CN114350540B - 一株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114350540B CN114350540B CN202111447547.2A CN202111447547A CN114350540B CN 114350540 B CN114350540 B CN 114350540B CN 202111447547 A CN202111447547 A CN 202111447547A CN 114350540 B CN114350540 B CN 114350540B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- strain
- tobacco
- twe
- bacterial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 20
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 49
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 49
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 6
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 abstract description 5
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 6
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 4
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 3
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 241000593508 Garcinia Species 0.000 description 2
- 235000000885 Garcinia xanthochymus Nutrition 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241000192023 Sarcina Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- YDEXUEFDPVHGHE-GGMCWBHBSA-L disodium;(2r)-3-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[2-methoxy-4-(3-sulfonatopropyl)phenoxy]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].COC1=CC=CC(C[C@H](CS([O-])(=O)=O)OC=2C(=CC(CCCS([O-])(=O)=O)=CC=2)OC)=C1O YDEXUEFDPVHGHE-GGMCWBHBSA-L 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960001867 guaiacol Drugs 0.000 description 2
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 229920005611 kraft lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000019505 tobacco product Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一株芽孢杆菌，该芽孢杆菌于2021年04月27日以芽孢杆菌Bacillus sp.MZ‑4E4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2021465；本发明进一步将前述所述的芽孢杆菌应用于高浓度烟草废弃物水提液；在一些实施方式中，将前述所述的芽孢杆菌接入高浓度烟草废弃物水提液中进行发酵，并将发酵物制作成烟草薄片。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及到一株具有改善再造烟叶品质的芽孢杆菌及其分离方法及应用。
背景技术
烟草是我国十分重要的经济作物之一。我国年产烟叶约500万吨，烟秆约216万吨。收获的烟叶最主要的用途便是用来制作成卷烟或其它的烟草制品，在烟叶或卷烟的加工过程中会产生约占原料三分之一的边角料，如烟梗、碎烟叶、烟末、低档次烟叶等，称为烟草废弃物。并且，目前主要使用造纸法再造烟叶技术对这些烟草废弃物进行回收利用，将其制备成再造烟叶（Reconstituted Tobacco），又称烟草薄片或再造烟草。再造烟叶的性状接近或优于天然烟叶的产品，一般为片状或丝状，在卷烟中充当填充料。通过添加适量的烟草薄片，可以降低卷烟的生产成本、节省烟草原料、提高烟草利用率、并改善卷烟的物理性能，从而达到降焦、减害的目的。
在造纸法再造烟叶的工艺流程中，经过固液分离、液处理和薄膜浓缩获得了高浓度烟草废弃物水提液（Tobacco waste extract，TWE），是一种十分重要的中间产物。TWE是一种高浓度的植物水提取液，含有大量的烟草内源水溶性化合物，密度为1.3 g/cm3，pH值为4，还原糖含量为163.8 g/L，尼古丁含量为19.5 g/L（根据具体的工艺及烟草原料，其具体数值会有些变化）。因此，可将TWE视为一种具有环境胁迫的逆境。
TWE中含有大量的微生物，但绝大部分都无法适应该环境。目前，国内外在微生物调控TWE领域中的研究较少，主要分为三个方面，一是从烟草组织或根际土壤中分离得到微生物用于调控TWE，二是从TWE中分离获得微生物用于调控TWE，三是使用外源性微生物用于调控TWE。并且，这些研究的调控对象大多是低浓度的TWE稀释液（5-20%），菌株的抗逆性不足，尚未见在高浓度TWE中具有调控能力的微生物报道，本领域需寻求一种在TWE具有高抗逆性、且能够改善再造烟叶品质的菌株。
发明内容
鉴于以上研究背景，本发明的主要目的在于提供一株在TWE中具有能够改善再造烟叶品质的菌株。
具体地，本发明实施方式提供一株芽孢杆菌，该芽孢杆菌于2021年04月27日以芽孢杆菌Bacillus sp. MZ-4E4 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2021465。
在一些实施方式中，该菌株的菌株MZ-4E4的16S rDNA序列如SEQID NO:1所示。
本发明进一步将前述所述的芽孢杆菌应用于高浓度烟草废弃物水提液；在一些实施方式中，将前述所述的芽孢杆菌接入高浓度烟草废弃物水提液中进行发酵，并将发酵物制作成烟草薄片。
