CN109773203A - 一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇及应用,属于功能纳米材料的制备和应用技术领域。本发明利用一种新的天然酶蛋白‑大豆胰蛋白酶抑制剂(STI),在不添加任何还原剂和保护剂的情况下成功合成了STI‑AuNCs。这种新合成的STI‑AuNCs在689nm处显示出强烈的红色荧光发射,最高量子产率为32%;新合成的STI‑AuNCs可以应用于Hg2+的检测,检测限为0.71nM,且对Hg2+的选择性较高,能够肉眼观测到Hg2+对STI‑AuNCs的荧光猝灭现象,本发明合成方法简便、易操作,能够很好的应用在Hg2+的检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇及应用,属于功能纳米材料的制备和应用技术领域。
背景技术
在过去的几千年中,金已被广泛用于制造各种物品,如珠宝、钱币、金条和装饰物。金由于其光泽、金黄色、柔软、珍贵及其化学惰性的特点,使得其最近成为了研究的热门领域,特别是在生物技术和生物医学领域。
与金纳米粒子(也称为金胶体)不同,金纳米团簇(AuNCs)的尺寸约为2纳米或更小,通常含有约数百个金原子。金纳米团簇中的纳米金原子使其具有了荧光发射特性,并提供了其作为传感和成像探针在体外和体内应用的可能性。荧光AuNCs还具有独特的物理和化学性质,如高荧光量子产率、超小尺寸、高溶解度,以及高稳定性、低毒性和良好的生物相容性。基于上述性质,AuNCs可用于生物医学领域中的生物传感、成像、标记和催化等作用,此外,高荧光AuNCs还可用于检测金属离子、蛋白质、核酸和小分子。
金纳米团簇(AuNCs)的合成方法有化学刻蚀法、溶剂热合成法、辐照法等,其中,化学刻蚀法、辐照法可能会对环境、植物和动物等造成危害,因此,研究人员更倾向于利用蛋白质、聚合物、树枝状大分子和谷胱甘肽等物质作为还原剂和封端剂,基于常温温和还原法用于制备AuNCs,常用的物质有牛血清白蛋白(BSA)、蛋白、胰蛋白酶、辣根过氧化物酶、胃蛋白酶、溶菌酶、胰岛素、人转铁蛋白和乳铁蛋白等,。
在已报道的合成模板中,由于蛋白质分子量大,保护基团多,以蛋白为模板的AuNCs通常具有非常好的稳定性,被认为是理想的合成配体。但是目前报道的蛋白合成AuNCs,亮度不高量子产率较低,限制了其应用。因此寻找一种合成更高量子产率的蛋白具有非常重要的意义。
胰蛋白酶抑制剂(STI)为58个氨基酸残基组成的碱性多肽,它能与多种蛋白酶的活动中心竞争一个赖氨酰基而抑制蛋白质的活性,会降低胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的生物活性,食用后会对动物和人类的健康产生不利影响,因此,胰蛋白酶抑制剂被认为是抗营养因子。
汞(Hg)是一种天然存在的元素,存在于空气、土壤和水中,是生物系统中具有生物累积特性的有毒排放污染物之一,它通常以不同的化学形式存在:金属汞,无机汞或汞盐和有机汞。汞的过量摄入可能通过与蛋白质和氨基磷脂中的巯基相互作用,从而对中枢神经系统、内分泌系统、大脑甚至肾脏造成不利的健康影响。因此,灵敏检测Hg2+对于防止过量摄入有重要意义,并且视觉检测在实际应用中更为有利。
发明内容
[技术问题]
为了解决现有技术中蛋白为模板制备得到的AuNCs的量子产率较低且AuNCs检测Hg2+的灵敏度低的问题。
[技术方案]
本发明采用了新的天然酶蛋白质STI合成AuNCs,合成得到的AuNCs在最大激发波长和发射波长分别为513nm和689nm的条件下,AuNCs具有红色强烈荧光,量子产率(QY)高达32%。
本发明的具体技术方案为:一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,以胰蛋白酶抑制剂为合成模板,与HAuCl4反应合成得到金纳米簇。
在本发明的一种实施方式中,所述方法为:将0.005-0.05M HAuCl4的水溶液加入到含有20~50mg/mL的胰蛋白酶抑制剂水溶液中,混合均匀,加入碱液调节溶液的pH值至8.0-10.0,将混合溶液在25-45℃下反应2~24小时即可。
在本发明的一种实施方式中,所述HAuCl4和胰蛋白酶抑制剂的比例为0.2-0.5mol/g。
在本发明的一种实施方式中,所述溶液混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的深棕色。
在本发明的一种实施方式中,所述胰蛋白酶抑制剂的浓度优选为30~50mg/L。
在本发明的一种实施方式中,所述混合的过程是在500-1000rpm的转速下搅拌5-20min。
在本发明的一种实施方式中,所述pH值优选为10.0。
在本发明的一种实施方式中,所述反应时间优选为20h。
在本发明的一种实施方式中,所述碱液为NaOH或KOH溶液,所述碱液的浓度为0.5-2.0M。
在本发明的一种实施方式中,所述反应过程中需要搅拌,搅拌转速为50-200rpm。
