CN114369119A - 一种青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种青蒿素‑哌嗪‑磷酰胺氮芥杂化物及其制备方法和应用。本发明具体公开了一种如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药。本发明通过将青蒿素衍生物与磷酰胺氮芥基团进行杂化获得一系列青蒿素‑哌嗪‑磷酰胺氮芥杂化物。通过实验证明，上述杂化物能够显著抑制多种癌细胞的生长，同时对多种正常细胞的毒性较小，从而成为潜在的广谱抗癌候选药物，因此具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症能够侵袭或扩散到身体的任何部位，是世界范围内一个重要的死亡原因。2018年，全球确诊的癌症病例1810万例，预计到2040年，这一数字将增至2940万例。根据世界卫生组织(WHO)2020年发布的一份关于癌症的报告估计，全球每6例死亡中就有1例是癌症导致的。在可用于治疗癌症的各种方法中，化疗是最常见的方法，包括使用化疗药物杀死癌细胞或通过各种机制阻止癌细胞生长。抗癌药物在癌症治疗中至关重要，目前已有100多种药物被批准用于临床治疗。然而，它们中的大多数已经发展出多药耐药性，并且伴随着致命的副作用和低特异性。因此，开发具有高活性和高治疗指标的新型抗癌药物仍然是当前工作的重点。
环磷酰胺是迄今为止合成的最成功的抗癌药物之一。它于1959年被美国食品和药物管理局批准用于临床，由于其具有广谱抗肿瘤和抗癌细胞增殖活性的优势，目前仍是常规临床实践中的首选烷基化药物之一。环磷酰胺是一种无活性的前药，需要代谢激活才能释放活性基团磷酰胺氮芥，在生理条件下，环磷酰胺通过细胞色素P450催化活化为4-羟基环磷酰胺，4-羟基环磷酰胺与其互变异构体醛缩磷酰胺共存。这些不稳定的转运前体自由扩散到细胞中，在细胞中通过β-消除释放出丙烯醛和磷酰胺氮芥。然后，磷酰胺氮芥形成高活性环氮丙啶阳离子，与DNA碱基上鸟嘌呤的N(7)结合，打断了DNA链的复制，导致了增生活跃的细胞中DNA的断裂，从而抑制癌细胞的生长。但是，丙烯醛却是一种与环磷酰胺相关的非靶向副产物，它能够导致出血性膀胱炎。
青蒿素及其衍生物具有良好的抗疟活性，在临床上应用多年，但其热稳定性差，易受湿、热和还原性物质的影响而分解等缺点使其应用受到限制。近年来研究发现，青蒿素具有一定的抗癌活性，诸多研究发现青蒿素与一些活性基团结合，能显著增加青蒿素的抗癌活性，同时降低其对正常细胞的毒性。因此，青蒿素与磷酰胺氮芥的杂化可能为开发潜在的抗癌候选药物提供新的途径。
发明内容
为此，本发明提供一种青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物及其制备方法和应用。本发明设计合成了一系列结构新颖的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物，经体外细胞实验验证上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物对肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌等多种癌细胞均表现出良好的细胞毒活性，且具有优异的选择性，因此具有良好的实际应用价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，
其中，
R2为脂肪烃基；
R3选自芳基、杂环芳基、脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基。
本发明的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物通过哌嗪的添加形成多个氢键或离子键以提高该杂化物的生物活性，以及调节该杂化物的溶解性和酸碱平衡，与此同时，通过磷酰胺氮芥的添加能够显著提高所制备杂化物的抗癌活性，使得该杂化物能够显著抑制癌细胞的生长。
作为优选，R2为C1-6脂肪烃基，且一个或多个氢原子任选被卤素原子取代；
R3选自C6-10芳基、C3-8杂环芳基、C1-6脂肪烃基或含杂原子的C1-6脂肪烃基，且一个或多个氢原子任选被卤素原子或硝基取代。
进一步优选地，R2选自-CH2CH2Cl、-CH2CHClCH3或-CH2CH2Br；
R3选自
根据本发明实施例的第二方面，提供上述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药的制备方法，当R3为芳基或杂环芳基时，合成路线如下：
所述制备方法包括：
化合物3在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物4发生亲核取代反应，得到中间体6；
中间体6在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物1发生亲核取代反应，得到化合物7，即式(I)所示的化合物；
或者，当R3为脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基时，合成路线如下：
所述制备方法包括：
化合物3在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物1发生亲核取代反应，得到中间体5；
中间体5在极性非质子溶剂存在下与化合物8发生亲核取代反应，得到化合物7，即式(I)所示的化合物。
作为优选，所述缚酸剂包括但不限于三乙胺、吡啶或碳酸钾，优选为三乙胺；
所述极性非质子溶剂包括但不限于四氢呋喃、乙腈或二氯甲烷，优选为四氢呋喃或乙腈。
在一些具体的实施例中，当R3为芳基或杂环芳基时，所述制备方法包括如下步骤：
(a)在-5℃条件下，向化合物3的四氢呋喃溶液中缓慢滴加三乙胺和化合物4的四氢呋喃溶液，搅拌6h，将反应液缓慢升至室温过夜，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析快速分离除去大极性杂质，得中间体6；
(b)室温下，向化合物1的乙腈溶液中加入中间体6和三乙胺的乙腈溶液，搅拌过夜，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，得化合物7，即式(I)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
当R3为脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基时，所述制备方法包括如下步骤：
