CN114371136A - 一种金纳米团簇-多肽传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金纳米团簇‑多肽传感器及其制备方法和应用，属于生物化学、环境检测和食品安全技术领域；本发明中，在GO表面修饰巯基得到具有配合基团的多孔材料GO‑SH，然后将GO‑SH与金纳米粒子结合，得到具有Au‑S键的GO与金纳米粒子的混合物1，接着将混合物1与能够凝乳蛋白酶特异性切割的多肽序列结合，得到金纳米团簇‑多肽传感器；所述金纳米团簇‑多肽传感器能够用于胰凝乳蛋白酶的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物化学、环境检测和食品安全技术领域，具体涉及一种金纳米团簇-多肽传感器及其制备方法和应用。
背景技术
多肽由天然或合成的氨基酸短聚合物形成，通过肽键连接，其长度短于蛋白质的长度。由于多肽与蛋白质具有相同的结构单元，具有特定序列的多肽可以在生物分析中替代蛋白质。具有特定序列的多肽可以通过筛选和优化人工多肽文库获得，其可以为特定分析物提供高亲和力的结合位点。此外，其还具有稳定性高、合成方案标准、易于修饰和大化学通用性等诸多优点。目前，因为多肽具有抗变性、获取简单、特异性、成本效益、标准合成方案、可及性、易于修饰、多功能性和化学多功能性、随机文库中的化学组合和选择的稳定性等优点，其被用作生物传感中的识别元素。
胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1)是最常见的丝氨酸蛋白酶之一，参与许多生理过程，包括饮食蛋白质的消化、坏死和细胞凋亡。胰凝乳蛋白酶还存在于各种疾病的发病机理中，例如胰腺纤维化、消化不良、糖尿病、高血压、炎症和许多类型的癌症，特别是胰腺癌。并且，由于胰凝乳蛋白酶本身是用于减少感染和手术等情况相关的发红、肿胀或损害的药物，胰凝乳蛋白酶活性的检测显得非常重要。因此，胰凝乳蛋白酶可靠且灵敏的检测方法对于胰腺功能测试是十分重要的。目前，主要通过高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)等传统方法来检测胰凝乳蛋白，上述方法虽然灵敏且准确，但其需要特定的设备，不适用于现场分析。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种金纳米团簇-多肽传感器及其制备方法和应用。本发明中，在GO表面修饰巯基得到具有配合基团的多孔材料GO-SH，然后将GO-SH与金纳米粒子结合，得到具有Au-S键的GO与金纳米粒子的混合物1，接着将混合物1与能够凝乳蛋白酶特异性切割的多肽序列结合，得到金纳米团簇-多肽传感器；所述金纳米团簇-多肽传感器能够用于胰凝乳蛋白酶的检测。
本发明中首先提供了一种金纳米团簇-多肽传感器，所述金纳米团簇-多肽传感器中包括疏基修饰的石墨烯氧化物、金纳米粒子和多肽；所述多肽为RRHFFGC。
本发明中还提供了上述金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)GO-SH溶液的制备：
使用GO纳米材料制备GO-NH2溶液；
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以15min的间隔时间分别加入3-氨基-3-甲基-1-丁炔(MPA)溶液中，在室温下剧烈涡旋0.5h，随后使用磷酸盐缓冲盐液调节该溶液的pH；接着向溶液中加入GO-NH2溶液，并在室温下剧烈涡旋2h、离心、洗涤，然后分散在Tween 20中，得到GO-SH溶液。
其中，GO-NH2溶液的制备方法为：将1g GO与300mL无水乙醇超声混合均匀，然后加入10mL乙氧基硅烷，水浴加热至70℃并回流4小时，离心，干燥，得到GO-NH2，将GO-NH2分散在高纯水中备用。
