CN114350594B - 一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，具体培养方法包括：使用微流控细胞芯片分析仪进行细胞培养、试验，具体步骤包括：步骤A：准备；步骤B：肾细胞溶胶液配置；步骤C：肾细胞加样；步骤D：肾细胞培养；步骤E：肝细胞溶胶液配置；步骤F：肝细胞加样；步骤G：肝细胞培养；步骤H，模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞的仿生共培养模型完成；本发明通过使用排出孔逆向进样，实现该设备2种细胞模仿生命代谢流程的仿生共培养；同时通过配制的混合胶液载负着两种细胞进行加样，实现肝、肾两种细胞均匀培养且细胞不混合，实现对人体生命代谢顺序的模仿；并且通过细胞加样顺序的改变，增加了模型培养的成功率和培养效率。

Description

一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法

技术领域：

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法。

背景技术

目前细胞共培养的方法主要有两种，一种是在2D的细胞平皿上进行的细胞共培养，其通过手工加样的方式将两种细胞同时加样于同一个细胞培养空间(细胞培养孔，或细胞培养平皿)，这种方式虽然可以让两种细胞在同一空间共同生长，但无法实现对人体生命代谢顺序的模仿，且细胞培养液与细胞代谢物同时存在于固定空间，细胞代谢物对细胞生长会产生不利影响；另一种是利用微流控技术将两种细胞先后加样于同一细胞培养空间，可以实现对人体生命代谢顺序的模仿，但是这种培养方式需要价格昂贵的专业光刻机，对设计与操作要求极高，且此方法所获得的芯片产品稳定性差，无法大规模推广使用。

而微流控细胞芯片分析仪设备，是一种通用性很好的微流控芯片分析设备，其使用的是统一规格的微流控芯片，但该设备与配套的芯片只能从1个方向加入细胞，因此只能实现1种细胞的培养，其无法实现对2种细胞的模仿生命代谢流程的仿共培养。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明针对微流控细胞芯片分析仪设备的细胞加样方式与细胞加样形式，公开了一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，所述培养方法包括：

步骤A，准备

准备ECM培养液、无菌PBS缓冲液、肾HGECs细胞溶胶液、肝HepG2细胞溶胶液；

将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并将胶垫清洁、灭菌、干燥后备用；

步骤C，肾HGECs细胞加样

微流控细胞芯片静置，芯片盖板后密封抽真空，置于检测设备内进行液体平衡，待微流控细胞芯片中各细胞室中无气泡后，在超净环境下打开芯片盖板，并将微流控细胞芯片中所有孔内液体吸弃，保留芯片中2个正向进样孔、1个排出孔底部环结构内的液体，并对A1、B1、C1、D1号孔中分别加入培养基，之后对微流控芯片以芯片盖板盖装后封口；

所述步骤C中A1、B1、C1、D1号孔中加入的培养基为ECM培养基，300ul/ 孔；

所述步骤C中，完成对A1、B1、C1、D1号孔进行加样后，对第7列的A7、 B7、C7、D7，各孔分别加入上述配制的肾HGECs细胞溶胶液，200ul/孔，完成加样后再对微流控细胞芯片进行盖合、封口；

所述步骤C中，对第七列给压时关闭其他各列的正/负压力，对第7列施以“2-5秒、0.15-0.3Psi，5-11次逆向加压”完成肾HGECs细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室下游端加入后受压逆向进入培养室的下游端的工作；

步骤D，肾HGECs细胞培养

将步骤C中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养6h，完成肾HGECs细胞的培养；

步骤F，肝HepG2细胞加样

将步骤E中完成肾HGECs细胞培养的微流控细胞芯片打开芯片盖板，吸弃第7、8列排出孔中的残液，将A1、B1、C1、D1各孔中ECM培养液补足至300ul/ 孔，再向第6列A6、B6、C6、D6各进样孔中加入肝HepG2细胞溶胶液，50ul/ 孔，将微流控细胞芯片盖合芯片盖板后进行封口，形成微流控细胞芯片内部密闭环境后对微流控细胞芯片的第6列进行正向施压加样；