在本发明的一种实施方式中,所述胰蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了上述合成得到的金纳米簇STI-AuNCs。
本发明还提供了STI-AuNCs在检测Hg2+中的应用。
本发明取得的有益技术效果:
(1)本发明合成得到的STI-AuNCs在689nm处显示出强烈的红色荧光发射,其量子产率可达32%,远高于现有技术报道的10%左右的量子产率。
(2)本发明合成的STI-AuNCs可以应用于Hg2+的检测,其检测限为0.71nM,且对Hg2+具有较高的选择性,能够肉眼观测到Hg2+对STI-AuNCs的荧光猝灭现象,可以通过视觉检测Hg2+是否存在。
(3)本发明的STI-AuNCs的合成方法在室温下进行,且其合成过程中不需要额外的还原和保护剂即可成功合成,方法简单易操作。
附图说明
图1本发明合成得到的STI-AuNCs及其STI-AuNCs的Hg2+猝灭示意图。
图2实施例1合成得到的STI-AuNCs的TEM图像和STI-AuNCs的尺寸分布图。
图3实施例1合成得到的STI-AuNCs的吸收光谱和荧光光谱,(i)紫外可见吸收光谱;(ii)激发光谱图;(iii)发射光谱图。
图4(a)不同浓度的STI(20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml和50mg/ml)制备得到的STI-AuNCs荧光发射强度;(b)不同反应时间(0-24h)下制备得到的STI-AuNCs的荧光发射强度。
图5三种缓冲液(Tris,HEPES和PBS)作为检测Hg2+的溶剂时,Hg2+水溶液的荧光发射强度,其中,Hg2+水溶液的浓度为0.05μM。
图6(a)在λex max=513nm处,含有0.05μM的Hg2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Pb2+、Fe3+、Co2+、Ni2+和Cu2+的STI-AuNCs的荧光强度发射强度;(b)不同的光照下,含有0.05μM不同金属离子的水溶液的STI-AuNCs的图像,其中,左为白光;右为302nm的紫外光。
图7(a)实施例1合成得到的STI-AuNCs的荧光强度发射,其中Hg2+的浓度范围为0μM至0.1μM,插入图显示荧光强度与浓度为0μM至0.04μM之间的Hg2+呈线性关系;(b)在302nm的紫外光(左)和白光(右)下,不同浓度(0μm至0.1μM)的Hg2+水溶液的STI-AuNCs的图像。
具体实施方式
试剂和材料:
大豆胰蛋白酶抑制剂购自Sigma-Aldrich贸易有限公司(中国上海),CAS号:9035-81-8,分子量9kDa。四氯金酸三水合物(HAuCl4·3H2O)购中国医药化学试剂有限公司(上海)。Tris-Buffer、PBS、HEPES(C8H18N2O4S)和氢氧化钠(NaOH)购自中国上海国药化学试剂有限公司。从Milli-Q A10过滤系统(Millipore,Billerica,MA,USA)中收集超蒸馏水,并在整个实验过程中使用,其他化学物质都是分析级的。
仪器:
荧光测量在日本京都岛津公司的RF-6000上进行的,最大激发波长为513nm;荧光成像在Tanon 5200(中国上海)多红外紫外灯(302nm)下进行;水溶液在龙实验室仪器有限公司(中国北京)的涡流混合器MX-F上充分混合;通过JEOL JEM-2100HR(JEOL,Tokyo,Japan)在200kV的加速电压下检查透射电子显微镜(TEM)图像。
实施例1
将HAuCl4(0.01M,5mL)加入到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(30mg/mL)的5mL水溶液中,1000rpm下剧烈搅拌10分钟,在votex混合器上形成均匀溶液;然后加入氢氧化钠(NaOH,1M)以将溶液混合物的pH值调节至10,将混合溶液在37℃下温和搅拌(120rpm)反应20小时,反应混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的深棕色,即合成得到STI-AuNCs。
使用透射电镜分析STI-AuNCs的形态和粒径,结果如图2所示,可见,制备得到的STI-AuNCs均匀分布,呈球形,平均直径小于2.224nm。
图3为合成得到的STI-AuNCs的光谱图,可见,STI-AuNCs的最大激发和发射波长分别为513nm和689nm。
实施例2
将HAuCl4(0.01M,5mL)加入到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的5mL水溶液中,1000rpm下剧烈搅拌10分钟,然后加入氢氧化钠(NaOH,1M)以将溶液混合物的pH值调节至10,将混合溶液在37℃下温和搅拌(120rpm)反应20小时,反应混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的深棕色,即合成得到STI-AuNCs。