其中，GO-NH2溶液的浓度为2mg/mL，用量为20μL；所述EDC的浓度为32mM，NHS的浓度为80mM，MPA的浓度为0.8mM；所述EDC,NHS和MPA的体积比为1:1:4。
其中，所述pH调节为7.2～7.4；所述Tween-20的体积浓度百分比为0.01％。
(2)金纳米团簇-多肽传感器的制备：
将GO-SH溶液与Au NPs混合反应，然后加入多肽溶液混合反应，得到所述金纳米团簇-多肽传感器。
其中，GO-SH溶液的浓度为40μg/mL；所述Au NPs的终浓度为5nM，反应温度为4℃，反应时长为12h；所述多肽的终浓度为100ng/mL，反应温度为4℃，反应时长为12h。
本发明中还提供了上述金纳米团簇-多肽传感器在检测胰凝乳蛋白酶中的应用。
其中，所述应用为向金纳米团簇-多肽传感器中加入胰凝乳蛋白酶进行反应，测定其吸光度，并绘制成标准曲线。
其中，所述胰凝乳蛋白酶的浓度为10pg/mL～100ng/mL，反应条件为常温下反应2h；所述金纳米团簇-多肽传感器和胰凝乳蛋白酶的体积比为400μL:1.5～3μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中采用的石墨烯氧化物纳米材料易于获得，方法简单、成本低，性质稳定。本发明中通过在GO表面进行硫醇化修饰得到具有配合基团的多孔材料GO-SH，它的共价改性可显著提高结合效率。而纳米粒子独特的光学特性，是它成为无标记检测元件的重要因素。金纳米粒子的制备方法成熟，稳定不易变性，成本较低且操作简单，可与其他分子相互作用。
本发明中制备得到的金纳米团簇-多肽传感器无需进行荧光标记，极大地降低了背景信号，具有较好的发展和应用前景。并且，其具有原理简单，操作方便，省时省力的优势，仅仅根据加入胰凝乳蛋白酶前后吸光度的变化即可实现对胰凝乳蛋白酶的检测，为环境及食品安全等领域检测胰凝乳蛋白酶带来了极大的便利。
其次，由于巯基可与金纳米颗粒(Au NPs)发生Au-S键的共价结合，加入5nM的AuNPs后使得二者结合。加入多肽序列后，多肽一端带有的巯基可以和Au NPs结合，使得吸光度发生变化。再加入胰凝乳蛋白酶进行切割，多肽序列游离在体系里，吸光度再次发生变化，基于两次的吸光度变化对凝乳蛋白酶进行检测，测得结果表明0-1ng/mL的胰凝乳蛋白酶引起的吸光度增长率与胰凝乳蛋白酶浓度呈明显的线性关系，其线性回归方程表达为:y＝1.7215x+0.1349，R2＝0.9809。基于3S/N公式，计算检测限(LOD)为1.428pg/mL。
该方法在GO表面做了创新性修饰，自制了创新材料，使得检测的灵敏性和选择性都相对较高，且不仅局限于对胰凝乳蛋白酶的检测，还可以为小分子、蛋白质、DNA、RNA等检测提供了一种新型手段和实验基础。
附图说明
图1为本发明检测胰凝乳蛋白酶的技术路线图。
图2为GO、GO-NH2和GO-SH溶液的FT-IR光谱图。
图3为不同浓度多肽溶液在反应环境中的吸光强度变化图。
图4为不同浓度GO-SH对应的吸光度的变化图。
图5为不同浓度胰凝乳蛋白酶对应的吸光度的变化图，其中插图为其0-1ng/mL的胰凝乳蛋白酶引起的吸光度增长率与胰凝乳蛋白酶浓度的线性关系。
图6为多肽的选择性图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
(1)GO-SH溶液的制备：
用GO纳米材料制备GO-NH2溶液(2mg/mL)，备用；
向250μL浓度为0.8mM的MPA中加入EDC(62.5μL，32mM)在室温下保持剧烈涡旋15min，然后加入NHS(62.5μL，80mM)室温下保持剧烈涡旋，接着加入500μL 1M磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，0.15M NaCl，pH 7.32)将溶液的pH值调节至7.2-7.4。向调节好pH的溶液中添加20μL GO-NH2(2mg/mL)溶液，并在剧烈涡旋下于室温保持2h。然后将所得溶液以2000g离心5min，并用1mL 0.01％Tween-20(超纯水配制)洗涤，重复两次，最后分散在20μL 0.01％Tween 20中，制得的GO-SH溶液备用。