所述步骤F中对微流控细胞芯片施压条件为：“1-3秒、0.2-0.5Psi压力下5-11次加压”完成肝HepG2细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室上游端正向加样进入细胞培养室上游端的工作；

步骤G，肝HepG2细胞培养

将步骤F中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养 48h，完成肝HepG2细胞模仿人体体内环境下培养的同时，在同一培养室中完成了肝HepG2细胞与肾HGECs细胞共培养；

步骤H，模拟人体组织代谢环境的肝、肾细胞仿生共培养模型完成

进一步的，所述步骤A中还包括：

所述微流控芯片上设置有进液孔1-6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，只留下1、6、7列孔中环内的液体，且在微流控芯片进液孔1-6列中加入无菌PBS缓冲液，室温静置40min。

进一步的，所述步骤A中肾HGECs细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：

步骤B，肾HGECs细胞溶胶液配置

将肾HGECs细胞进行消化、离心后加培养液重悬，得到肾HGECs细胞重悬液；

将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备后配成混合胶，取肾HGECs细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肾HGECs细胞细胞溶胶液，肾细胞溶胶液中肾HGECs 细胞浓度为2×10⁶cells/ml。

进一步的，所述步骤B中混合胶中鼠尾胶原蛋白I型0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％。

进一步的，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为2×10⁷cells/ml。

进一步的，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为112ul，混合胶为768ul。

进一步的，所述步骤A中肝HepG2细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：

步骤E，肝HepG2细胞溶胶液配置

将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备成混合胶，取肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肝HepG2细胞溶胶液，肝细胞溶胶液中肝HepG2细胞浓度为2×10⁶cells/ml。

进一步的，所述步骤E中混合胶的鼠尾胶原蛋白I型0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％。

进一步的，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液为2×10⁷cells/ml。

进一步的，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液28ul，混合胶192ul。

优点效果

本发明改良了微流控细胞芯片分析仪设备的细胞加样方式与流程，通过使用细胞进样孔进行细胞加样的同时，利用细胞代谢液排出孔将溶于混合胶的细胞逆向进样，使微流控细胞芯片分析仪设备实现了正负压细胞加样，并最终实现了2种细胞在同一个细胞培养室中模仿生命代谢流程的仿生共培养；

同时通过经过配制的混合胶制成的细胞溶胶液进行细胞加样，使肝肾两种细胞分别能够独立均匀培养，在两种细胞不会混合的同时，保证了两种细胞各自的生长稳定性，从而实现了对人体生命代谢顺序的仿生培养；

并且通过对原有的细胞加样方式的改变，增加了试验模型培养的仿真程度与成功率，提升了培养效果的真实性与可信度。

附图说明

图1为本发明的对比例1培养效果图；

图2为本发明的对比例2培养效果图；

图3为本发明的实施例1培养效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。

本发明涉及一种模拟人体组织代谢流程的仿生细胞共培养方法，具体培养方法包括：

步骤A，准备

将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌，在超静台干燥后备用，具体的，微流控细胞芯片和芯片盖板利用紫外线照射1小时进行灭菌，胶垫使用酒精擦拭灭菌消毒，并且在超净台内吹干完成干燥，同时将肾HGECs细胞进行消化、离心后加培养液重悬，得到肾HGECs细胞重悬液；具体的，肾HGECs细胞重悬液为2×10⁷cells/ml；

该微流控芯片上设置有进液孔1-6列，排液孔7列和8列，并且将孔内保湿液吸出，只留下1、6、7列孔中环内的液体，防止孔内的保湿液影响细胞培养效果。

同时将微流控芯片进液孔1-6列中加入无菌PBS缓冲液，室温静置40min，使微流控芯片内部压力平衡，调整的适宜pH便于后续细胞培养完成，准备工作。

实验所使用的设备仪器为微流控细胞芯片分析仪。

步骤B，肾HGECs细胞溶胶液配置

将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备成混合胶，并将通过上述步骤A中制得的肾HGECs细胞重悬液与混合胶进行混合，混合后得到肾HGECs细胞溶胶液，并且使肾HGECs细胞溶胶液中肾HGECs细胞浓度为2×10⁶cells/ml；