本发明提供一株芽孢杆菌Bacillus sp. MZ-4E4，该菌株能够在TWE 80%稀释液中（还原糖含量为131.0 g/L，尼古丁含量为15.6 g/L）进行正常的代谢活动，将其培养过的TWE 80%稀释液制作成烟草薄片，其品质有显著的提高，尤其是在香气上有比较明显改善。
附图说明
图1为抗逆菌株MZ-4E4的形态学观察结果（a为菌株在LB平板上的菌落形态，b为相差显微镜下的观察结果，c为透射电镜下的观察结果，d为菌株与藤黄八叠球菌共同进行革兰氏染色的结果，e为藤黄八叠球菌的革兰氏染色结果）；
图2为菌株MZ-4E4的系统发育树。
具体实施方式
从TWE中分离纯化抗逆性菌株的方法，包括下述步骤：
1）微生物的富集培养：量取5 mL TWE，加入20 mL无菌水进行搅拌稀释，于3000rpm中离心2 min，取上清液，再于5000 rpm中离心2 min，弃上清液，加入1 mL无菌水进行重悬，接入装有100 mL pH=4的酸性LB培养基（Luria-Bertani medium）的摇瓶中，40℃、180rpm富集培养3-5 d。
2）TWE稀释平板的梯度筛选及富集培养：待上述菌液浑浊时，于5000 rpm下离心2min，弃上清；加入5 mL无菌水进行重悬、洗菌，再于5000 rpm下离心2 min，弃上清，重复一次洗菌、离心弃上清，最后用2 mL无菌水重悬备用。同时，使用蒸馏水配置体积分数分别为10%、20%、40%、60%、80%的TWE稀释液，并加入2%的琼脂粉，灭菌，并将其制备成固体平板。取200 μL重悬菌液接入TWE 10%稀释平板，涂布均匀，封口膜封口，10组平行，倒置于40℃培养箱中，静置3-7 d。待到平板上有明显的菌落或菌苔长出时，从平行组内挑取长势最好的一块平板，取2 mL灭过菌的生理盐水将其上的菌苔或菌落洗下并收集，取200 μL菌液涂布于20% TWE稀释平板，封口膜封口，10组平行，倒置于40℃培养箱中，静置3-7 d；并依此办法，依次将菌液涂布于TWE 40%、60%、80% 稀释平板上。
3）菌株的分离纯化：用2 mL生理盐水将TWE 80%稀释平板上长出的菌落或菌苔洗下，并稀释100倍与1000倍，分别取100 μL稀释菌液涂布于80% TWE稀释平板上， 3组平行，封口膜封口，倒置于40℃培养箱中，静置3-7d；等平板上长出单菌落时，同一组平行板上至少挑取5个单菌落于1 mL生理盐水中重悬，稀释100倍与1000倍，分别取100 μL菌液涂布于TWE 80%稀释平板上，3组平行，封口膜封口，倒置于40℃培养箱中，静置3-7d。
通过以上步骤，可从TWE中分离获得大量的抗逆菌株，需要进行复筛，包括下述步骤：
1）扩培与保藏：待菌株分离纯化完成，即TWE 80%平板上长出单菌落后，挑取单菌落于100 mL的Luria-Bertani培养基中，37℃，180 rpm中过夜培养。转接一次。待OD600=0.8时，取875 μL的菌液与125 μL的80%甘油于1.5 mL的离心管中，混匀，制备3次，于-40℃保藏。
2）发酵：同时，即OD600=0.8时，取20%接菌量的菌液于5000 rpm下离心2 min，弃上清；加入5 mL生理盐水进行重悬、洗菌，再于5000 rpm下离心2 min，弃上清，重复一次洗菌、离心弃上清，最后用1 mL生理盐水重悬。将重悬菌液接入装有100 mL的TWE 80%稀释液的锥形瓶中，摇晃均匀，于40℃的隔水式恒温培养箱中静置发酵5 d。每天定时摇晃瓶身0.5min。
3）葡萄糖浓度的测定：取1 mL待测样品（TWE发酵液），用蒸馏水将之稀释100倍，吸取25 μL于SBA生物传感分析仪进行葡萄糖浓度的测定。
4）以 100 mL的TWE原液和TWE 80%稀释液作为发酵体系进行第二轮的复筛，重复1）到3）。
通过以上步骤，并以葡萄糖的消耗量来衡量菌株在TWE中代谢活性的强弱，可从大量的抗逆菌株中复筛获得优势菌株，该芽孢杆菌于2021年04月27日以芽孢杆菌Bacillussp. MZ-4E4 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2021465。
1）发酵：方法同复筛中的1）和2），不同的是将发酵体系从100 mL改成200 mL的TWE80%稀释液；发酵5 d。
2）评吸：发酵结束后，将发酵液送往杭州利群环保纸业有限公司进行烟草薄片的制备与评吸。
通过以上步骤，确认了菌株MZ-4E4能够显著提高烟草薄片的品质。同时，通过一些实验用于确认该菌株的一些特性。
1）形态学观察：将已活化好的菌株划线接种于LB固体平板上，于37℃倒置培养2d。观察菌落形态。再挑取单菌落于1 mL无菌水中重悬，取200 μL用于相差显微镜观察，并取200 μL用于革兰氏染色并于普通光学显微镜下观察。从平板上刮取菌落，200 μL无菌水重悬，200目铜网捞取样品，醋酸铀染色，无菌水洗去多余染液，烘干固定，用于透射电镜观察。
2）生理生化实验：进行了可溶性淀粉水解酶活性实验，MR-VP实验，LB中酸碱耐受性实验，LB中尼古丁耐受实验。
3）唯一碳源利用特性：称取2 g的待测碳源与2 g琼脂粉加入100 mL的 MSM培养基中，灭菌，制备成平板，将已活化且洗过的菌液涂布于其上，37℃中倒置培养2-5 d。其中，待测碳源为葡萄糖，Kraft木质素，羟甲基纤维素钠300-800 mPa·s，木质素磺酸钠，木聚糖，葡聚糖4万 Dextran，D-木糖，D-（+）纤维二糖，愈创木酚，D-果糖，麦芽糖，蔗糖，D-甘露糖，尼古丁，共14种。
4）16S rDNA序列的测定：将待测菌株划线于LB平板上培养1d，挑单菌落于20 μL无菌水中，吹打均匀。以菌液作为DNA模板，使用细菌通用引物27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3’）与1492R（5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）扩增菌株的16S rDNA序列。PCR扩增体系为：2x PhantaMaster Mix 25 μL，DNA模板1 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL和蒸馏水20 μL。PCR反应程序为：95℃保持3 min，95℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，30个循环，最终72℃保持10 min。 PCR产物通过切胶和纯化的序列进行测序。 NCBI核苷酸碱基局部比对搜索工具（BLAST）用于分析数据。通过MEGA软件，使用ClusterW和Neighbor-joinging法进行系统发育树的构建。
（1）形态学观测结果：对筛选获得的功能性菌株MZ-4E4进行详细的形态学观察，结果如图1所示。其中，革兰氏染色与相差显微镜的观察结果均是在100倍的油镜下获得，透射电镜的观察结果是在5000倍下获得。
由图1可知，菌株MZ-4E4的菌落颜色偏白，单一菌落的边缘较为规则成圆形或椭圆形，菌落中间凸起，晶莹水润不透明，相邻的菌落在生长过程中易彼此相连、边缘融合，形成一条带共同生长，且条带的中间将从凸起变为略有下凹，生长较久的菌落表面会形成一层白色粗糙干燥的菌膜。并且，菌株MZ-4E4为革兰氏阳性菌，短杆状，无鞭毛，菌体长1.5-2.0μm，宽0.6-0.8 μm。
