CN114344478A - 一种e-选择素修饰的脂质体靶向给药系统及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种E‑选择素修饰的脂质体靶向给药系统及其制备方法与应用。首先，本发明提供了一种E‑选择素修饰的脂质体靶向给药系统及其制备方法，其包括S1、DSPE‑PEG‑NTA的制备；S2、DSPE‑PEG‑NTA修饰脂质体；S3、E‑选择素修饰DSPE‑PEG‑NTA修饰的脂质体。其次，本发明还提供了一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物，其是由本发明提供的靶向给药系统上负载抗肿瘤药物得到的。E‑选择素修饰的脂质体纳米靶向给药系统，能提高药物的靶向性，不仅能有效减小原位肿瘤的大小，还能有效减少转移灶的形成，能大大的提高患者的生存周期。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域。具体而言，本发明涉及一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康，尤其对于晚期癌症具有高复发率、易发转移、治疗预后差等特点,预后不良，是目前临床治疗所面对的主要挑战。目前,手术、化疗和放疗是癌症临床治疗的三大手段,已广泛应用于肿瘤的治疗,但对已经发生的转移的恶性肿瘤却难以产生有效的抑制作用。理想的肿瘤治疗策略不仅能够高效、安全地根除原位肿瘤,而且还能有效地清除残留的肿瘤灶，尤其是可针对具有高度成瘤性质的循环肿瘤细胞,防止肿瘤的转移和复发。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统。
本发明的另一个目的在于提供所述E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物。
本发明的另一个目的在于提供所述用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统的制备方法，其包括：
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
将DSPE-PEG-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG-NTA；
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体：
采用薄膜分散法将对脂质体进行DSPE-PEG-NTA的修饰，得到DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下将步骤S2中得到的DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统。
优选地，步骤S1中所述的第一溶剂为混合有机溶剂；优选为甲醇和乙醇的混合溶剂；进一步优选为甲醇和乙醇的体积比为2:1；
所述第二溶剂为混合溶剂，优选为甲醇、去离子水和三乙胺的混合溶剂；进一步优选为甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01。
优选地，步骤S1中第一溶剂为混合溶剂第一溶液中DSPE-PEG-NHS的浓度为10-30mg/mL；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL。
优选地，步骤S2中薄膜分散法的具体操作为：
将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NTA和DSPE-PEG溶于有机溶剂中，然后去除所述有机溶剂形成脂质薄膜，加入PBS溶液使脂质薄膜水化，冰浴探头超声2-8min，得到DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体；
其中，卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NTA和DSPE-PEG的摩尔比为2：1：0.1-0.5：0-0.12。
优选地，步骤S3中所述的镍盐包括六水合氯化镍、无水氯化镍、醋酸镍、硫酸镍、溴化镍中的一种或多种。
优选地，所述镍盐的用量为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1-1.2倍；
所述E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
第二方面，本发明提供了一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统，其是按照本发明所述的制备方法制备得到的；其粒径为80-150nm，表面电位为-7—-12mv。
第三方面，本发明还提供了一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物，其是由本发明所述的E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统上负载抗肿瘤药物制备而成。
优选地，所述抗肿瘤药物包括盐霉素和/或SB-431542，其中，
所述盐霉素的负载量为3％-3.5％；
所述SB-431542的负载量为1.5％-2％。
盐霉素Salinomycin(Procoxacin)，是一种钾离子载体抗生素，选择性抑制革兰氏阳性菌的生长(gram-positive bacteria)。Salinomycin是Wnt/β-catenin信号传导的有效抑制剂，阻断Wnt诱导的LRP6磷酸化。Salinomycin(Procoxacin)选择性抑制人肿瘤干细胞，最早发现用于乳腺癌干细胞的治疗。