其中，混合胶的鼠尾胶原蛋白I型为0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％，优选的，步骤B使用的混合胶中鼠尾胶原蛋白I型浓度为1.5mg/mL, 明胶含量的质量百分浓度为8.6％。

通过肾HGECs细胞重悬液112ul和混合胶768ul混合得到肾HGECs细胞溶胶液，并使用肾HGECs细胞溶胶液用于后续加样培养步骤。

如使用常规胶体进行进样，则会产生细胞进入培养室时过于分散，无法形成仿生结构，并且细胞在培养过程中无法形成固定的结构对细胞进行支撑，这时细胞的生长则会在一种无支撑的环境下进行，培养出来的细胞形状松散，并且如果单纯的只加入能起到结构支撑效果的胶体，则又会引起微流控管道堵塞，使用上述配方佐以特定浓度条件，则能够很好的避免上述诸多问题。

步骤C，肾HGECs细胞加样

首先静置微流控细胞芯片，并且在芯片盖板后进行密封且抽真空，同时置于检测设备内进行液体平衡，待微流控细胞芯片中各细胞室中无气泡后，在超净环境下打开芯片盖板，并将微流控细胞芯片中所有孔内液体吸弃，保留芯片中2个正向进样孔、1个排出孔底部环结构内的液体，并对A1、B1、C1和D1号孔中分别加入培养基，之后对微流控芯片以芯片盖板盖装后封口，得到适宜细胞培养条件的微流控芯片，用于后续注入的肾HGECs细胞进行培养，具体的， A1、B1、C1和D1号孔中加入300ul/孔的ECM培养基。

在完成上述对A1、B1、C1和D1号孔进行加样后，对第7列的A7、B7、C7 和D7各孔分别加入步骤B中配制得到的肾HGECs细胞溶胶液，并以200ul/孔的量进行加样，完成加样后再对微流控细胞芯片进行盖合、封口，准备开始肾HGECs 细胞培养。

具体的，在对第7列给压时关闭其他各列的正向压力，对第7列施以“0.15-0.3Psi的压力，每次加压时间为2-5秒，进行5-11次逆向加压”完成溶于混合胶的肾HGECs细胞，在微流控细胞芯片培养室下游端的逆向加样工作。

在对第7列进行施压加样时，优选的，以“0.15Psi的压力，每次2秒的加压时间，进行5次加压；之后再以0.3Psi的压力，每次3秒的加压时间，进行 6次加压”完成对溶于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端的逆向加样工作，之所以选择分两批次分别加压，是因为微流控平板是由围板与底板两部分由粘合胶粘合而成，因此单次长时间过大或过多次的加压可能会导致底板开裂，尤其是当加样时加入了混合胶后会加大抵抗阻力，因此更易导致底板开裂，而当反向加压力，特别是反向初次加压时，这种风险更易发生，因此，本发明结合两种细胞仿生共培养的需求，综合了上述混合胶浓度以及7列孔反向管径耐压性及有效细胞加压压力等因素后，提出了“分批多次加压”与“混合胶”和“第7列孔反向进样”共同构成细胞进样的方法。

在这里需要说明的是，在常规实验中，通常是不会选用通过第7列孔对肾细胞进行加样的，同时微流控细胞芯片分析仪设备使用操作也不建议进行这样操作，本发明中的这种加样方式是与混合胶及细胞加样时间、压力及次数相配合获得的改良方案。

第7列孔在常规条件下被作为细胞培养时或冲洗微流控芯片时的废液排放孔使用，它连通培养室的一侧具有较高的坡台，由于第7列排放孔的结构特点，废液能够沿着由培养室向外界逐渐变低的坡度实现排出。因此，常规操作中不使用第7列进行反向细胞加样。