(A)室温下，向化合物3的乙腈溶液中缓慢滴加三乙胺和化合物1的乙腈溶液，搅拌反应5h，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，滤液浓缩，得中间体5；
(B)室温下，向化合物4的乙腈溶液中加入NaH，搅拌反应20min后得到化合物8，将其滴入到步骤(A)所得的中间体5的乙腈溶液中，搅拌过夜，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，得化合物7，即式(I)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种药用组合物，包括上述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药。
根据本发明实施例的第四方面，提供一种药物制剂，包括上述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，和至少一种药学上可接受的辅料或载体。
根据本发明实施例的第五方面，提供上述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药、上述的药用组合物、或者上述的药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
需要说明的是，癌症包括但不限于肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌或卵巢癌，优选为肝癌。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明通过将青蒿素衍生物与磷酰胺氮芥基团进行杂化获得一系列青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。通过实验证明，上述杂化物能够显著抑制多种癌细胞的生长，同时对多种正常细胞的毒性较小，从而成为潜在的广谱抗癌候选药物，因此具有良好的实际应用价值。
(2)本发明的制备方法操作简单，不必在苛刻的无水无氧条件下进行，无金属试剂，色谱纯化工艺简单，对环境友好且原子利用率较高。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例1制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图3为本发明实施例1制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图4为本发明实施例2制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图5为本发明实施例2制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图6为本发明实施例2制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图7为本发明实施例3制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图8为本发明实施例3制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图9为本发明实施例3制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图10为本发明实施例4制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图11为本发明实施例4制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图12为本发明实施例4制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图13为本发明实施例5制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图14为本发明实施例5制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图15为本发明实施例5制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图16为本发明实施例6制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图17为本发明实施例6制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图18为本发明实施例6制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图19为本发明实施例7制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图20为本发明实施例7制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图21为本发明实施例7制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图22为本发明实施例8制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图23为本发明实施例8制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图24为本发明实施例8制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图25为本发明实施例9制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图26为本发明实施例9制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图27为本发明实施例9制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图28为本发明实施例10制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图29为本发明实施例10制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图30为本发明实施例10制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图；