“SB-431542”是化学名称为4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺的化合物，是一种有效，选择性的ALK5/TGF-β type I Receptor抑制剂。
第四方面，本发明还提供了本发明中所述的靶向药物的制备方法，其包括：
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
将DSPE-PEG-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG-NTA；
其中，第一溶剂为甲醇和乙醇的体积比为2:1的混合溶剂；第二溶剂为甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01的混合溶剂；DSPE-PEG-NHS的浓度为10-30mg/mL；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL；
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体及抗肿瘤药物负载：
将摩尔比为2：1：0.1-0.4：0.01-0.1：0.4-0.6：0.5-0.7的卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NHS、DSPE-PEG、Salinomycin、SB-431542溶于有机溶剂中，然后去除所述有机溶剂，形成脂质薄膜，加入PBS溶液使其水化，冰浴条件下探头超声2min-8min，然后将反应液置于离心管中，4000rmp-6000rmp离心5min-10min，取上清，去除未载入药物；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的负载药物的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下步骤S2中得到的产物加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统；
其中，所述镍盐的用量为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1-1.2倍，E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
第五方面，本发明还提供了所述靶向药物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括原位肿瘤和/或转移肿瘤。
相比于现有技术，本发明提供的技术方案取得了包括如下的有益效果：
本发明提供的E-选择素修饰的脂质体靶向纳米给药系统利用脂质体可以包载脂溶性和水溶性药物的特性，有效包载盐霉素和TGFβ抑制剂SB-431542。该纳米给药系统可通过其表面的E-选择素与肿瘤部位或中性粒细胞高表达的SleX的特异性结合，直接或间接实现药物的肿瘤部位靶向递送和高度累积，降低药物的毒副作用，提高药物的治疗效率。
附图说明
图1为E-选择素脂质体的透射电镜观察结果。
图2为是DSPE-PEG-NTA核磁结构图。
图3为E-选择素修饰脂质体的表面电位结果图。
图4为E-选择素修饰脂质体给药系统负载抗肿瘤药后的体外抑制肿瘤细胞凋亡结果。
图5为E-选择素修饰脂质体给药系统负载抗肿瘤药后的体内抑制转移瘤情况。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
需要说明的是，在本发明中，术语“包括”、“包含”或者其他任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的方法或装置不仅包括所明确记载的要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为实施方法或装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的方法或者装置中还存在另外的相关要素。
需要说明的是，本发明所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序。应该理解“第一\第二\第三”区分的对象在适当情况下可以互换，以使这里描述的本申请能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
[术语解释]
本发明中，术语“给药系统”可以理解为一种药物载体，其能负载目标药物，并将目标药物精准输送至靶标处。
本发明中，术语“DSPE-PEG-NTA”是指二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸。
本发明中，术语“DSPE-PEG-NHS”是指活性酯聚乙二醇磷脂。
本发明中，术语“SB-431542”是化学名称为4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺的化合物，是一种有效，选择性的ALK5/TGF-β type IReceptor抑制剂。其结构式如下所示：
下面结合更为具体的实施方式对本发明提供的技术方案做进一步的解释说明。
在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统的制备方法，其包括：
S1、DSPE-PEG2000-NTA的制备：
将DSPE-PEG2000-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG2000-NTA；