在常规实验步骤中不推荐第7列排放孔反向进样的原因还有：1-8列各孔分别有自然坡度，这样作为培养室下游的第7列孔是相对最低的，这时，在细胞加样以及注入培养基时容易进行单向进样，因此常规操作中不使用第7列排放孔进行细胞加样。这种情况下，如果改变孔板设计，将第7列排放孔和第8 列排放孔设计为反向增高的坡度，则会导致在细胞培养的时候不易排出细胞培养的代谢产物，此时需要增大培养液冲入来帮助排出培养代谢产物，而加大培养液的冲入量会增大第1列孔的培养液流入细胞培养室的难度；因此改变第7、 8列孔的位置设计的方式也无法实现从第7列孔加样。此外，由于代谢产物的密度不同，如果在培养室内的细胞培养的代谢物在被增高的反置通道中无法充分实现排出高密度的排泄物，最终将影响培养室中正常细胞的生长而无法充分发挥微流控培养细胞的价值与作用。因此，通过提高第7列与第8列孔道位置来自然加入细胞的方式，还会影响后续细胞培养过程中代谢物排出的工作，即：第7列与第8列孔道坡度无法逆转。

进一步地，加样效果除具备上述孔道的设置方式以外，还需要配合混合胶液，并且在一定压力及次数下才能顺利完成加样，如果缺少了混合胶液的配合，细胞会因缺少混合胶液包裹粘连，在通过第7列孔道后，在加样压力下作用下通过培养室，进而持续反向流入1-6列的任一加样孔中，当反向流入第2-5列的药液加样孔时，还会影响加入药液的浓度与药效；如改变加样压力、次数则会影响加样效果。

步骤D，肾HGECs细胞培养

将上述步骤中通过第7列排出孔完成逆向加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养6h，完成肾HGECs细胞培养生长。

步骤E，肝HepG2细胞溶胶液配置

将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别溶解后制备成混合胶，取肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合，具体的，使用为2×10⁷cells/ml的肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肝HepG2细胞浓度为2×10⁶cells/ml的肝HepG2细胞溶胶液。

具体的，其中鼠尾胶原蛋白I型浓度为0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％，优选的，步骤E使用的混合胶中鼠尾胶原蛋白I型浓度为 2.5mg/mL,明胶含量的质量百分浓度为10％。

具体的，步骤B和步骤E中制备混合胶可以使用北京索莱宝科技公司货号为C8062的鼠尾胶原蛋白I型，以及上海阿拉丁公司货号为F1813137的明胶。

步骤B以及步骤E中所使用特定浓度比例混合鼠尾胶原蛋白I型和明胶而成的混合胶状态以及效果最佳，如果使用单一胶种或其中一种胶浓度过高，均会使细胞共培养的效果不理想，即，仅使用流动性强的明胶或混合胶中明胶浓度过高，鼠尾胶原蛋白I型浓度低时，容易造成细胞缺乏骨架支持而使细胞生长的效果不佳，且易使细胞散漫无序的分布于整个培养室而无法只停留于细胞培养室的下游端或上游端，导致肝HepG2与肾HGECs细胞混合而无法实现模拟人体代谢流程的肝HepG2与肾HGECs细胞仿生共培养；仅使用鼠尾胶原蛋白I 型或混合胶中鼠尾胶原蛋白I型浓度过高，明胶浓度低时，则会由于粘合性较强造成管道堵死使细胞无法完成进样(即载有细胞的细胞溶胶液无法进入细胞培养室中)或因缺乏流动性而使平铺细胞的效果不理想，从而同样无法完成模拟人体代谢流程的肝HepG2与肾HGECs细胞这两种细胞的仿生共培养。