(2)金纳米团簇-多肽传感器的制备：
将GO-SH溶液与终浓度为5nM的Au NPs在4℃下反应过夜，总体系为400μL。再向其中分别加入终浓度为100ng/mL的多肽溶液，4℃下反应12h。然后12000rpm离心20min，去上清，定容至400μL，测量吸光度。
图2为GO-SH的FT-IR光谱图。从图中可以看出，GO-SH在2550cm-1处出现微弱峰，这归因于C＝O拉伸羧基，图中表明GO-SH已成功制备。
实施例2：
本实施例中向实施例1制备得到的金纳米团簇-多肽传感器中加入一定浓度的胰凝乳蛋白酶，在37℃下反应2h后测量吸光度，查看吸光度情况。
将40μg/mL的GO-SH溶液与5nM的Au NPs 4℃下过夜培育，总体系为400μL。再向其中分别加入终浓度为100ng/mL的多肽溶液，4℃下12h培育。后12000rpm离心20min，去上清，再定容至400μL，测得此时的吸光度为A0。然后分别加入不同浓度的胰凝乳蛋白酶(10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL)，在37℃下反应2h后测量吸光度为A，通过吸光度增长率A/A0-1，计算不同浓度的GO-SH下各自的吸光度增长率，结果如图5所示。
图5为不同浓度胰凝乳蛋白酶对应的吸光度的变化图，其中插图为其0-1ng/mL的胰凝乳蛋白酶引起的吸光度增长率与胰凝乳蛋白酶浓度的线性关系。从图中可以看出，体系中加入胰凝乳蛋白酶后，吸光度会随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加而增加。加入低浓度的胰凝乳蛋白酶时，吸光度增长率呈线性增长，后随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加逐渐增强，直至趋于缓慢甚至相对稳定。根据其结果可得出0-1ng/mL的胰凝乳蛋白酶引起的吸光度增长率与胰凝乳蛋白酶浓度呈明显的线性关系，其线性回归方程表达为:y＝1.7215x+0.1349，R2＝0.9809。基于3S/N公式，计算检测限(LOD)为1.428pg/mL。
实施例3：
本实施例中通过向反应体系中添加终浓度分别为50、100、150、200和250ng/mL的多肽溶液，其他条件不变，来选择多肽溶液的最佳浓度，具体考察方法如下所示。
向体系中分别加入终浓度为50、100、150、200和250ng/mL的多肽溶液，其他步骤参照实施例1，测得的吸光度为A0。然后统一加入100ng/mL的胰凝乳蛋白酶，在37℃下反应2h后测量吸光度为A，比较不同浓度多肽对应的吸光度的变化A/A0-1。
图3为不同浓度多肽溶液在反应环境中的吸光强度变化图。从图中可以看出，浓度50-100ng/mL的多肽溶液在反应环境中随着多肽溶液浓度增大，吸光度的变化A/A0-1也逐渐增大，但多肽溶液浓度在100ng/mL继续增加时，吸光度的变化A/A0-1逐渐减小，故多肽溶液最佳浓度为100ng/mL，因此最终选择100ng/mL的多肽浓度。
实施例4：
本实施例中通过向反应体系中添加终浓度分别为10、20、30、40和50μg/mL的GO-SH溶液，其他条件不变，来选择GO-SH溶液的最佳浓度，具体考察方法如下所示。
将不同浓度的GO-SH溶液(10、20、30、40和50μg/mL)加入体系中，其他步骤参照实施例1，测得的吸光度为A0。然后统一加入100ng/mL的胰凝乳蛋白酶，在37℃下反应2h后测量吸光度为A，比较不同浓度GO-SH对应的吸光度的变化A/A0-1.