图31为本发明实施例11制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的1H NMR谱图；
图32为本发明实施例11制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的13C NMR谱图；
图33为本发明实施例11制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体实验条件和实验方法，通常按照销售公司所推荐的条件或本领域技术内的生物学/化学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下各实施例采用的原料如下：
化合物1青蒿素-哌嗪不做严格限定，例如可以通过如下方法制得：
向200mL三口烧瓶中加入DHA(2g，7mmol)，25mL干二氯甲烷，室温搅拌5min，然后加入65μL干燥的DMSO，继续搅拌2min，随后缓慢滴加0.6-0.7mL乙二酰氯，反应有大量气泡生成，并且DHA逐渐溶解，反应液变成黄绿色，等反应不再有气泡生成时，继续搅拌7-10min，将其缓慢滴入哌嗪(2.5g)的二氯甲烷溶液(40mL)中，室温下过夜反应。反应结束后，使用20mL饱和碳酸钠和20mL饱和氯化钠清洗反应液，水相用3×25mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压抽滤，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得化合物1青蒿素-哌嗪。
化合物3磷酰胺二氯不做严格限定，例如可以通过如下方法制得：
在200mL圆底烧瓶中加入二乙醇胺/二异丙醇胺(50mmol)和氯仿(12mL)，在冰水浴中搅拌5min，滴加二氯亚砜(10mL)的氯仿(8mL)溶液，待反应冷却后，逐渐升温至63℃回流，反应约40min，出现较多固体时加入乙酸乙酯(25mL)，继续回流搅拌20min，出现较多固体，将反应液冷却至室温，抽滤，滤饼用少量乙酸乙酯洗3次，干燥得到化合物2a、2b的粗品。
在0℃下，将氢溴酸(75mL，0.45mol，48％by wt)缓慢添加至二乙醇胺(11.0g，0.10mol)中。将反应混合物加热至回流，然后通过刺形分馏柱蒸馏除去水。收集到的前15mL馏分温度为100℃，其余馏分温度为125℃。在总共收集40mL馏出物后，再添加氢溴酸(50mL，0.30mol，48％by wt)并收集50mL馏出物。继续添加氢溴酸(25mL，0.15mol，48％by wt)，反应混合物回流过夜。然后将反应混合物蒸馏(约收集30mL)，并将蒸馏瓶中残留物倒入-78℃丙酮中，洗涤，过滤，干燥得到化合物2c的粗品。
化合物2的粗品直接用于下一步反应。
在200mL圆底烧瓶中加入化合物2的粗品和重蒸二氯甲烷(100mL)，将其置入到0℃冰水浴中，加入三乙胺(14mL，100mmol)，搅拌5min，待温度稳定后，逐滴加入三氯氧磷(4.66mL，50mmol)，加完后搅拌20min，缓慢升温至室温反应24h，将反应液用0.01M的盐酸洗涤(3×30mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后所得混合物用体积比为1：20的石油醚：乙酸乙酯洗脱得到化合物3。
化合物3a：双(2-氯乙基)氨基磷酰二氯，白色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.66–3.45(m,8H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ48.8(d,J＝4.1Hz),40.6(d,J＝3.0Hz)。
化合物3b：双(2-氯丙基)氨基磷酰二氯，白色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.57–4.21(m,2H),3.95–3.30(m,4H),1.58(t,J＝6.7Hz,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ55.8(d,J＝3.7Hz),55.1(d,J＝2.9Hz),54.9(d,J＝4.0Hz),54.3(d,J＝3.4Hz),22.8,22.8。
化合物3c：双(2-溴乙基)氨基磷酰二氯，白色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.60(dt,J＝15.7,7.1Hz,4H),3.45(t,J＝7.2Hz,4H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ48.9(d,J＝14.8Hz),27.8(d,J＝15.2Hz)。
当R3为芳基或杂环芳基时，青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的合成路线如下：
当R3为脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基时，青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的合成路线如下：
实施例1
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-1)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法(Method A)，包括如下步骤：
(a)在-5℃条件下，在圆底烧瓶(50mL)中加入化合物3a(1mmol)和重蒸四氢呋喃(10mL)，搅拌溶解后，向溶液中缓慢滴加间氟苯酚(1.2mmol)和三乙胺(2mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液，搅拌6h，将反应液缓慢升至室温过夜，TLC(体积比为3:1的石油醚:乙醚)检测反应，待反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，通过快速柱层析(直径32mm，长度5cm的硅胶柱，用体积比为1:5的乙酸乙酯:石油醚约200mL)除去大极性杂质后得到粗品6，直接用于下一步。
(b)室温下，在圆底烧瓶(50mL)中加入化合物1(0.3872g，1.1mmol)和重蒸乙腈(20mL)，搅拌溶解后，向溶液中加入粗品6和三乙胺(2mmol)的乙腈(5mL)溶液，搅拌过夜，TLC检测反应，待反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为44％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图1-3所示；