当大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的浓度为20mg/mL,40mg/mL和50mg/mL时,按照同样的方法合成得到STI-AuNCs,对其荧光强度进行测定,结果如图4(a)所示,可见,制备得到的STI-AuNCs的荧光发射强度随着STI浓度的增大呈现先增大后减小的趋势,当STI浓度为40mg/mL时,制备得到的STI-AuNCs溶液的荧光强度最高。与40mg/mL相比,30mg/mL产生的荧光发射没有显示出显著差异,因此,考虑到成本问题,优选的STI的浓度为30mg/mL。
实施例3
将HAuCl4(0.01M,5mL)加入到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(30mg/mL)的5mL水溶液中,1000rpm下剧烈搅拌10分钟,然后加入氢氧化钠(NaOH,1M)以将溶液混合物的pH值调节至10,将混合溶液在37℃下温和搅拌(120rpm)反应0~24小时,反应混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的深棕色,即合成得到STI-AuNCs。
反应时间间隔2h时监测混合溶液的荧光强度,结果如图4(b)所示,可见,当反应时间大于2h时,制备得到的STI-AuNCs的荧光强度明显增强,且当反应时间为20h时荧光强度最高。
实施例4
将HAuCl4(0.01M,5mL)加入到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(30mg/mL)的5mL水溶液中,800rpm下剧烈搅拌10分钟混合形成均匀溶液;加入氢氧化钠(NaOH,1M)以将溶液混合物的pH值调节至9,将混合溶液在30℃下温和搅拌(120rpm)反应20小时,反应混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的深棕色,即合成得到STI-AuNCs。
实施例5缓冲液对STI-AuNCs检测Hg2+的影响
使用Tris缓冲液(0.02M,pH 7)制备0.05μM的Hg2+水溶液,然后将制备的溶液与STI-AuNCs(50μL)以7:1的比例混合,荧光光谱记录在分光光度计上,实验分三次进行,记录平均荧光强度。
同时,分别用PBS或HEPES缓冲液(0.02M,pH 7)替代Tris缓冲液制备0.05μM的Hg2+水溶液,按照上述方法测定荧光强度,结果如图5所示。可见,与HEPES和PBS缓冲液相比,Tris缓冲液的荧光发射降低最多,可见,Hg2+在Tris缓冲液中与STI-AuNCs更容易发生荧光猝灭,因此,优选为Tris缓冲液作为检测Hg2+的溶剂。
实施例6
(1)STI-AuNCs检测Hg2+的选择性
采用合成的STI-AuNCs,测定了其对常见的金属离子的检测效果,所述的金属离子为Zn2+,Ca2+,Mg2+,Na+,K+,Pb2+,Fe3+,Co2+,Ni2+和Cu2+。
使用Tris缓冲液(0.02M,pH 7)分别制备浓度0.05μM的Zn2+,Ca2+,Mg2+,Na+,K+,Pb2 +,Fe3+,Co2+,Ni2+和Cu2+水溶液,然后将制备的金属离子水溶液与STI-AuNCs(50μL)以7:1的比例混合。荧光光谱记录在分光光度计RF-6000上,实验分三次进行,记录平均荧光强度。
图6a为在513nm的光照下,含有0.05μM不同金属离子的水溶液的STI-AuNCs的荧光强度发射强度,可见,Hg2+明显淬灭了STI-AuNCs的荧光强度,这是由Hg2+-Au+之间相互作用的高亲和力造成的,而其他金属离子对荧光AuNCs的猝灭作用很小或几乎没有。因此,可见,本发明制备得到的STI-AuNCs能够选择性的检测Hg2+是否存在。
图6b为不同的光照下,含有0.05μM不同金属离子的水溶液的STI-AuNCs的图像,其中,左为白光;右为302nm的紫外光。可以观察到,STI-AuNCs产生的红色荧光在与Hg2+相互作用时消失,而其他金属离子作用体系继续发出红色荧光,因此,用肉眼可以很容易地观察到本发明制备得到的STI-AuNCs对Hg2+的选择性。
(2)STI-AuNCs检测Hg2+的灵敏度
使用Tris缓冲液(0.02M,pH 7)制备不同浓度的Hg2+水溶液,然后将制备的Hg2+水溶液与STI-AuNCs(50μL)以7:1的比例混合。荧光光谱记录在分光光度计RF-6000上,最大激发为513nm。实验分三次进行,记录平均荧光强度。
图7a显示了STI-AuNCs检测不同浓度(从0μM到0.1μM)的含Hg2+水溶液的荧光强度,可见,随着Hg2+浓度增加,荧光强度呈稳定下降趋势。且,当Hg2+水溶液的浓度为0μM至0.04μM时,荧光强度和Hg2+浓度呈线性关系,y=-578242.45975x+33318.54163,R2=0.98933,Hg2+浓度的检测限为0.71nM。
