱和脂族烷基。
37.根据权利要求36所述的缀合物，其中R2为甲基、乙基或丙基。
38.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C3-6饱和环烷基。
39.根据权利要求38所述的缀合物，其中R2为环丙基。
40.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000091
41.根据权利要求40所述的缀合物，其中所述R2基团中的碳原子总数不超过4。
42.根据权利要求41所述的缀合物，其中所述R2基团中的碳原子总数不超过3。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的缀合物，其中R11、R12以及R13中的一者为H，并且另外两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
44.根据权利要求40至42中任一项所述的缀合物，其中R11、R12以及R13中的两者为H，并且另一基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
45.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000101
46.根据权利要求45所述的缀合物，其中R2为以下基团：
Figure FDA0003397768520000102
47.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为具有下式的基团：
Figure FDA0003397768520000103
48.根据权利要求48所述的缀合物，其中R14选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
49.根据权利要求48所述的缀合物，其中R14选自H和甲基。
50.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0003397768520000104
并且R16a与R16b均为H。
51.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0003397768520000105
并且R16a与R16b均为甲基。
52.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0003397768520000106
R16a和R16b中的一者为H，并且另一者选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基为任选取代的。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的缀合物，其中R11a为OH。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的缀合物，其中R21为OH。
55.根据权利要求1至53中任一项所述的缀合物，其中R21为OMe。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的缀合物，其中R20为H。
57.根据权利要求1至55中任一项所述的缀合物，其中R20为RC。
58.根据权利要求57所述的缀合物，其中RC选自由以下组成的组：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
59.根据权利要求57所述的缀合物，其中RC为以下基团：
Figure FDA0003397768520000111
其中星号表示与N10位置的连接点，G2为末端基团，L3为共价键或可裂解接头L1，L2为共价键或与OC(＝O)一起形成自分解接头。
60.根据权利要求60所述的缀合物，其中G2为Ac或Moc，或选自由以下组成的组：Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz以及PNZ。
61.根据权利要求1至53中任一项所述的缀合物，其中R20和R21一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
[式II]
62.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa，并且A为苯基。
63.根据权利要求1至30和权利要求63中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIa，并且Q1为单键。
64.根据权利要求63所述的缀合物，其中Q2为单键。
65.根据权利要求63所述的缀合物，其中Q2为-Z-(CH2)n-，Z为O或S，并且n为1或2。
66.根据权利要求1至30和权利要求63中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa，并且Q1为-CH＝CH-。
67.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIb，
并且RC1、RC2以及RC3独立地选自H和甲基。
68.根据权利要求68所述的缀合物，其中RC1、RC2以及RC3全部为H。
69.根据权利要求68所述的缀合物，其中RC1、RC2以及RC3全部为甲基。
70.根据权利要求1至30和权利要求63至70中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIa或式IIIb，并且X选自O-RL2’、S-RL2’、CO2-RL2’、-N-C(＝O)-RL2’以及NH-RL2’。
71.根据权利要求71所述的缀合物，其中X为NH-RL2’。
72.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIc，并且Q为NRN-RL2’。
73.根据权利要求73所述的缀合物，其中RN为H和甲基。
74.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中R22具有式IIIc，并且Q为O-RL2’或S-RL2’。
75.根据权利要求1至30和权利要求63至75中任一项所述的缀合物，其中R11为OH。
76.根据权利要求1至30和权利要求63至75中任一项所述的缀合物，其中R11为OMe。
77.根据权利要求1至30和权利要求63至77中任一项所述的缀合物，其中R10为H。
78.根据权利要求1至30和权利要求63至75中任一项所述的缀合物，其中R10和R11一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
79.根据权利要求1至30和权利要求63至79中任一项所述的缀合物，其中R31为OH。
80.根据权利要求1至30和权利要求63至79中任一项所述的缀合物，其中R31为OMe。
81.根据权利要求1至30和权利要求63至81中任一项所述的缀合物，其中R30为H。
82.根据权利要求1至30和权利要求63至79中任一项所述的缀合物，其中R30和R31一起在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成双键。