而步骤B和步骤E的混合胶的浓度不一样，是因为从第7列孔到培养室下游端的管道长度与从第6列孔到培养室上游端的长度不一样，且第7列处于培养室的下游，其水平高度低于培养室，因此其鼠尾胶原蛋白I型与明胶的浓度整体低于步骤E所对应的第6列加样，浓度低则流动性好，则更易于逆流而上的进入培养室。因此步骤E与步骤B使用的混合胶的配比浓度不同。

通过肝HepG2细胞重悬液28ul和混合胶192ul混合，得到肝HepG2细胞溶胶液。需要说明的是，肾HGECs细胞溶胶液在第7列孔中是以每孔200ul的加样量进行逆向加样的，而肝细胞溶胶液在第6列孔中是以每孔50ul的加样量进行正向加样的，之所以两个孔的加样量不同，是因为微流控芯片的7列孔的体积是6列孔的4倍，所以肾HGECs细胞溶胶液是由肾HGECs细胞重悬液112ul 和混合胶768ul制成，比肝细胞溶胶液的量大很多。

步骤F，肝HepG2细胞加样

将上述步骤D中完成肾HGECs细胞培养的微流控细胞芯片打开芯片盖板，吸弃第7和第8列排出孔中的残液，将A1、B1、C1和D1各孔中ECM培养液补足至300ul/孔，再向第6列A6、B6、C6和D6各进样孔中加入步骤E中制得的肝HepG2细胞溶胶液，并以50ul/孔的量进行加样，将微流控细胞芯片盖合芯片盖板后进行封口，微流控细胞芯片内部形成密闭环境后对微流控细胞芯片进行施压加样。

具体的，在向第6列进样孔进样时，对第6列施以“0.2-0.5Psi的压力，每次加压时间为1-3秒，进行5-11次加压”完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端的正向加样工作。

优选的，在向第6列进样孔进样时，以“0.26Psi的压力，每次1秒的加压时间，进行5次加压；之后再以0.26Psi的压力，每次2秒的加压时间，进行6 次加压”完成肝细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室上游端加样工作。

步骤G，肝HepG2细胞培养

将步骤F中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养 48h，完成肝HepG2细胞模仿人体体内环境培养的同时，在同一培养室中完成了肝HepG2细胞与肾HGECs细胞这两种细胞相对独立的共培养。

步骤H，模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞仿生共培养模型完成

在完成上述全部步骤后，构建完成“模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞仿生共培养模型”，完成了对微流控细胞芯片分析仪的改良，实现了利用肝HepG2 细胞与肾HGECs细胞这两种细胞模仿人体代谢流程的仿生共培养，并将培养后得到的微流控细胞芯片用于相关细胞学研究中进行细胞学的药物干预研究，本文中所指的微流控芯片可以是LNEYA生产的或Mesobiosystem生产的，也可以是密理博生产的MO4S-03哺乳动物细胞类微流控培养芯片(板)。

进行细胞加样的过程中，也可以先从上游(第6列)加入肝细胞进行培养，再从下游(第7列)加入肾细胞进行培养，但由于肝HepG2细胞与肾HGECs细胞这两种细胞贴壁生长的难易程度不同，肝HepG2细胞需要更长的贴壁生长时间，因此先加肝细胞再加肾细胞，需要在第1天加入肝细胞后，等待至第3天才可从下游(第7列)加入肾HGECs细胞进行培养，这样才不至于反向冲散肝 HepG2细胞株群的形态导致肝肾两种细胞在培养过程中无法模拟人体环境。而等肾HGECs细胞贴壁6h后再培养繁殖至可以给药使用的阶段，又需要1-2天，这样整个建模周期增加为4-5天，此时所培养的用于干预评价的细胞的自身活力已经开始下降，这将影响所建立的模型在后期的工作效果。

但先从下游(第7列)加入肾HGECs细胞进行培养，在培养过程中，肾HGECs 细胞比肝HepG2细胞更容易贴壁生长，贴壁生长后肾HGECs细胞固定于细胞培养室下游端，从而不再受到液体冲击影响，所以在肾HGECs细胞培养6h后，就可以从第6列加入肝HepG2细胞，并且在加入时，液体不会冲散培养的已经形成稳定形态的肾HGECs细胞株群。以该种方式进行细胞进样后培养的细胞株，肝HepG2细胞与肾HGECs细胞这两种细胞相互独立的效果明显，并且有效减少了实验模型建立的时间，同时增加了试验模型培养的仿真程度与成功率，提升了培养效果的真实性与可信度。

