CN114350712A

CN114350712A - 黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用

Info

Publication number: CN114350712A
Application number: CN202210041123.4A
Authority: CN
Inventors: 成贵娟; 倪婕
Original assignee: Futian Biomedical Innovation And R & D Center Of Chinese University Of Hong Kong Shenzhen; Chinese University of Hong Kong Shenzhen
Current assignee: Futian Biomedical Innovation And R & D Center Of Chinese University Of Hong Kong Shenzhen; Chinese University of Hong Kong Shenzhen
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本申请提供黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用，本申请发现黄素还原酶不仅可以催化黄素还原反应，还可以催化芳香化合物的碘代反应，生成芳基碘代物，从而得到一种新型黄素依赖卤代酶，且该新型黄素依赖卤代酶具有较高的碘代活力，与已报道的其他卤代酶相比，该黄素依赖卤代酶可单酶催化多种芳香族底物的碘代反应，且具有较高的转化率与区域选择性。

Description

黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用

技术领域

本申请涉及酶催化合成技术领域，尤其涉及黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用。

背景技术

芳基碘代物是一类非常重要的化合物，在有机合成和药物设计中常用作中间体构建新的C-C键和C-N键等。同时芳基碘代物也是很多经典的偶联反应的起始反应物，例如Heck偶联反应、Suzuki偶联反应和Buchwald-Hartwig偶联反应都使用芳基碘代物作为起始原料。相比于芳基氯代/溴代物，芳基碘代物作为原料时，反应效率更高。此外，芳基碘代物也在医学领域得到广泛应用，例如，三碘甲状腺原氨酸可以用于治疗甲状腺功能减退症。在单光子发射计算机断层成像和临床前X射线成像中，可以使用不同放射性碘同位素(131I、125I、123I)标记相同的靶标试剂，这为药代动力学的研究提供了灵活性。

由于芳基碘代物在有机合成，医药等领域的广泛应用，芳基碘代物的合成方法也备受关注，已报道的合成方法包括化学合成法和生物催化法。化学合成方法中常用铜，镍，钯等过渡金属催化剂，在配体辅助下催化芳基化合物的碘代反应，然而该类型反应仍受限于反应条件苛刻、所用试剂有毒及控制产物的区域选择性困难。与化学合成方法相比，生物催化法具有反应条件温和、使用无毒的碘盐作为反应物、产物区域选择性高、副产物少、能耗低、环境友好等优点，符合绿色化学的合成理念，具有更为广阔的应用前景。黄素依赖的卤代酶是一种依赖还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH₂)作为辅因子的酶，可以催化芳香族底物的卤代反应，其中氯代和溴代反应较多，催化碘代反应较少，且效率低，目前无法利用黄素依赖卤代酶进行工业化的芳基碘代物生物催化合成反应。

发明内容

本申请的目的在于提供黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用。

为实现以上目的，本申请提供黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用。

优选地，所述黄素还原酶包括依赖NADPH的黄素还原酶和依赖NADH的黄素还原酶。

优选地，所述催化反应中还加入黄素类辅因子，还原辅因子及碘盐。

优选地，所述黄素类辅因子包括黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、核黄素中的任一种，或其类似物中的任一种。

优选地，所述还原辅因子包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，或其类似物中的任一种。

优选地，碘盐包括碘化钠，碘化钾中的任一种。

优选地，所述黄素还原酶的形式为可表达所述黄素还原酶的全细胞、所述黄素还原酶的粗酶、所述黄素还原酶的纯酶中的任一种。

优选地，所述催化反应中芳香化合物的浓度为0.1～10mM。

优选地，所述催化反应中芳香化合物的浓度为1mM。

优选地，所述催化反应中所用的缓冲液pH值为pH6.0-8.0，温度为10-50℃。

优选地，所述缓冲液为pH值为pH7.4的PBS缓冲液，所述温度为35℃。

与现有技术相比，本申请的有益效果包括：

本申请发现黄素还原酶不仅可以催化黄素还原反应，还可以催化芳香化合物的碘代反应，生成芳基碘代物，从而得到一种新型黄素依赖卤代酶，且该新型黄素依赖卤代酶具有较高的碘代活力，与已报道的其他卤代酶相比，该黄素依赖卤代酶可单酶催化芳香族底物的碘代反应，不需要在反应中额外添加还原酶生成FADH₂，且具有较高的转化率与区域选择性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。