S2、DSPE-PEG2000-NTA修饰脂质体：
采用薄膜分散法将对脂质体进行DSPE-PEG2000-NTA的修饰，得到DSPE-PEG2000-NTA修饰的脂质体；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG2000-NTA修饰的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下将步骤S2中得到的DSPE-PEG2000-NTA修饰的脂质体加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统。
本发明中，通过镍柱纯化蛋白的原理，DSPE-PEG2000-NTA中的3个羧基可与镍离子螯合，进一步通过镍离子与E-选择素中组蛋白标签结合的方式，将E-选择素吸附在脂质体表面。
作为可选的实施方式，在步骤S1中，所述第一溶剂为混合有机溶剂，在一些更具体的实施方式中，所述混合有机溶剂为甲醇和乙醇的混合溶剂，其中，甲醇和乙醇的体积比为2:1。
作为可选的实施方式，在步骤S1中，所述第二溶剂为混合溶剂，在一些更具体的实施方式中，所述混合溶剂为甲醇、去离子水和三乙胺的混合溶剂，所述甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01。
作为可选的实施方式，在搅拌条件下将第二溶液加入第一溶液中的操作以及加完后继续反应均在水浴条件下进行，水浴的温度可以为50-70℃，进一步优选为60℃，反应完成后进行透析，透析所用透析袋的截留分子量为3500kDa，透析的时间为过夜，一般可理解为12-16h，透析结束后，取下层乳液冻干备用。
作为可选的实施方式，步骤S1中第一溶剂为混合溶剂第一溶液中DSPE-PEG-NHS的浓度为10-30mg/mL，例如可以为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL或它们所组成的范围；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL或它们所组成的范围。
作为可选的实施方式，步骤S2中薄膜分散法的具体操作为：
将卵磷脂、胆固醇、步骤S1中制备得到的DSPE-PEG2000-NTA和DSPE-PEG2000溶于有机溶剂三氯甲烷中，然后去除所述有机溶剂形成脂质薄膜，加入PBS溶液使脂质薄膜水化，冰浴探头超声2-8min，得到DSPE-PEG2000-NTA修饰的脂质体；
其中，卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-NTA和DSPE-PEG2000的摩尔比为2：1：0.1-0.5：0-0.12。
其中，水化的目的是获得脂溶性的材料和PBS的混合溶液，通过探头超声改变脂溶性材料的组合方式，得到脂质体。
作为可选的实施方式，其中，去除所述有机溶剂的方式采用旋转蒸发的方式。
作为可选的实施方式，其中，PBS溶液加入的量为能够使形成的脂质薄膜充分分散即可，可以由本领域技术人员进行合理确定。
作为可选的实施方式，其中，有机溶剂使用量只要满足能够将卵磷脂、胆固醇、步骤S1中制备得到的DSPE-PEG2000-NTA和DSPE-PEG2000充分溶解即可，可以由本领域技术人员进行合理把握。
作为可选的实施方式，步骤S3中所述的镍盐包括六水合氯化镍、无水氯化镍、醋酸镍、硫酸镍、溴化镍中的一种或多种。
作为可选的实施方式，本发明中，对于镍离子水溶液中镍离子的浓度没有特殊要求，只要满足用量要求即可，一般来说，可以将镍离子溶液中的镍离子的浓度配制为1mg/mL-5mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL。
作为可选的实施方式，所述镍盐的用量为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1-1.2倍；
所述E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
在另一些具体的实施方式中，本发明提供了一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物，其是由本发明所述的E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统上负载抗肿瘤药物制备而成的，所述抗肿瘤药物为盐霉素和/或SB-431542，其按照以下方法制备得到：
S1、DSPE-PEG2000-NTA的制备：
将DSPE-PEG2000-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG2000-NTA；其中，透析袋所用的截留分子量为3500kDa；
其中，第一溶剂为甲醇和乙醇的体积比为2:1的混合溶剂；第二溶剂为甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01的混合溶剂；DSPE-PEG2000-NHS的浓度为10-30mg/mL；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL；
S2、DSPE-PEG2000-NTA修饰脂质体及抗肿瘤药物负载：