实施例1

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作；

其中步骤B中使用的混合胶使用浓度为1.5mg/mL的鼠尾胶原蛋白I型和浓度为8.6％的明胶配制而成，在步骤E中使用的混合胶使用浓度为2.5mg/mL的鼠尾胶原蛋白I型和浓度为10.0％的明胶配制而成；

其中步骤C在对第7列孔进行施压肾HGECs细胞加样时，以0.15Psi的压力，每次加压2秒，通过5次加压，之后再以0.3Psi的压力，每次加压3秒，通过6次加压，完成溶于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端的加样工作；

其中步骤F在向第6列进样孔进样时，以0.26Psi的压力，每次加压1秒，通过5次加压；之后再以0.26Psi的压力，每次加压2秒，通过6次加压，完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端的加样工作；

在培养细胞完成后，对细胞株群进行观察。

实施例2

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，本实施例中，选用的条件与实施例1不一样的是：

其中步骤B以及步骤E中使用的混合胶均使用浓度为1mg/mL的鼠尾胶原蛋白I型和浓度为10％的明胶配制而成；

其中步骤C在对第7列孔进行施压肾HGECs细胞加样时，以0.28Psi的压力，每次加压3秒，通过8次加压，完成溶于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端加样工作；

其中步骤F在向第6列进样孔进样时，以0.2Psi的压力，每次加压3秒，通过11次加压，完成肝HepG2细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室上游端加样工作；

在培养细胞完成后，对细胞株群进行观察。

实施例3

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，本实施例中，选用的条件与实施例1不一样的是：

其中步骤B以及步骤E中使用的混合胶均使用浓度为3mg/mL的鼠尾胶原蛋白I型和浓度为5％的明胶配制而成；

其中步骤C在对第7列孔进行施压肾HGECs细胞加样时，以0.17Psi的压力，在5秒内完成11次加压，完成溶于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端的加样工作；

其中步骤F在向第6列进样孔进样时，以0.5Psi的压力在2秒内通过7次加压，完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端加样工作；

在培养细胞完成后，对细胞株群进行观察。

实施例4

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，本实施例中，选用的条件与实施例1不一样的是：

其中步骤B以及步骤E中使用的混合胶均使用浓度为2mg/mL的鼠尾胶原蛋白I型和浓度为7％的明胶配制而成；

其中步骤C在对第7列孔进行施压肾HGECs细胞加样时，以0.2Psi的压力，以每次4秒加压，通过9次加压，完成肾HGECs细胞混合胶在微流控细胞芯片培养室下游端加样工作；

其中步骤F在向第6列进样孔进样时，以0.35Psi的压力在3秒内通过9 次加压，完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端加样工作；

在培养细胞完成后，对细胞株群进行观察。

对比例1

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，但本对比例的步骤C进行肾 HGECs细胞加样时，没有采用由排出孔7进行进样，而是肝HepG2细胞与肾HGECs 细胞这两种细胞均采用常规的使用进样孔6进行加样做的，并且本对比例的步骤B和E没有使用的混合胶制成细胞溶胶液。

对比例2

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，且分别按照操作步骤从第6、第7列进行细胞加样，但本对比例的步骤B和E没有使用的混合胶制成细胞溶胶液。

对比例3

如上述所述实验步骤A到步骤H，进行操作，但本对比例的步骤A到G没有按相应的顺序进行细胞加样，而是先制作肝HepG2细胞溶胶液并完成肝HepG2 细胞加样培养步骤，之后再进行制作肾HGECs细胞溶胶液并进行肾HGECs细胞加样和培养步骤。