图1为黄素还原酶PheA2催化7-脱氮腺苷碘代反应液相色谱图。

图2为黄素还原酶催化7-脱氮腺嘌呤碘代反应液相-质谱分析。

图3A和图3B分别为7-碘脱氮腺嘌呤1H和13C核磁谱图,(500MHz,DMSO-d6)。

图4为黄素还原酶PheA2催化7-氮杂次黄嘌呤碘代反应液相色谱图。

图5为黄素还原酶催化7-氮杂次黄嘌呤碘代反应液相-质谱分析。

图6A和图6B分别为7-碘-氮杂次黄嘌呤1H和13C核磁谱图,(500MHz,DMSO-d6)。

图7为黄素还原酶PheA2催化3-羟基喹啉碘代反应液相色谱图。

图8为黄素还原酶催化3-羟基喹啉碘代反应液相-质谱分析。

图9A和图9B分别为4-碘-3-羟基喹啉1H和13C核磁谱图,(500MHz,CD₃OD)。

图10为黄素还原酶PheA2催化7-羟基-2-喹诺酮碘代反应液相色谱图。

图11为黄素还原酶催化7-羟基-2-喹诺酮碘代反应液相-质谱分析。

图12A和图12B分别为8-碘-7-羟基-2-喹诺酮1H和13C核磁谱图,(500MHz,DMSO-d6)。

图13为黄素还原酶PheA2催化吲哚-5-羧酸碘代反应液相色谱图。

图14为黄素还原酶催化吲哚-5-羧酸碘代反应液相-质谱分析。

图15A和图15B分别为3-碘-吲哚-5-羧酸1H和13C核磁谱图,(500MHz,DMSO-d6)。

图16为黄素还原酶PheA2催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑碘代反应液相色谱图。

图17为黄素还原酶催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑碘代反应液相-质谱分析。

图18A和图18B分别为4-碘-5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑1H和13C核磁谱图,(500MHz,CDCl₃)。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

本申请提供黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用。

黄素还原酶是以NADH或NADPH为质子供体,催化黄素还原反应的一类酶，黄素包括黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和核黄素。

芳香化合物，又称为芳香族化合物，是具有特殊稳定性的不饱和环状化合物。芳香性化合物大致可分为：简单的芳香化合物、多环芳香化合物和杂环化合物。杂环化合物之中组成环的原子不仅包括碳，还包括氮、氧或硫等原子，例如五元的吡咯、呋喃和噻吩、六元的吡啶、多环的吲哚、喹啉等。多环芳香化合物中有一类多环芳香烃，其分子由超过一个不包含杂环或取代基的芳香环融合在一起并同时分享两个碳原子所组成，例如有萘、蒽、菲。简单的芳香化合物：芳香烃有大量的有机化合物的结构当中都包含简单的芳香环，例如DNA(包含嘌呤、嘧啶等)、三硝基甲苯(含苯环)、乙酰水杨酸(含苯环)和对乙酰氨基酚(含苯环)等。

卤代反应是指卤素取代烃基上的氢原子或羟基等官能团的反应。卤素中的碘原子取代芳香环碳氢键上的氢原子生成芳基碘代物，本发明方案的碘取代芳香环最负电子碳上的氢原子。

本申请发现黄素还原酶不仅可以催化黄素还原反应，还可以催化芳香化合物的碘代反应，生成芳基碘代物，从而得到一种新型黄素依赖卤代酶，且该新型黄素依赖卤代酶具有较高的碘代活力，与已报道的其他卤代酶相比，该黄素依赖卤代酶可单酶催化芳香族底物的碘代反应，不需要在反应中额外添加其他还原酶生成FADH₂，且具有较高的转化率与区域选择性。