由图1-3可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.25–7.19(m,1H),7.03–6.92(m,2H),6.80(td,J＝8.3,2.3Hz,1H),5.21(d,J＝2.1Hz,1H),3.94(d,J＝10.2Hz,1H),3.65–3.49(m,4H),3.48–3.31(m,4H),3.25–3.06(m,4H),2.95–2.81(m,2H),2.64–2.43(m,3H),2.28(td,J＝13.9,3.8Hz,1H),1.98–1.91(m,1H),1.88–1.75(m,1H),1.70–1.59(m,2H),1.52–1.10(m,8H),1.01–0.92(m,1H),0.89(d,J＝6.2Hz,3H),0.74(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.98(d,J＝247.6Hz),151.77(ddd,J＝11.1,5.9,2.5Hz),130.42(d,J＝9.9Hz),115.81(ddd,J＝10.4,5.0,3.3Hz),111.54(d,J＝20.9Hz),108.10(ddd,J＝24.9,8.0,5.3Hz),103.9,91.5,90.8,80.2,51.7,49.8,47.6,45.7,45.0,42.2,37.3,36.3,34.2,28.3,25.9,24.7,21.6,20.3,13.4。
HRMS(ESI)calcd for C29H44Cl2FN3O6P[M+H]+650.2323,found 650.2322。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-1)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例2
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-2)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例1中的制备方法(Method A)基本相同，区别仅在于将间氟苯酚替换为2,4,6-三氯苯酚。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为57％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图4-6所示；
由图4-6可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(d,J＝1.6Hz,2H),5.26(d,J＝2.8Hz,1H),4.01(dd,J＝10.2,2.4Hz,1H),3.70–3.64(m,4H),3.58–3.43(m,4H),3.39–3.28(m,4H),3.04–2.98(m,2H),2.72–2.65(m,2H),2.60–2.52(m,1H),2.32(td,J＝13.9,3.9Hz,1H),2.02–1.96(m,1H),1.88–1.81(m,1H),1.73–1.65(m,2H),1.55–1.17(m,8H),1.00(td,J＝13.2,12.7,3.9Hz,1H),0.93(d,J＝6.2Hz,3H),0.80(dd,J＝7.2,2.4Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ143.6,130.6,129.1,128.8,104.0,91.6,90.8,80.3,51.7,50.7,47.7,45.8,45.5,42.5,37.4,36.4,34.3,28.4,26.0,24.8,21.7,20.4,13.6。
HRMS(ESI)calcd for C29H42Cl5N3O6P[M+H]+734.1248,found 734.1250。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-2)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例3
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-3)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例1中的制备方法(Method A)基本相同，区别仅在于将间氟苯酚替换为对溴苯酚。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为28％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图7-9所示；
由图7-9可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(d,J＝8.4Hz,2H),7.08(dd,J＝8.5,5.6Hz,2H),5.21(d,J＝3.0Hz,1H),3.94(d,J＝10.3Hz,1H),3.64–3.51(m,4H),3.49–3.35(m,4H),3.14(s,4H),2.89(dd,J＝11.6,6.2Hz,2H),2.67–2.46(m,3H),2.28(td,J＝13.9,3.8Hz,1H),1.95(dt,J＝14.5,3.8Hz,1H),1.84–1.77(m,1H),1.67–1.61(m,2H),1.50–1.09(m,8H),1.00–0.92(m,1H),0.89(d,J＝6.1Hz,3H),0.74(d,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ150.0,132.6,121.9,117.3,103.9,91.5,90.7,80.2,51.6,49.7,47.6,45.7,44.9,42.2,37.3,36.2,34.2,28.2,26.0,24.7,21.6,20.3,13.4。
HRMS(ESI)calcd for C29H44BrCl2N3O6P[M+H]+710.1523,found 710.1520。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-3)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例4