（2）生理生化实验及唯一碳源利用特性：对菌株MZ-4E4进行了一些生理生化实验的鉴定，结果如表1所示；另外，还检测了其对13种唯一碳源的利用特性，结果如表2所示。并且，在表1和表2中，“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
表1 菌株MZ-4E4的生理生化实验结果
| 生化实验 | MZ-4E4 |
| 淀粉水解酶 | - |
| MR | - |
| VP | - |
| 酸碱耐受性(pH) | 5-10 |
| LB中尼古丁耐受性(g/L) | 8 |
表2 菌株MZ-4E4的唯一碳源利用特性
| 唯一碳源 | MZ-4E4 | 唯一碳源 | MZ-4E4 |
| 葡萄糖 | + | D-木糖 | + |
| Kraft木质素 | + | 愈创木酚 | - |
| 羟甲基纤维素钠300-800 mPa·s | + | D-果糖 | + |
| 木质素磺酸钠 | + | 麦芽糖 | + |
| 木聚糖 | + | 蔗糖 | + |
| 葡聚糖4万Dextran | + | 尼古丁 | + |
| D-（+）纤维二糖 | + | D-甘露糖 | + |
（3）16S rDNA序列及系统发育树：经过16S rDNA序列检测，得知菌株MZ-4E4的16SrDNA序列为：
序列1：
AAAAGACTTTCTTCCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATTATAGCAGCCGGCA
将MZ-4E4的16S rDNA序列置于NCBI上通过BLAST比对，发现与Bacillus velezensis CBMB205的同源性最高，E-value为0.0，Query Cover值为98%，Per.Ident值为99.79%；从BLAST比对结果中选择10株菌株的16S rDNA序列，加上本实验室先前分离获得的Bacillus subtilis SM，Pseudomonas sp. JY-Q和其他一些菌株的16S rDNA序列，通过MEGA软件，使用ClusterW和Neighbor-joinging法构建系统发育树，如图2所示。
从MZ-4E4的系统发育树可知，MZ-4E4不被归类为芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、拟杆菌属（Bacteroides），有可能为一新属的菌株，因此在做更详细的鉴定实验之前，先基于其BLAST的比对结果 ，将其归类为芽孢杆菌属，并将其命名为Bacillus sp. MZ-4E4。
（4）评吸结果：以MZ-4E4在TWE 80%稀释液中发酵5 d后的发酵液作为原料，并将发酵液与烟梗浓缩液按55:45（v:v）的比例配成浸涂液，手工涂布，晾干，切丝，不进行配伍，以再造烟叶制样。评吸结果如表3所示。
由表3可知，菌株MZ-4E4能够在多个评分项上有所提高，总体来说，较显著地改善了再造烟叶的品质。
表3 MZ-4E4的评吸结果
序列表
<110> 浙江中烟工业有限责任公司
<120> 一株芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
aaaagacttt cttccttcgg cggctggctc ctaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 60
acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc 180
cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct 240
gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac 360
taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420
gacaaccatg caccacctgt cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt 480
cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540
accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca 600
ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc 660
actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720
gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc 780
tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc 840
agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc 900
ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt 1020
tgaacggcac ttgttcttcc ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc 1080
acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc 1140
gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac 1200
gcatcgtcgc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct 1260
gtaagtggta gccgaagcca ccttttatgt ctgaaccatg cggttcagac aaccatccgg 1320
tattagcccc ggtttcccgg agttatccca gtcttacagg caggttaccc acgtgttact 1380
cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa gctcccatct gtccgctcga cttgcattat 1440
agcagccggc a 1451
Claims (4)