具体试验结果参见下表1

表1 试验操作后或细胞培养完成后观察结果

培养结果如图1、2、3所示：

图1是对比例1中两种细胞没有溶于混合胶且均从第6列加样的结果，从图中可以明显看出肝HepG2细胞、肾HGECs细胞这两种细胞散漫杂乱的分布于同一培养室中，无法对肝HepG2细胞与肾HGECs细胞进行区分，没有实现对人体代谢流程的仿生培养。

图2是对比例2中将肾HGECs细胞溶液从排出孔7反向加样，并且将肝HepG2 细胞溶液从加样孔6进行加样，但细胞溶液中均没有与混合胶混合的结果，图中可以明显看出，肝HepG2细胞与肾HGECs细胞虽然得到一定生长，但一方面肝HepG2细胞与肾HGECs细胞分布不均匀、二者无法分离，即，在同一培养室中没有实现两种细胞分别独自的培养；另一方面，因为没有适合于细胞共培养所特殊需要的混合胶，细胞培养缺乏支撑，细胞间没有韧性与粘连性；同样未实现人体代谢的仿生培养。

图3是实施例1中两种细胞分别溶于本发明配制的混合胶后，分别从第7 列、第6列进行加样的结果，其中右侧绿色的细胞为培养室下游的肾HGECs细胞，左侧蓝色细胞为培养室上游的肝HepG2细胞。通过对原有加样方式的改良，利用本发明的混合胶，有效的使两种细胞在同一培养室中形成了从左至右的模仿人体代谢流程的仿生结构。

其改良了微流控芯片原有的细胞进样方式与加样条件，在图3所反应的实施例1方案中，本发明使用了微流控加样的混合胶技术，并且结合从排出孔7 以反向加压的改良方式加入肾HGECs细胞，使肾HGECs细胞从上图的右半端(下游端)中的“7”通道反向进入细胞培养室，利用混合胶的粘稠性将肾HGECs细胞稳定的固定在培养室的右半端，待6小时培养后，再从第6列加入肝HepG2 细胞，同样利用混合胶的粘稠性将肝HepG2细胞稳定的固定在培养室的左半端 (上游端)，培养后的最终效果可以从图中明显看出，培养室中培养的细胞分布均匀，且左半端(上游端)为肝HepG2细胞，右半端(下游端)为肾HGECs 细胞，最终实现了在此平台上将两种细胞以接近人体代谢流程的方式进行仿生共培养。

而原有的方式是，将细胞加样于第6列的4个加样孔中，细胞在“0.26psi 压力、6s加样时间下”，由第6列孔进入细胞培养室中，此加样方式的缺点在于，无法实现两种细胞整齐的依次加样，即无法加入第一种细胞后，让其整齐的分布在培养腔室的下游端(右半端)，也无法让第二种细胞在加样后，能整齐的分布在培养腔室的上游端(左半端)，即目前从第6列进行细胞加样的方式无法实现两种细胞加样后，以模仿人体代谢流程的方式进行细胞仿生共培养。

显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：

步骤A，准备

准备ECM培养液、无菌PBS缓冲液、肾HGECs细胞溶胶液、肝HepG2细胞溶胶液；

其中肾HGECs细胞溶胶液由肾HGECs细胞重悬液与混合胶进行混合制备而成，肝HepG2细胞溶胶液由肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合制备而成；

其中混合胶由鼠尾胶原蛋白I型与明胶制备而成，混合胶中鼠尾胶原蛋白Ⅰ型浓度为0.5-2.5mg/ml，明胶的质量百分浓度为5-10％；

将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并将胶垫清洁、灭菌、干燥后备用；

步骤C，肾HGECs细胞加样

微流控细胞芯片静置，芯片盖板后密封抽真空，置于检测设备内进行液体平衡，待微流控细胞芯片中各细胞室中无气泡后，在超净环境下打开芯片盖板，并将微流控细胞芯片中所有孔内液体吸弃，保留芯片中2个正向进样孔、1个排出孔底部环结构内的液体，并对A1、B1、C1、D1号孔中分别加入培养基，之后对微流控芯片以芯片盖板盖装后封口；