图7b为STI-AuNCs检测不同浓度(从0μM到0.1μM)的含Hg2+水溶液在302nm UV和白光照射下的图像(从左到右,Hg2+水溶液的浓度逐渐增大),可以肉眼观测到其荧光强度的变化。
由此可见,本发明制备得到的STI-AuNCs对Hg2+的检测的选择性和灵敏性都非常高,可以用来检测Hg2+的存在和含量。
实施例7
量子产率测定采用参比法,罗丹明B的最大激发波长Ex=514nm,最大发射波长Em=590nm,水溶液中荧光量子产率为31%。测量过程中,首先使用紫外分光光度计测量待测纳米金簇和参比标准品的溶液分别在其最大吸光位置处的吸光度,吸光度要求小于0.05。接下来,测量待测纳米金簇AuNCs和参比标准品的荧光发射光谱的积分面积。之后根据荧光量子产率计算公式计算即可。荧光量子产率计算公式为:Yv=Ys*(Fv/Fs)*(As/Av)。其中,Ys表示罗丹明B的量子产率31%;v表示待测样;s表示标准品;F表示荧光积分面积;A表示紫外吸收强度。
以罗丹明B(水中QY=31%)作为参考标准,计算STI-AuNCs量子产率(QY)为32%。据我们所知,除了报道的非蛋白质稳定金属纳米团簇方法外,为目前已报道的最高量子产率,原高于现有技术中报道的10.5%。
实施例8
实际样品中Hg2+的检测:太湖水
湖水样品采集自江南大学附近的太湖(江苏无锡),通过0.45μm膜过滤样品以去除杂质颗粒。将预处理后的水样与0.02M Tris缓冲液(pH 7)(1:1)混合,并配成0μM至0.06μM不同浓度的Hg2+溶液,将上述制备的溶液进一步与STI-AuNCs溶液(50μL)按比例7:1混合,并在分光光度计上记录荧光光谱发射。
如表2所示,得到的的Hg2+回收率在133%和106%之间,RSD低于8.2%。随着Hg2+浓度的增加,回收率降低至100%,从而使AuNCs对Hg2+的存在敏感。
表2在0.03、0.04和0.05μM浓度下测定太湖水样中的Hg2+。
RSD:相对标准偏差。
对比例1
将HAuCl4(0.01M,5mL)加入到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(30mg/mL)的5mL水溶液中,1000rpm下剧烈搅拌10分钟混合形成均匀溶液;加入氢氧化钠(NaOH,1M)以将溶液混合物的pH值调节至7,然后将混合溶液在37℃下温和搅拌(120rpm)反应20小时,反应混合物的颜色从反应前的淡黄色变为反应后的棕色,即合成得到STI-AuNCs。
测定制备得到的STI-AuNCs的量子产率,其量子产率明显低于本发明的技术方案。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述方法为:以胰蛋白酶抑制剂为合成模板,与HAuCl4反应合成得到金纳米簇。
2.根据权利要求1所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,将0.005-0.05M HAuCl4的水溶液加入到含有20~50mg/mL的胰蛋白酶抑制剂水溶液中,混合均匀,加入碱液调节溶液的pH值至8.0-10.0,将混合溶液在25-45℃下反应2~24小时即可。
3.根据权利要求1或2所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述HAuCl4和胰蛋白酶抑制剂的比例为0.2-0.5mol/g。
4.根据权利要求1~3任一所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述反应时间为20h。
5.根据权利要求1~4任一所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述碱液为NaOH或KOH溶液,所述碱液的浓度为0.5-2.0M。
6.根据权利要求1~5任一所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述反应过程中需要搅拌,搅拌转速为50-200rpm。
7.根据权利要求1~6任一所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法,其特征在于,所述胰蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂。
8.权利要求1~7任一所述的一种以胰蛋白酶抑制剂为合成模板的金纳米簇的合成方法合成得到的金纳米簇STI-AuNCs。
9.权利要求8所述的金纳米簇STI-AuNCs检测Hg2+中的应用。
10.权利要求8所述的金纳米簇STI-AuNCs在生物技术和环境检测领域的应用。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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