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-4)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例1中的制备方法(Method A)基本相同，区别仅在于将间氟苯酚替换为对硝基苯酚。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为58％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图10-12所示；
由图10-12可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21–8.17(m,2H),7.38(dd,J＝8.9,6.3Hz,2H),5.23–5.20(m,1H),3.95(d,J＝10.0Hz,1H),3.66–3.55(m,4H),3.45(dd,J＝12.2,6.7Hz,4H),3.21–3.10(m,4H),2.94–2.86(m,2H),2.62–2.50(m,3H),2.28(td,J＝14.0,4.0Hz,1H),2.01–1.93(m,1H),1.85–1.79(m,1H),1.68–1.63(m,2H),1.51–1.15(m,8H),1.01–0.83(m,4H),0.74(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.1,144.2,125.7,120.5,103.9,91.6,90.8,80.3,51.7,49.7,47.7,45.8,45.1,42.2,37.4,36.3,34.3,28.3,26.0,24.8,21.6,20.3,13.4。
HRMS(ESI)calcd for C29H44Cl2N4O8P[M+H]+677.2268,found 677.2275。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-4)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例5
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-5)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例1中的制备方法(Method A)基本相同，区别仅在于将间氟苯酚替换为2-羟基吡啶。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为35％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图13-15所示；
由图13-15可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝3.7Hz,1H),7.62(td,J＝7.8,1.9Hz,1H),7.00(dd,J＝7.8,5.4Hz,2H),5.18(s,1H),3.92(d,J＝10.1Hz,1H),3.63–3.31(m,8H),3.17(s,4H),2.89(q,J＝10.1,7.9Hz,2H),2.59–2.44(m,3H),2.24(td,J＝13.9,3.8Hz,1H),1.90(dt,J＝14.3,3.7Hz,1H),1.80–1.73(m,1H),1.64–1.57(m,2H),1.47–1.11(m,8H),0.96–0.88(m,1H),0.85(d,J＝6.2Hz,3H),0.71(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ157.6,148.0,139.7,120.5,113.9,103.7,91.5,90.6,80.1,51.5,49.8,47.4,45.6,44.8,42.2,37.2,36.1,34.1,28.2,25.8,24.6,21.5,20.2,13.3。
HRMS(ESI)calcd for C28H44Cl2N4O6P[M+H]+633.2370,found 633.2369。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-5)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例6
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-6)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法(Method B)，包括如下步骤：
(A)在室温下，在圆底烧瓶(50mL)中加入化合物3a(1mmol)和重蒸乙腈(10mL)，搅拌溶解后，向溶液中缓慢滴加化合物1(1.2mmol)和三乙胺(2mmol)的乙腈(15mL)溶液，搅拌5h，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物5，直接用于下一步。
(B)在室温下，向4-吡啶甲醇(1mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入NaH(purity：60％，0.048g，1.2mmol)，搅拌约20min后，得到醇钠，将其滴加到粗产物5的乙腈(10mL)溶液中，搅拌过夜，TLC检测反应结束后，过滤除去反应中产生的盐，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为36％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图16-18所示；
由图16-18可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,2H),7.21(t,J＝6.4Hz,2H),5.19(s,1H),4.99–4.90(m,2H),3.92(dd,J＝10.1,3.4Hz,1H),3.53(q,J＝6.0Hz,4H),3.34–3.27(m,4H),3.15–2.98(m,4H),2.92–2.83(m,2H),2.58–2.49(m,3H),2.24(t,J＝13.8Hz,1H),1.91(d,J＝14.9Hz,1H),1.80–1.75(m,1H),1.63–1.58(m,2H),1.47–1.10(m,8H),0.96–0.89(m,1H),0.85(d,J＝6.1Hz,3H),0.71(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ149.7,145.2,121.2,103.5,91.2,90.5,79.9,64.8,51.3,49.4,47.4,45.4,44.5,42.1,37.0,35.9,33.9,27.9,25.7,24.4,21.3,20.0,13.1。
HRMS(ESI)calcd for C29H46Cl2N4O6P[M+H]+647.2527,found 647.2530。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-6)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例7
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-7)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例6中的制备方法(Method B)基本相同，区别仅在于将4-吡啶甲醇替换成5-噻唑甲醇。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为66％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图19-21所示；
由图19-21可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.64(d,J＝16.8Hz,1H),5.03–4.98(m,3H),3.74(d,J＝10.1Hz,1H),3.35–3.31(m,4H),3.12–3.05(m,4H),2.89–2.77(m,4H),2.68–2.63(m,2H),2.39–2.25(m,3H),2.09–2.01(m,1H),1.73(d,J＝14.3Hz,1H),1.59(t,J＝9.1Hz,1H),1.43(d,J＝11.8Hz,2H),1.27–0.94(m,8H),0.80–0.72(m,1H),0.68(d,J＝6.2Hz,3H),0.53(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.3,142.7,133.3,103.2,91.0,90.2,79.6,58.5,51.1,49.2,47.2,45.2,44.2,41.9,36.7,35.8,33.7,27.7,25.5,24.2,21.0,19.8,12.9。
HRMS(ESI)calcd for C27H44Cl2N4O6PS[M+H]+653.2091,found 653.2094。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-7)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例8
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-8)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例6中的制备方法(Method B)基本相同，区别仅在于将化合物3a替换成化合物3b。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为32％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图22-24所示；
由图22-24可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(s,2H),7.19(q,J＝5.4Hz,2H),5.15(d,J＝3.3Hz,1H),4.96–4.87(m,2H),4.17–4.09(m,2H),3.88(d,J＝10.1Hz,1H),3.42–2.96(m,8H),2.88–2.79(m,2H),2.54–2.42(m,3H),2.20(td,J＝13.9,3.7Hz,1H),1.86(d,J＝13.8Hz,1H),1.75–1.70(m,1H),1.58–1.54(m,2H),1.43–0.97(m,14H),0.87(dd,J＝12.4,3.6Hz,1H),0.81(d,J＝6.2Hz,3H),0.67(d,J＝7.2Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ149.7,145.6,121.5,103.7,91.4,90.6,80.1,65.1,58.1,57.8,57.4,56.6,51.5,47.5,45.5,44.6,37.1,36.1,34.0,28.1,25.8,24.5,22.6,22.5,21.4,20.1,13.2。
HRMS(ESI)calcd for C31H50Cl2N4O6P[M+H]+675.2840,found 675.2839。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-8)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例9
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-9)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例6中的制备方法(Method B)基本相同，区别仅在于将化合物3a替换成化合物3b，将4-吡啶甲醇替换成5-噻唑甲醇。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为41％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图25-27所示；
由图25-27可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(s,1H),7.82–7.76(m,1H),5.17–5.11(m,3H),4.17–4.07(m,2H),3.88(d,J＝10.2Hz,1H),3.39–2.99(m,8H),2.84–2.79(m,2H),2.54–2.41(m,3H),2.21(td,J＝14.0,3.8Hz,1H),1.88(dt,J＝14.5,3.6Hz,1H),1.77–1.70(m,1H),1.61–1.55(m,2H),1.43–1.06(m,14H),0.94–0.86(m,1H),0.82(d,J＝6.2Hz,3H),0.68(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.6,142.9,133.8,103.7,91.4,90.5,80.1,59.0,58.1,57.7,57.4,56.6,51.5,47.6,45.6,44.5,37.2,36.1,34.1,28.1,25.9,24.6,22.6,22.5,21.4,20.1,13.3。
HRMS(ESI)calcd for C29H48Cl2N4O6PS[M+H]+681.2404,found 681.2404。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-9)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例10
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式(I-10)所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例6中的制备方法(Method B)基本相同，区别仅在于将化合物3a替换成化合物3c。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为26％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图28-30所示；
由图28-30可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(t,J＝5.0Hz,2H),7.19(dd,J＝9.7,5.0Hz,2H),5.16(s,1H),4.98–4.87(m,2H),3.89(dd,J＝10.3,3.7Hz,1H),3.60–3.31(m,8H),3.12–2.80(m,6H),2.56–2.43(m,3H),2.22(td,J＝13.7,3.5Hz,1H),1.90–1.85(m,1H),1.74(dd,J＝14.1,6.3Hz,1H),1.58(q,J＝6.3,5.2Hz,2H),1.48–1.00(m,8H),0.92(d,J＝13.0Hz,1H),0.83(d,J＝6.2Hz,3H),0.69(d,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ149.9,145.3,121.6,103.7,91.4,90.6,80.1,65.0,51.5,49.5,47.6,45.6,44.7,37.2,36.1,34.1,29.9,28.1,25.9,24.6,21.4,20.1,13.3。
HRMS(ESI)calcd for C29H46Br2N4O6P[M+H]+735.1516,found 735.1517。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-10)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
实施例11
一、青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物结构式如式11所示：
二、制备方法
上述青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的制备方法与实施例6中的制备方法(Method B)基本相同，区别仅在于将化合物3a替换成化合物3c，将4-吡啶甲醇替换成5-噻唑甲醇。
称取上述制备得到青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物的质量，再将称取质量÷理论产量×100％，得到上述制备方法的产率为48％。
选取上述制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别进行核磁共振和质谱分析；其中1HNMR谱、13C NMR谱和质谱图如图31-33所示；
由图31-33可知：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),7.75(d,J＝18.3Hz,1H),5.13–5.06(m,3H),3.84(d,J＝10.1Hz,1H),3.50–3.20(m,8H),2.95(q,J＝19.3,15.8Hz,4H),2.79–2.74(m,2H),2.49–2.38(m,3H),2.17(td,J＝14.0,3.8Hz,1H),1.84(dt,J＝14.4,3.7Hz,1H),1.73–1.66(m,1H),1.54(d,J＝11.2Hz,2H),1.39–1.05(m,8H),0.90–0.82(m,1H),0.78(d,J＝6.2Hz,3H),0.64(d,J＝7.1Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.5,142.9,133.5,103.6,91.3,90.4,79.9,58.8,51.3,49.3,47.5,45.4,44.5,37.0,36.0,33.9,29.9,28.0,25.7,24.4,21.3,20.0,13.2。
HRMS(ESI)calcd for C27H44Br2N4O6PS[M+H]+741.1080,found 741.1083。
因此可以确定制备得到的产物为式(I-11)所示的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物。
以下通过具体生物化学实验，进一步说明本发明的技术效果。
实验例1
本实验例为不同浓度的实施例1-11制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物对人肝癌细胞HepG2和人肾正常细胞HEK-293T在48h的体外抑制活性研究，以长春新碱(VCR)和双氢青蒿素(DHA)作为对照组。
实验方法：
取对数生长期，生长状态良好的待测细胞，用1640完全培养基调整密度到5×104个/mL，悬浊液接种到96孔培养板中，每孔100μL，分成6板，于37℃过夜培养(在细胞孔周围孔内加入100μL无菌PBS)；
待细胞贴壁生长良好24h后，吸收旧的培养液，向各个培养孔中加入10μL不同浓度的待测物质，作用于HepG2细胞时浓度分别为0.1、1、10、50、100μg/mL；作用于HEK-293T细胞时浓度分别为0.1、1、10、100、200μg/mL，每个浓度设3个平行重复孔，同时设等体积二甲基亚砜(DMSO)溶剂的和不含药物培养基的空白对照孔，于37℃，5％CO2的培养箱内继续培养。
将待测物质培养48h后，弃去上清液，并利用倒置显微镜观察细胞形态；然后，每孔加10μL(2mg/mL in PBS)MTT，继续培养4h后，吸出孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜,震荡10min使蓝紫色结晶物溶解充分后，于波长568nm处用酶标仪测定每孔样品的吸光度值(A)，取平均值。
实验结果如表1、2、3所示：
表1部分实施例在不同浓度下对HepG2细胞的抑制率
表2部分实施例在不同浓度下对HEK-293T细胞的抑制率
表3部分实施例对HepG2和HEK-293T细胞的毒活性
μM＝μmol/L
由表1、2、3可知：
实施例1、3、4、5、6、7、9、11(IC50＝8.24～45.57μM)在体外对HepG2细胞的抑制活性均优于长春新碱(VCR，IC50＝92.63μM)和其母体双氢青蒿素(DHA，IC50＝51.05μM)。其中，含噻唑结构的杂化物(实施例7、9)对HepG2细胞的抑制活性明显优于其他杂化物。实施例9(IC50＝8.24μM)对HepG2细胞的生长抑制活性最高，是参考药VCR的11.3倍，DHA的6.2倍；实施例7(IC50＝12.50μM)对HepG2细胞的抑制活性是参考药VCR的7.4倍，DHA的4.1倍。
此外，实施例7对人肾正常细胞HEK-293T具有非常小的细胞毒性(IC50＝200.37μM)，选择性指数(SI：IC50(HEK-293T)/IC50(HepG2))约为16.0。表明其可作为潜在的抗肝癌候选药物。
实验例2
本实验例为采用实施例7中制备的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物分别对人肾透明细胞腺癌细胞786-O、人肺癌细胞Calu-1、人乳腺癌细胞SK-BR-3和人卵巢癌细胞SK-OV-3及正常细胞人胚胎肺细胞WI-38、人乳腺上皮细胞MCF-10A和人卵巢颗粒细胞KGN，进行48h的体外抑制活性研究；
实验方法：同实验例1中的方法，区别仅在于将作用于癌细胞时的浓度替换成分别为0.2、1、10、50、100μg/mL；将作用于正常细胞时的浓度替换成分别为1、10、100、200、300μg/mL。
实验结果如表4、5、6所示：
表4实施例7在不同浓度下对癌细胞的抑制率
表5实施例7在不同浓度下对正常细胞的抑制率
表6实施例7对若干癌细胞和正常细胞的毒活性及选择性
由表4、5、6可知：
实施例7对其他癌细胞，如人肾透明细胞腺癌细胞786-O、人肺癌细胞Calu-1、人乳腺癌细胞SK-BR-3和人卵巢癌细胞SK-OV-3也有较好的抑制效果(IC50＝17.30～41.50μM)，同时对正常细胞，如人肾正常细胞HEK-293T、人胚胎肺细胞WI-38、人乳腺上皮细胞MCF-10A和人卵巢颗粒细胞KGN也具有较低的毒性(IC50＝52.42～200.37μM)，且选择性指数(SI：IC50(正常细胞)/IC50(癌细胞))大于3.0。
由表1、2、3、4、5、6可以看出，对于本发明制备得到的青蒿素-哌嗪-磷酰胺氮芥杂化物，其表现出优秀的对肝癌细胞HepG2的抑制率，和对正常细胞较小的毒性。同时对于肾癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌，也表现出了较好的作用和较高的选择性。能够被应用于治疗肝癌或制备治疗肝癌及其他癌的药物。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，但对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，
其中，
R2为脂肪烃基；
R3选自芳基、杂环芳基、脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基。
2.如权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，其特征在于，
R2为C1-6脂肪烃基，且一个或多个氢原子任选被卤素原子取代；
R3选自C6-10芳基、C3-8杂环芳基、C1-6脂肪烃基或含杂原子的C1-6脂肪烃基，且一个或多个氢原子任选被卤素原子或硝基取代。
3.如权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，其特征在于，
R2选自-CH2CH2Cl、-CH2CHClCH3或-CH2CH2Br；
R3选自
4.权利要求1-3任一项所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药的制备方法，其特征在于，
当R3为芳基或杂环芳基时，合成路线如下：
所述制备方法包括：
化合物3在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物4发生亲核取代反应，得到中间体6；
中间体6在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物1发生亲核取代反应，得到化合物7，即式(I)所示的化合物；
或者，当R3为脂肪烃基或含杂原子的脂肪烃基时，合成路线如下：
所述制备方法包括：
化合物3在缚酸剂、极性非质子溶剂存在下与化合物1发生亲核取代反应，得到中间体5；
中间体5在极性非质子溶剂存在下与化合物8发生亲核取代反应，得到化合物7，即式(I)所示的化合物。
5.如权利要求4所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药的制备方法，其特征在于，
所述缚酸剂包括但不限于三乙胺、吡啶或碳酸钾，优选为三乙胺；
所述极性非质子溶剂包括但不限于四氢呋喃、乙腈或二氯甲烷，优选为四氢呋喃或乙腈。
6.一种药用组合物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药。
7.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药，和至少一种药学上可接受的辅料或载体。
8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
9.权利要求1-3任一项所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或前药、权利要求6所述的药用组合物、或者权利要求7或8所述的药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症包括但不限于肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌或卵巢癌，优选为肝癌。
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