图4为不同浓度GO-SH对应的吸光度的变化图。从图中可以看出，在GO-SH浓度为40ug/mL时吸光度的变化最大，因此最终选择40μg/mL的GO-SH溶液。
实施例5：
本实施例中采用实施例1中所述的步骤向体系中加入40μg/mL的GO-SH溶液、5nM的Au NPs、终浓度为100ng/mL的多肽溶液制备得到金纳米团簇-多肽传感器，并测得其吸光度为A0。然后分别加入不同浓度的胰凝乳蛋白酶(10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL)，在37℃下反应2h后测量吸光度为A，比较不同浓度胰凝乳蛋白酶对应的吸光度的变化A/A0-1。
从图5的插图中可以看出，体系中加入胰凝乳蛋白酶后，吸光度会随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加而增加。加入低浓度的胰凝乳蛋白酶时，吸光度增长率呈线性增长，后随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加逐渐增强，直至趋于缓慢甚至相对稳定。
实施例6：
选择几种与待测物胰凝乳蛋白酶相近的类似物(Chymotrypsin、IgG、VEGF、Thrombin、BSA和Lysozyme)在相同体系下评估该传感器的选择性，为了证明该传感器对胰凝乳蛋白酶具有特异性，进行了选择性实验检测。将40μg/mL的GO-SH溶液与5nM的Au NPs 4℃下过夜培育，总体系为400μL。再向其中分别加入终浓度为100ng/mL的多肽溶液，4℃下12h培育。后12000rpm离心20min，去上清，再定容至400μL，测得此时的吸光度为A0。之后分别加入同等浓度100ng/mL的牛血清白蛋白(BSA)、凝血酶(Thrombin)、溶菌酶(Lysozyme)、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)，37℃下反应2h，测得此时的吸光度为A。计算出吸光度增长率如图6所示。100ng/mL的胰凝乳蛋白酶引起的吸光度增长率与其他三种类似物有明显的区分，表明该传感器具有较好的选择性。
图6为100ng/mL的牛血清白蛋白、凝血酶、溶菌酶、胰凝乳蛋白酶各自引起的吸光度增长率。
为了验证该传感器的实际应用价值及其稳定性，选出三种浓度的胰凝乳蛋白酶(10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL)在血清中进行实验。将传感器中的超纯水换成血清，每组实验重复三次，其结果如下表1所示。回收率范围是93.129％-115.397％，相对标准偏差控制在1.374％-3.280％，表明该传感器在实际检测中依然具有分析意义。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，包括：
(1)GO-SH溶液的制备：
使用GO纳米材料制备GO-NH2溶液；
将EDC和NHS分别加入MPA溶液中，在室温下剧烈涡旋，随后使用磷酸盐缓冲盐液调节该溶液的pH；接着向溶液中加入GO-NH2溶液，并在室温下剧烈涡旋、离心、洗涤，然后分散在Tween 20中，得到GO-SH溶液；
(2)金纳米团簇-多肽传感器的制备
将GO-SH溶液与Au NPs混合反应，然后加入多肽溶液混合反应，得到所述金纳米团簇-多肽传感器。
2.根据权利要求1所述的金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述GO-NH2溶液的浓度为2mg/mL，用量为20μL。
3.根据权利要求1所述的金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述EDC,NHS和MPA的体积比为1:1:4；
所述EDC的浓度为32mM，NHS的浓度为80mM，MPA的浓度为0.8mM。
4.根据权利要求1所述的金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pH调节为7.2～7.4；所述Tween-20的体积浓度百分比为0.01％。
5.根据权利要求1所述的金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，GO-SH溶液的终浓度为40μg/mL，所述Au NPs的终浓度为5nM；
GO-SH溶液与Au NPs混合反应的反应温度为4℃，反应时长为12h。
6.根据权利要求1所述的金纳米团簇-多肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多肽的终浓度为100ng/mL，加入多肽后的反应温度为4℃，反应时长为12h。
7.根据权利要求1～6任一项所述方法制备的金纳米团簇-多肽传感器，其特征在于，所述金纳米团簇-多肽传感器中包括疏基修饰的石墨烯氧化物、金纳米粒子和多肽；所述多肽为RRHFFGC。
8.权利要求7所述的金纳米团簇-多肽传感器在检测胰凝乳蛋白酶中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为向金纳米团簇-多肽传感器中加入胰凝乳蛋白酶进行反应，测定其吸光度，并绘制成标准曲线。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胰凝乳蛋白酶的浓度为10pg/mL～100ng/mL，反应条件为常温下反应2h；所述金纳米团簇-多肽传感器和胰凝乳蛋白酶的体积比为400μL:1.5～3μL。
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