83.根据权利要求1至83中任一项所述的缀合物，其中R6’、R7’、R9’以及Y’与R6、R7、R9以及Y相同。
84.根据权利要求1至84中任一项所述的缀合物，其中L-RL1’或L-RL2’为以下基团：
Figure FDA0003397768520000131
其中星号表示与所述PBD的连接点，Ab为抗体，L1为可裂解接头，A为将L1连接至所述抗体的连接基团，L2为共价键或与-OC(＝O)-一起形成自分解接头。
85.如权利要求85所述的缀合物，其中L1为酶可裂解的。
86.如权利要求85或权利要求86所述的缀合物，其中L1包含氨基酸的连续序列。
87.如权利要求87所述的缀合物，其中L1包含二肽，并且二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，
-Trp-Cit-。
88.根据权利要求88所述的缀合物，其中二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-。
89.根据权利要求89所述的缀合物，其中二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-、-Val-Ala-或-Val-Cit-。
90.根据权利要求88至90中任一项所述的缀合物，其中所述基团X2-CO-连接至L2。
91.根据权利要求88至91中任一项所述的缀合物，其中基团NH-X1-连接至A。
92.根据权利要求88至92中任一项所述的缀合物，其中L2与OC(＝O)一起形成自分解接头。
93.根据权利要求93所述的缀合物，其中C(＝O)O和L2一起形成以下基团：
Figure FDA0003397768520000141
其中星号表示与所述PBD的连接点，波浪线表示与所述接头L1的连接点，Y为NH、O、C(＝O)NH或C(＝O)O，并且n为0至3。
94.根据权利要求94所述的缀合物，其中Y为NH。
95.根据权利要求94或权利要求95所述的缀合物，其中n为0。
96.根据权利要求95所述的缀合物，其中L1和L2与-OC(＝O)-一起构成选自以下的基团：
Figure FDA0003397768520000151
其中星号表示与所述PBD的连接点，并且波浪线表示与所述接头L1的其余部分的连接点或与A的连接点。
97.根据权利要求97所述的缀合物，其中波浪线表示与A的连接点。
98.根据权利要求85至98中任一项所述的缀合物，其中A为：
(i)
Figure FDA0003397768520000152
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与所述抗体的连接点，并且n为0至6；或
(ii)
Figure FDA0003397768520000153
其中星号表示与L1的连接点，波浪线表示与所述抗体的连接点，n为0或1，并且m为0至30。
99.根据权利要求1所述的缀合物，所述缀合物具有式ConjA：
Figure FDA0003397768520000161
ConjB：
Figure FDA0003397768520000162
ConjC：
Figure FDA0003397768520000163
ConjD：
Figure FDA0003397768520000164
或ConjE：
Figure FDA0003397768520000171
100.根据权利要求1至100中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VH CDR3；
任选地，其中所述VH结构域具有根据SEQ ID NO:1的序列。
101.根据权利要求1至101中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含：
VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR1、氨基酸序列为SEQID NO:9的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:10的VL CDR3。
102.根据权利要求1至102中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的序列。
103.根据权利要求1至102中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2的序列。
104.根据权利要求1至104中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:3的序列的重链。
105.根据权利要求1至104中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的序列的重链。
106.根据权利要求1至106中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列的轻链。
107.根据权利要求1至106中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:4的序列的轻链。
108.根据权利要求1至108中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完整抗体。
109.根据权利要求1至109中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为人源化的、去免疫的或表面重塑的。
110.根据权利要求1至108中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完全人单克隆IgG1抗体，优选为IgG1,κ。
111.根据权利要求1至111中任一项所述的缀合物，其中药物(D)相对于抗体(Ab)的药物负载量(p)为1至约8的整数。
112.根据权利要求112所述的缀合物，其中p为1、2、3或4。
113.根据权利要求112所述的缀合物，所述缀合物包含抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体-药物缀合物化合物的所述混合物中每个抗体的平均药物负载量为约2至约5。
114.根据权利要求1至114中任一项所述的缀合物，所述缀合物用于疗法中。
115.根据权利要求1至114中任一项所述的缀合物，所述缀合物用于治疗受试者的增殖性疾病。
116.根据权利要求116所述的缀合物，其中所述疾病为癌症。
117.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至114中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
118.如权利要求118所述的药物组合物，所述药物组合物还包含治疗有效量的化学治疗剂。
119.根据权利要求1至114中任一项所述的缀合物在用于治疗受试者的增殖性疾病的药剂的制备中的用途。
120.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用权利要求118所述的药物组合物。
121.如权利要求121所述的方法，其中为所述患者施用化学治疗剂与所述缀合物的组合。
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