1.一株芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌于2021年04月27日以芽孢杆菌Bacillussp.MZ-4E4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2021465。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，该菌株的菌株MZ-4E4的16S rDNA序列如SEQID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌在高浓度烟草废弃物水提液中的应用，其中，将前述所述的芽孢杆菌接入高浓度烟草废弃物水提液中进行发酵，并将发酵物制作成烟草薄片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将前述所述的芽孢杆菌接入TWE 80%稀释液发酵。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111447547.2A CN114350540B (zh) | 2021-11-30 | 2021-11-30 | 一株芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111447547.2A CN114350540B (zh) | 2021-11-30 | 2021-11-30 | 一株芽孢杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114350540A CN114350540A (zh) | 2022-04-15 |
| CN114350540B true CN114350540B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=81097063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111447547.2A Active CN114350540B (zh) | 2021-11-30 | 2021-11-30 | 一株芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114350540B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103725632A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-04-16 | 浙江中烟工业有限责任公司 | 一株从烟末浓缩液分离的枯草芽孢杆菌sm及其在造纸法再造烟叶中的应用 |
| CN108004184A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-05-08 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法 |
-
2021
- 2021-11-30 CN CN202111447547.2A patent/CN114350540B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103725632A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-04-16 | 浙江中烟工业有限责任公司 | 一株从烟末浓缩液分离的枯草芽孢杆菌sm及其在造纸法再造烟叶中的应用 |
| CN108004184A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-05-08 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114350540A (zh) | 2022-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111876351B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用 | |
| CN106754557B (zh) | 枯草芽孢杆菌ybm-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 | |
| Rani et al. | Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii UAC09 using coffee cherry husk | |
| CN109207404B (zh) | 暹罗芽孢杆菌yj15及其应用 | |
| CN114854627B (zh) | 一株防治青枯病的荧光假单胞菌及其应用 | |
| CN114875016B (zh) | 一种适合荧光假单胞菌的制剂化载体及其菌剂 | |
| CN111763643A (zh) | 一种防治花生根腐病的复合菌群及其应用 | |
| CN110591957A (zh) | 一株耐盐苜蓿根瘤菌及其应用 | |
| CN113061551B (zh) | 一种生防链霉菌在防治植物病害病原菌中的应用 | |
| CN109321500B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用 | |
| CN113846039A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN110396485B (zh) | 产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114921375A (zh) | 一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN106635926B (zh) | 沙福芽孢杆菌yjc-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 | |
| CN110804566B (zh) | 防治七叶一枝花根腐病的芽孢杆菌及其制备方法与应用 | |
| CN114350540B (zh) | 一株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108841743B (zh) | 寒地秸秆腐熟细菌菌株及其制备方法和应用 | |
| CN109679881B (zh) | 一种菠萝泛菌及其菌剂和应用 | |
| CN116555066B (zh) | 一种pbat农膜高效降解菌及其应用 | |
| CN116676211A (zh) | 一种防治枫香刺小蠹的粘质沙雷氏菌及其应用 | |
| CN114540249B (zh) | 拮抗菌株1x1y及其应用 | |
| CN114456973B (zh) | 一株烟草内生娄彻链霉菌及在烟草病害防控中的应用 | |
| CN106591176B (zh) | 一种戊糖乳杆菌及其应用 | |
| CN113832071A (zh) | Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用 | |
| CN113046249A (zh) | 一株蜡蚧轮枝菌ll-01及其生防应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |