CN114344546A - 一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程技术领域，公开了一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，包括(1)伊利石纳米粉末的活化；(2)取TPU颗粒、活化的伊利石纳米粉末、透明质酸、血竭红素、水蛭素、胸腺素β4加入DMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；(3)取胶原蛋白酶、活化的伊利石纳米粉末加入六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入胶原蛋白、三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；(4)同轴电纺制备纳米纤维；(5)PVP层的包覆。本发明制备的伤口敷料能够在伤口愈合初期止血抗菌，后期除淤血、抗疤痕。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法。
背景技术
疤痕的形成是由于机体炎症反应，胶原的合成与降解不平衡、异常粘多糖的出现以及纤维细胞的增生所造成。同时伴随着皮下淤血凝结不化，导致疤痕由浅红逐渐变深。常规伤口敷料只具有抗伤口感染和促进伤口愈合的作用，不具备减轻疤痕的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，该伤口敷料能够在伤口愈合初期止血，后期除淤血的抗疤痕。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1：取粒径20-30nm的伊利石粉末，采用真空超声法，先酸液洗、再用碱液洗，之后用纯水洗涤至中性，真空干燥得活化的伊利石纳米粉末；
S2：取TPU颗粒、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、透明质酸、血竭红素、水蛭素、胸腺素β4加入DMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；
S3：取胶原蛋白酶、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末加入六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入胶原蛋白、三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；
S4：采用步骤S2和步骤S3制备的芯层纺丝液和壳层纺丝液进行同轴静电纺丝，得到纳米纤维膜；
S5：将PVP溶于氯仿，加入纳米银、蜂蜡，4℃充分搅拌后，将步骤S4制备的纳米纤维膜浸泡其中，取出真空干燥，得到伤口敷料。
优选的，步骤S1中，真空度为2-10mmHg，超声功率为300-600W，酸液洗采用质量分数10-20％高氯酸溶液，碱液洗采用40-80g/L氢氧化钠溶液。
优选的，步骤S2中，所述TPU颗粒、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、透明质酸、血竭红素、水蛭素、胸腺素β4和DMF的投料比为：(1-1.3)g:(100-120)mg:(50-80)mg:(20-34)mg:(1-3)mg:(1-2)mg:10mL。
优选的，步骤S3中，所述胶原蛋白酶、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、六氟异丙醇、胶原蛋白和三七提取物的投料比为：(5-8)mg:(100-120)mg:10mL:(500-900)mg:(20-50)mg。
优选的，步骤S3中，所述胶原蛋白酶的比活力为125-300CDU/mg。
优选的，步骤S4中，所述同轴静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头，7号针；所述静电纺丝条件为：电压15-20KV，距离10-15cm，芯层进样速率0.3-0.7mL/h，壳层进样速率0.5-1.0mL/h，温度25-35℃，收集板为硅油纸。
优选的，步骤S5中，所述纳米银、蜂蜡、PVP和氯仿的投料比为：(50-80)mg:(0.3-0.8)g:(1.0-1.5)g:10mL。
优选的，步骤S5中，所述浸泡的浴比为1:10-1:15。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用多层差别化纳米纤维包载药物以实现程序性释放效果。纤维外表面附加的PVP层极易溶于水，能够在敷料作用到伤口的最初时刻释放，具有强效抗菌作用；纤维胶原蛋白壳层其中的三七提取物能够快速凝血止血，在伤口愈合进入增殖期时，胶原蛋白壳层被胶原蛋白酶水解，使吸附在伊利石粉末上的胶原蛋白酶逐渐释放进伤口环境中，可以防止胶原合成与降解不平衡。当伤口愈合进入到增殖期和成熟期，TPU芯层中的血竭红素和水蛭素释放以促进皮下淤血快速降解，透明质酸的释放竞争性地抑制了异常粘多糖的堆积，同时释放的胸腺素β4促进毛囊干细胞的激活和分化。
附图说明
图1是实施例1伤口敷料A的扫描电镜照片。
图2是实施例1伤口敷料A的药物释放曲线。
图3是伤口愈合面积的测定结果。
图4是伤口愈合实验疤痕面积测定的结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1、取粒径25nm的伊利石粉末，在真空度5mmHg下，480W超声，先用质量分数12％高氯酸溶液洗涤、再用50g/L氢氧化钠溶液洗涤，之后用纯水洗涤至中性，真空干燥得活化的伊利石纳米粉末；
2、取1.2gTPU颗粒、115mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末、72mg透明质酸、30mg血竭红素、2mg水蛭素、1.3mg胸腺素β4加入10mLDMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；
3、取7mg比活为240CDU/mg的胶原蛋白酶、115mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末加入10mL六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入800mg胶原蛋白、28mg三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；
4、采用10mL注射器，7号平头针电压18KV，距离12cm，芯层进样速率0.5mL/h，壳层进样速率0.8mL/h，温度30℃，收集板为硅油纸进行同轴静电纺丝，得到纳米纤维膜；
5、将1.3gPVP溶于10mL氯仿，加入65mg纳米银、0.5g蜂蜡，4℃充分搅拌后，将步骤4制备的纳米纤维膜浸泡其中，浴比1:12，取出真空干燥，得到伤口敷料A，扫描电镜照片如图1所示。
实施例2：
1、取粒径20nm的伊利石粉末，在真空度2mmHg下，300W超声，先用质量分数10％高氯酸溶液洗涤、再用40g/L氢氧化钠溶液洗涤，之后用纯水洗涤至中性，真空干燥得活化的伊利石纳米粉末；
2、取1gTPU颗粒、120mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末、50mg透明质酸、34mg血竭红素、1mg水蛭素、1mg胸腺素β4加入10mLDMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；
3、取5mg比活为300CDU/mg的胶原蛋白酶、120mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末加入10mL六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入500mg胶原蛋白、20mg三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；
4、采用10mL注射器，7号平头针电压15KV，距离15cm，芯层进样速率0.3mL/h，壳层进样速率0.5mL/h，温度35℃，收集板为硅油纸进行同轴静电纺丝，得到纳米纤维膜；
5、将1gPVP溶于10mL氯仿，加入50mg纳米银、0.8g蜂蜡，4℃充分搅拌后，将步骤4制备的纳米纤维膜浸泡其中，浴比1:10，取出真空干燥，得到伤口敷料B。
实施例3：
1、取粒径30nm的伊利石粉末，在真空度10mmHg下，600W超声，先用质量分数20％高氯酸溶液洗涤、再用80g/L氢氧化钠溶液洗涤，之后用纯水洗涤至中性，真空干燥得活化的伊利石纳米粉末；
2、取1.3gTPU颗粒、100mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末、80mg透明质酸、20mg血竭红素、3mg水蛭素、2mg胸腺素β4加入10mLDMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；
3、取8mg比活为125CDU/mg的胶原蛋白酶、100mg步骤1制备的活化的伊利石纳米粉末加入10mL六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入900mg胶原蛋白、50mg三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；
4、采用10mL注射器，7号平头针电压20KV，距离10cm，芯层进样速率0.7mL/h，壳层进样速率1.0mL/h，温度25℃，收集板为硅油纸进行同轴静电纺丝，得到纳米纤维膜；
5、将1.5gPVP溶于10mL氯仿，加入80mg纳米银、0.3g蜂蜡，4℃充分搅拌后，将步骤4制备的纳米纤维膜浸泡其中，浴比1:15，取出真空干燥，得到伤口敷料C。
药物释放曲线
取100mg实施例1制得的伤口敷料浸没在50mL PBS中，37℃下振荡孵育，隔一段时间取1mL清液进行银、胶原蛋白酶、三七提取物、血竭素、水蛭素、透明质酸、胸腺素β4含量测定，每次取样后同时再补充1mLPBS。以伤口敷料中原始药物载量记为100％，结果如图2所示。
银采用ICP-OES方法进行测定。
胶原蛋白酶的含量以酶活力作为评价。具体如下：以不溶性胶原作为底物，反应体系为：0.8mL50mmol/LpH7.5Tris-HCl缓冲液、4mmol/LCaCl2、10mg不溶性胶原，37℃水浴10min，加入0.2mL样品，37℃水浴30min，再加1mL 0.1mol/L醋酸溶液终止反应。反应体系10000rpm离心后，上清液用凯氏定氮法测定有机氮含量，酶活力定义为：每分钟产生1μmol有机氮为一个酶活力单位。
三七提取物以三七皂苷R1作为指标，采用高效液相色谱法测定。色谱柱：UltimateAQ-C18250×4.6mm，5μm；进样量：20μL；检测波长：203nm；柱温：25℃。流动相：梯度洗脱0-12min乙腈:水＝19:81；12-60min乙腈:水＝(19→36)：(81→64)。流速1mL/min。
血竭素采用高效液相色谱法测定。色谱柱：UltimateAQ-C18250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈:0.05mol/L磷酸二氢钠溶液＝50:50；流速1mL/min；检测波长440nm；柱温40℃。
水蛭素含量采用凝血酶滴定法测定。
含牛纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液的配制：0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25mL与0.1mol/L盐酸溶液约40mL，加水至100mL，调节pH值至7.4，加入牛纤维蛋白原0.5g。
凝血酶溶液的配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1mL含凝血酶40个单位的溶液。
生理盐水的配制：0.9g氯化钠加入到100mL去离子水中，搅拌溶解。
取100μL样品，置离心管中，加入含牛纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液200μL，摇匀，置37℃水浴中5分钟，滴加凝血酶溶液，每1分钟滴加1次，每次2μL，边滴加边轻轻摇匀至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，以凝血酶用量作为水蛭素含量。
透明质酸含量采用透明质酸定量测定试剂盒测定。
胸腺素β4含量采用人胸腺素β4(Tβ4)检测试剂盒测定。
由图2可知，本申请实施例制备的伤口敷料中各药物的释放是具有时序性的。最先释放的是纳米银和三七皂苷R1，这些药物的释放有利于控制伤口卫生环境并且凝血止血。第二阶段，胶原蛋白酶释放后用来控制胶原的合成和降解平衡，防止胶原合成过快，形成堆积，造成疤痕。之后血竭素、水蛭素用来活血化瘀，透明质酸抑制了异常粘多糖的堆积，胸腺素β4则激活了再生皮肤中毛囊干细胞的分化，有助于消除疤痕。
伤口愈合实验及疤痕面积测定
取25只C57BL雄性小鼠，用无菌皮肤打孔器在小鼠背部剥离全层皮肤，伤口直径1.5cm。之后用实施例1-3的伤口敷料及医用纱布分别覆盖伤口并固定，每组5只。剩余5只小鼠不使用敷料作为空白对照观察。每3天检查伤口区域，拍照并通过ImageJ软件分析伤口面积，结果如图3所示。图4显示了第15天软件分析伤口愈合疤痕面积的结果。
由图3和图4可知，本申请实施例的伤口敷料处理后，伤口愈合加快，同时疤痕组织也显著减小。表明该伤口敷料能够缩短伤口愈合周期，同时达到除淤血、抗疤痕的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取粒径20-30nm的伊利石粉末，采用真空超声法，先酸液洗、再用碱液洗，之后用纯水洗涤至中性，真空干燥得活化的伊利石纳米粉末；
S2：取TPU颗粒、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、透明质酸、血竭红素、水蛭素、胸腺素β4加入DMF中，4℃搅拌得到芯层纺丝液；
S3：取胶原蛋白酶、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末加入六氟异丙醇，4℃搅拌过夜，再加入胶原蛋白、三七提取物，4℃搅拌得到壳层纺丝液；
S4：采用步骤S2和步骤S3制备的芯层纺丝液和壳层纺丝液进行同轴静电纺丝，得到纳米纤维膜；
S5：将PVP溶于氯仿，加入纳米银、蜂蜡，4℃充分搅拌后，将步骤S4制备的纳米纤维膜浸泡其中，取出真空干燥，得到伤口敷料。
2.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述真空超声法的真空度为2-10mmHg，超声功率为300-600W，所述酸液洗采用质量分数10-20％高氯酸溶液，所述碱液洗采用40-80g/L氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述TPU颗粒、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、透明质酸、血竭红素、水蛭素、胸腺素β4和DMF的投料比为：(1-1.3)g:(100-120)mg:(50-80)mg:(20-34)mg:(1-3)mg:(1-2)mg:10mL。
4.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述胶原蛋白酶、步骤S1制备的活化的伊利石纳米粉末、六氟异丙醇、胶原蛋白和三七提取物的投料比为：(5-8)mg:(100-120)mg:10mL:(500-900)mg:(20-50)mg。
5.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述胶原蛋白酶的比活力为125-300CDU/mg。
6.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述同轴静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头，7号针；所述静电纺丝条件为：电压15-20KV，距离10-15cm，芯层进样速率0.3-0.7mL/h，壳层进样速率0.5-1.0mL/h，温度25-35℃，收集板为硅油纸。
7.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述纳米银、蜂蜡、PVP和氯仿的投料比为：(50-80)mg:(0.3-0.8)g:(1.0-1.5)g:10mL。
8.根据权利要求1所述的一种减轻疤痕产生的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述浸泡的浴比为1:10-1:15。
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| PB01 | Publication | ||
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