具体的，依赖NADPH的黄素还原酶是指NCBI登录号为EC 1.5.1.30的一大家族黄素还原酶，依赖NADH的黄素还原酶是指NCBI登录号为EC 1.5.1.36的一大家族黄素还原酶。

优选地，所述催化反应中还加入黄素类辅因子、还原辅因子及碘盐。

优选地，所述碘盐作为催化反应的碘供体，所述碘盐例如可以为碘化钠或碘化钾等常见含碘化合物。

优选地，所述催化反应中芳香化合物的浓度为0.1～10mM。

优选地，所述催化反应中芳香化合物的浓度为1mM。

下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。表1示出了本申请实施例使用的部分试剂及其来源。

表1实验试剂及来源

实施例1嗜热葡萄糖苷地芽孢杆菌黄素还原酶的表达与纯化

将文献报道来源于嗜热葡萄糖苷地芽孢杆菌(Parageobacillusthermoglucosidasius)的黄素还原酶PheA2(氨基酸序列为SEQ ID NO.1)的核酸序列(碱基序列为SEQ ID NO.2)进行基因合成，构建到pET系列载体上。将含有编码该黄素还原酶基因的载体转化至大肠杆菌BL21表达菌株中，将测序结果正确的表达菌株接种于含有50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/L NaCl)中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.8后降温至16℃，并加入终浓度为0.2mM的IPTG，诱导16h后8000rpm离心5min收集菌体。菌体用A液(50mM PBS，pH 7.4，250mM NaCl，20mM咪唑)悬浮后超声破碎(功率150W，超声2s，间歇3s，总时间30min)，然后再4℃，8000rmp离心30min，上清液即为粗酶液。

镍柱亲和纯化步骤如下：

(1)Ni柱使用前首先用A液平衡5～10个柱体积。

(2)粗酶液以1mL/min的流速上样，将目的蛋白吸附到Ni柱上。

(3)上样完成后，再用A液平衡5个柱体积以洗脱与Ni柱非特异性结合的杂蛋白。

(4)用含不同咪唑浓度的B液(50mM PBS，pH 7.4，250mM NaCl，75mM/300mM咪唑)对目的蛋白进行分步洗脱，洗脱液分别收集。

(5)用SDS-PAGE分析收集到的蛋白样品，确定目的蛋白的纯度。

(6)向纯度较高的目的蛋白中加入适量FAD，冰上孵育30min，使蛋白与FAD结合，之后使用超滤管收集高纯度的目的蛋白，蛋白浓度使用Bradford蛋白定量试剂盒测定。

实施例2其他黄素还原酶的表达与纯化

使用与实施例1相同方法，成功表达纯化了来源于产气列契瓦尼尔氏菌(Lechevalieria aerocolonigenes)的黄素还原酶RebF,以及来源于嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)的黄素还原酶HpaC_Tt。黄素还原酶RebF的氨基酸序列为SEQID NO.3，碱基序列为SEQ ID NO.4；黄素还原酶HpaC_Tt的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，碱基序列为SEQ ID NO.6。

实施例3黄素还原酶催化7-脱氮腺嘌呤的碘代反应

使用实施例1和实施例2制备得到的黄素还原酶催化7-脱氮腺嘌呤生成芳基碘代物的反应体系为：在pH 7.4的PBS缓冲液中，加入终浓度为10mM的NaI，2.5mM的NADH及1mM底物，2μM已与FAD结合的纯酶。35℃反应30min后，100℃灭活10min以终止反应。反应液冷却后，12,000rpm离心10min并通过0.22μM滤头过滤。

利用Diamonsil C18柱(迪马科技)、安捷伦1260液相色谱仪分析底物与产物的相对含量。液相检测条件：进样体积为10μL，柱温40℃，流速2mL/min，检测波长337nm。流动相为甲醇与含0.1％三氟乙酸的水，10％甲醇至90％甲醇梯度洗脱。黄素还原酶PheA2催化7-脱氮腺嘌呤碘代反应液相色谱结果如图1所示，黄素还原酶PheA2催化反应的转化率约为63％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt均可以催化7-脱氮腺嘌呤转化为对应产物，转化率分别为51％(RebF),58％(HpaC_Tt)。

将黄素还原酶PheA2、黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt催化7-脱氮腺嘌呤反应产物进行LC-MS分析，确定产物为碘代产物，如图2所示，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化7-脱氮腺嘌呤底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图3A和图3B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C7，产物为7-碘-脱氮腺嘌呤。

实施例4黄素还原酶催化7-氮杂次黄嘌呤的碘代反应

与实施例3的区别在于：实施例4的碘代反应的底物为7-氮杂次黄嘌呤，黄素还原酶为实施例1与2中纯化得到的黄素还原酶。

实施例4的黄素还原酶PheA2催化碘代反应的底物与产物的液相色谱结果如图4所示，转化率约为37％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaC_Tt均可以催化7-氮杂次黄嘌呤转化为对应产物，转化率分别为30％(RebF),33％(HpaC_Tt)。

实施例4的碘代反应的产物的LC-MS分析如图5所示，确定产物为碘代产物，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化7-氮杂次黄嘌呤底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图6A和图6B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C7，产物为7-碘-氮杂次黄嘌呤。

实施例5黄素还原酶催化3-羟基喹啉的碘代反应

与实施例3的区别在于：实施例5的碘代反应的底物为3-羟基喹啉，黄素还原酶为实施例1与2中纯化得到的黄素还原酶。

实施例5的黄素还原酶PheA2催化3-羟基喹啉碘代反应的底物与产物的液相色谱结果如图7所示，转化率约为80％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt均可以催化3-羟基喹啉转化为对应产物，转化率分别为82％(RebF),68％(HpaC_Tt)。

实施例5的碘代反应的产物的LC-MS分析如图8所示，确定产物为碘代产物，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化3-羟基喹啉底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图9A和图9B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C4，产物为4-碘-3-羟基喹啉。

实施例6黄素还原酶催化7-羟基-2-喹诺酮的碘代反应

与实施例3的区别在于：实施例6的碘代反应的底物为7-羟基-2-喹诺酮，黄素还原酶为实施例1与2中纯化得到的黄素还原酶。

实施例6的黄素还原酶PheA2催化7-羟基-2-喹诺酮碘代反应的底物与产物的液相色谱结果如图10所示，黄素还原酶PheA2催化反应的转化率约为40％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt均可以催化7-羟基-2-喹诺酮转化为对应产物，转化率分别为55％(RebF),41％(HpaC_Tt)。

实施例6的碘代反应的产物的LC-MS分析如图11所示，确定产物为碘代产物，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化7-羟基-2-喹诺酮底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图12A和图12B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C8，产物为8-碘-7-羟基-2-喹诺酮。

实施例7黄素还原酶催化吲哚-5-羧酸的碘代反应

与实施例3的区别在于：实施例7的碘代反应的底物为吲哚-5-羧酸，黄素还原酶为实施例1与2中纯化得到的黄素还原酶。

实施例7的黄素还原酶PheA2催化吲哚-5-羧酸碘代反应的底物与产物的液相色谱结果如图13所示，转化率约为75％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt均可以催化吲哚-5-羧酸转化为对应产物，转化率分别为60％(RebF),48％(HpaC_Tt)。

实施例7的碘代反应的产物的LC-MS分析如图14所示，确定产物为碘代产物，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化吲哚-5-羧酸底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图15A和图15B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C7，产物为3-碘-吲哚-5-羧酸。

实施例8黄素还原酶催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑的碘代反应

与实施例3的区别在于：实施例8的碘代反应的底物为5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑，黄素还原酶为实施例1与2中纯化得到的黄素还原酶。

实施例8的黄素还原酶PheA2催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑碘代反应的底物与产物的液相色谱结果如图16所示，转化率约为70％。另外黄素还原酶RebF和黄素还原酶HpaCTt均可以催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑转化为对应产物，转化率分别为69％(RebF),66％(HpaC_Tt)。

实施例8的碘代反应的产物的LC-MS分析如图17所示，确定产物为碘代产物，说明实施例1和实施例2的黄素还原酶均可以催化5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑底物的碘代反应。

通过进一步分离纯化得到产物纯品，进行核磁氢谱和碳谱分析，结果如图18A和图18B所示，通过将测得谱图与已报道谱图对比分析，证明碘代位置为C8，产物为4-碘-5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

SEQUENCE LISTING

<110> 香港中文大学（深圳）

香港中文大学（深圳）福田生物医药创新研发中心

<120> 黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用

<130> 2022-01-09

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 161

<212> PRT

<213> Parageobacillus thermoglucosidasius

<400> 1

Met Asp Asp Arg Leu Phe Arg Asn Ala Met Gly Lys Phe Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val Thr Val Ile Thr Thr Glu Leu Asn Gly Ala Val His Gly Met Thr

20 25 30

Ala Asn Ala Phe Met Ser Val Ser Leu Asn Pro Lys Leu Val Leu Val

35 40 45

Ser Ile Gly Glu Lys Ala Lys Met Leu Glu Lys Ile Gln Gln Ser Lys

50 55 60

Lys Tyr Ala Val Asn Ile Leu Ser Gln Asp Gln Lys Val Leu Ser Met

65 70 75 80

Asn Phe Ala Gly Gln Leu Glu Lys Pro Val Asp Val Gln Phe Glu Glu

85 90 95

Leu Gly Gly Leu Pro Val Ile Lys Asp Ala Leu Ala Gln Ile Ser Cys

100 105 110

Gln Val Val Asn Glu Val Gln Ala Gly Asp His Thr Leu Phe Ile Gly

115 120 125

Glu Val Thr Asp Ile Lys Ile Thr Glu Gln Asp Pro Leu Leu Phe Phe

130 135 140

Ser Gly Lys Tyr His Gln Leu Ala Gln Asn Glu Lys Val Glu Thr Ser

145 150 155 160

Ser

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> Parageobacillus thermoglucosidasius

<400> 2

catatggatg atcgtctgtt tcgtaatgca atgggtaaat ttgcaacagg ggtgaccgtg 60

attaccaccg aactgaatgg cgcagtgcat ggtatgaccg ccaatgcctt tatgagcgtg 120

tctctgaatc cgaaactggt tctggtgtct attggcgaaa aagccaaaat gttagaaaaa 180

attcagcaga gcaaaaaata tgccgttaat attctgagtc aggatcagaa agtgctgagt 240

atgaattttg caggccagct ggaaaagccg gttgatgtgc agtttgaaga actgggcggc 300

ctgccggtga ttaaagatgc cttagcacag atttcttgtc aggttgttaa tgaagttcag 360

gccggcgatc ataccctgtt tattggcgaa gtgaccgata ttaaaattac cgaacaggac 420

ccgctgctgt tttttagcgg caaatatcat cagttagccc agaatgaaaa agtggaaacc 480

tctagtctcg ag 492

<210> 3

<211> 170

<212> PRT

<213> Lechevalieria aerocolonigenes

<400> 3

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1 5 10 15

His Arg Ala Leu Met Ser Leu Phe Pro Thr Gly Val Ala Val Ile Thr

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Ala Ile Asp Glu Ala Gly Thr Pro His Gly Met Thr Cys Thr Ser Leu

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Thr Ser Val Thr Leu Asp Pro Pro Thr Leu Leu Val Cys Leu Asn Arg

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Ala Ser Gly Thr Leu His Ala Val Arg Gly Gly Arg Phe Gly Val Asn

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Leu Leu His Ala Arg Gly Arg Arg Ala Ala Glu Val Phe Ser Thr Ala

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Val Gln Asp Arg Phe Gly Glu Val Arg Trp Glu His Ser Asp Val Thr

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Gly Met Pro Trp Leu Ala Glu Asp Ala His Ala Phe Ala Gly Cys Val