所述步骤C中A1、B1、C1、D1号孔中加入的培养基为ECM培养基，300ul/孔；

所述步骤C中，完成对A1、B1、C1、D1号孔进行加样后，对第7列的A7、B7、C7、D7，各孔分别加入上述配制的肾HGECs细胞溶胶液，200ul/孔，完成加样后再对微流控细胞芯片进行盖合、封口；

所述步骤C中，对第七列给压时关闭其他各列的正/负压力，对第7列施以“2-5秒、0.15-0.3Psi，5-11次逆向加压”完成溶解于混合胶的肾HGECs细胞在微流控细胞芯片培养室下游端加入后,受压逆向进入培养室的下游端的工作；

步骤D，肾HGECs细胞培养

将步骤C中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养6h，完成肾HGECs细胞培养；

步骤F，肝HepG2细胞加样

将步骤E中完成肾HGECs细胞培养的微流控细胞芯片打开芯片盖板，吸弃第7、8列排出孔中的残液，将A1、B1、C1、D1各孔中ECM培养液补足至300ul/孔，再向第6列A6、B6、C6、D6各进样孔中加入溶有肝HepG2细胞的溶胶液，50ul/孔，将微流控细胞芯片盖合芯片盖板后进行封口，形成微流控细胞芯片内部密闭环境后对微流控细胞芯片的第6列进行正向施压加样；

所述步骤F中对微流控细胞芯片施压条件为：“1-3秒、0.2-0.5Psi压力下5-11次加压”,以此条件完成溶于混合胶的肝HepG2细胞在微流控细胞芯片培养室上游端正向加样进入细胞培养室上游端的工作；

步骤G，肝HepG2细胞培养

将步骤F中完成加样的微流控细胞芯片置于5％CO₂、37℃环境下静置培养48h，完成肝HepG2细胞模仿人体体内环境下培养的同时，在同一培养室中完成了肝HepG2细胞与肾HGECs细胞共培养；

步骤H，模拟人体组织代谢流程的肝、肾细胞仿生共培养模型完成。

2.根据权利要求1中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤A中还包括：

所述微流控芯片上设置有进液孔1-6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，只留下1、6、7列孔中环内的液体，且在微流控芯片进液孔1-6列中加入无菌PBS缓冲液，室温静置40min。

3.根据权利要求1中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤A中肾HGECs细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：

步骤B，肾HGECs细胞溶胶液配置

将肾HGECs细胞进行消化、离心后加培养液重悬，得到肾HGECs细胞重悬液，将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备后配成混合胶，取肾HGECs细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肾HGECs细胞溶胶液，肾细胞溶胶液中肾HGECs细胞浓度为2×10⁶cells/ml。

4.根据权利要求3中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤B中混合胶中鼠尾胶原蛋白I型为0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％。

5.根据权利要求3中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为2×10⁷cells/ml。

6.根据权利要求3中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤B中肾HGECs细胞重悬液为112ul，混合胶为768ul。

7.根据权利要求1中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，其特征在于，所述步骤A中肝HepG2细胞溶胶液配置通过下列步骤完成：

步骤E，肝HepG2细胞溶胶液配置

将鼠尾胶原蛋白I型与明胶分别制备成混合胶，取肝HepG2细胞重悬液与混合胶进行混合，得到肝细胞溶胶液，肝细胞溶胶液中肝HepG2细胞浓度为2×10⁶cells/ml。

8.根据权利要求7中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，所述步骤E中混合胶的鼠尾胶原蛋白I型0.5-2.5mg/mL，明胶含量的质量百分浓度为5-10％。

9.根据权利要求7中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液为2×10⁷cells/ml。

10.根据权利要求7中所述的模拟人体组织代谢流程的细胞仿生共培养方法，所述步骤E中肝HepG2细胞重悬液28ul，混合胶192ul。