115 120 125

Val Arg Lys Ser Thr Val Val Gly Asp His Glu Ile Val Leu Gly Glu

130 135 140

Val His Glu Val Val Arg Glu His Asp Leu Pro Leu Leu Tyr Gly Met

145 150 155 160

Arg Glu Phe Ala Val Trp Thr Pro Glu Gly

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<210> 4

<211> 519

<212> DNA

<213> Lechevalieria aerocolonigenes

<400> 4

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ccgcatggta tgacctgtac cagcttaacc tcagtgaccc tagacccgcc gaccttatta 180

gtgtgtctga atcgcgcctc aggcacctta catgccgttc gtggcggtcg ctttggtgtt 240

aatttactgc acgcacgcgg tcgtcgcgca gcagaagtgt tttctaccgc cgttcaggat 300

cgctttggcg aagttcgctg ggaacatagc gatgtgactg gtatgccgtg gttagcagaa 360

gatgcccatg cctttgccgg ctgtgttgtg cgtaaatcaa ccgtggttgg cgatcatgaa 420

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<211> 149

<212> PRT

<213> Thermus thermophilus HB8

<400> 5

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1 5 10 15

Thr Val Val Ala Ala Arg Leu Gly Glu Glu Glu Arg Gly Met Thr Ala

20 25 30

Thr Ala Phe Met Ser Leu Ser Leu Glu Pro Pro Leu Val Ala Leu Ala

35 40 45

Val Ser Glu Arg Ala Lys Leu Leu Pro Val Leu Glu Gly Ala Gly Ala

50 55 60

Phe Thr Val Ser Leu Leu Arg Glu Gly Gln Glu Ala Val Ser Glu His

65 70 75 80

Phe Ala Gly Arg Pro Lys Glu Gly Ile Ala Leu Glu Glu Gly Arg Val

85 90 95

Lys Gly Ala Leu Ala Val Leu Arg Cys Arg Leu His Ala Leu Tyr Pro

100 105 110

Gly Gly Asp His Arg Ile Val Val Gly Leu Val Glu Glu Val Glu Leu

115 120 125

Gly Glu Glu Gly Pro Pro Leu Val Tyr Phe Gln Arg Gly Tyr Arg Arg

130 135 140

Leu Val Trp Pro Ser

145

<210> 6

<211> 456

<212> DNA

<213> Thermus thermophilus HB8

<400> 6

catatgaaag aagcctttaa agaagcctta gcacgctttg caagcggtgt gaccgtggtg 60

gcagcacgtc tgggtgaaga agaacgtggt atgaccgcca ccgcatttat gtctctgagt 120

ctggaaccgc cgctggttgc cttagcagtg tctgaacgcg ccaaattact gccggtgctg 180

gaaggtgcag gcgcatttac cgtgtcactg ttacgcgaag gtcaggaagc agtgagcgaa 240

cattttgccg gtcgtccgaa agaaggtatt gccctggaag aaggtcgcgt taaaggcgca 300

ctggcagtgc tgcgttgtcg cttacatgca ttatatccgg gcggcgatca tcgtattgtt 360

gtgggtttag ttgaagaagt tgaattaggc gaagaaggcc cgccgttagt gtattttcag 420

cgcggctatc gtcgcttagt ttggccgagc ctcgag 456

Claims

1.黄素还原酶在催化芳香化合物生成芳基碘代物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄素还原酶包括依赖NADPH的黄素还原酶和依赖NADH的黄素还原酶。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述催化反应中还加入黄素类辅因子，还原辅因子及碘盐。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄素类辅因子包括黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、核黄素中的任一种，或其类似物中的任一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述还原辅因子包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，或其类似物中的任一种。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄素还原酶的形式为可表达所述黄素还原酶的全细胞、所述黄素还原酶的粗酶、所述黄素还原酶的纯酶中的任一种。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述催化反应中芳香化合物的浓度为0.1～10mM。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应中芳香化合物的浓度为1mM。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述催化反应中所用的缓冲液pH值为pH6.0-8.0，温度为10-50℃。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为pH值为pH7.4的PBS缓冲液，所述温度为35℃。