将摩尔比为2：1：0.1-0.4：0.01-0.1：0.4-0.6：0.5-0.7的卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-NHS、DSPE-PEG2000、Salinomycin、SB-431542溶于有机溶剂中，然后去除所述有机溶剂，形成脂质薄膜，加入PBS溶液使其水化，冰浴条件下探头超声2min-8min，然后将反应液置于离心管中，4000rmp-6000rmp离心5min-10min，取上清，去除未载入药物；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG2000-NTA修饰的负载药物的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下步骤S2中得到的产物加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统；
其中，所述镍盐的用量为DSPE-PEG2000-NTA摩尔量的1-1.2倍，镍离子溶液的浓度为1mg/mL-5mg/mL，E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
作为可选的实施方式，步骤S2中的有机溶剂为三氯甲烷，三氯甲烷的用量为能够使六种底物充分溶解即可。去除三氯甲烷的方式可以采用旋转蒸发的方式。
作为可选的实施方式，步骤S3中透析袋的截留分子量为3500Kda。
下面是具体的实施例
需要说明的是，本发明实施例中所使用的化学试剂都是可以商购方式获得的。
实施例1 E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统及其制备方法
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
通过酰胺反应制备。将DSPE-PEG(2000)-NHS 30mg溶于2mL甲醇于1mL乙醇的第一溶液中，取N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸10mg溶于1mL甲醇、0.1mL 3D H2O和0.01mL三乙胺混合第二溶液中，将第一溶液置于60℃水浴锅中搅拌时加入第二溶液，搅拌2h后置于透析袋中，透析过夜后，取下层乳液冻干备用。
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体：
称量冻干的DSPE-PEG(2000)-NTA 5mg溶于无水DMSO中，核磁氢谱验证其结构。如图2所示。
采用薄膜分散法合成脂质体纳米粒(NTA-Lipo)，具体制备流程如下：卵磷脂、胆固醇、NTA-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000(摩尔比为2：1：0.12：0.06)溶于适量三氯甲烷中，然后40℃旋转蒸发除去三氯甲烷并形成脂质薄膜，加入适量的PBS溶液将其水化，冰浴探头超声4min左右，制备得到NTA-Lipo。
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体：
Ni2-NTA-Lips的制备。取10mg六水氯化镍溶于DD H2O中，得到浓度为1mg/mL的镍离子水溶液，取7.5mg NTA-Lipo，在搅拌中加入氯化镍的水溶液，加入的镍离子的量约为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1倍，搅拌2h后，3500KDa透析4h。
E-Lips的制备。取7.1mg Ni2-NTA-Lips，加入1μg E-选择素4℃过夜孵育。
采用透射电子显微镜对E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统纳米粒进行表观形貌观察。称取一定纳米粒分散于去离子水中得到浓度为0.1mg/mL的纳米粒溶液，再将样品滴于覆盖有碳膜的铜网上，通过1％磷钨酸染色30s后，在室温下晾干后通过透射电镜(80kV)可观察到纳米粒形态呈规则圆形，且粒径大小约为100nm。如图1所示。
用微粒粒度与表面电位测定仪测定纳米给药系统的电位。经测定，Lipo的电位约为-10mv，NTA-lipo的表面电位约为-30mv，Ni2-NTA-Lipo的表面电位约为-5mv，E-Lipo表面电位约为-11.26mv。如图3所示。说明镍离子负载在脂质体上，与E-选择素结合后有降低。
实施例2一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物及其制备方法
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
通过酰胺反应制备，将DSPE-PEG(2000)-NHS 30mg溶于2mL甲醇于1mL乙醇的第一溶液中，取N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸10mg溶于1mL甲醇、0.1mL 3D H2O和0.01mL三乙胺混合第二溶液中，将第一溶液置于60℃水浴锅中搅拌时加入第二溶液，搅拌2h后置于透析袋中，透析过夜后，取下层乳液冻干备用。
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体及抗肿瘤药物负载：
称量冻干的DSPE-PEG-NTA5mg溶于无水DMSO中，核磁氢谱验证其结构(图2)。
NTA修饰的脂质体(NTA-lipo/Sal/SB)采用薄膜水化方法制备。采用薄膜分散法合成脂质体纳米粒(NTA-Lipo)，具体制备流程如下：卵磷脂、胆固醇、NTA-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、盐霉素(Salinomycin)、SB-431542(摩尔比为2：1：0.12：0.06：0.4：0.7)溶于三氯甲烷，40℃旋转蒸发除去有机溶剂三氯甲烷并形成脂质薄膜，加入1mL的PBS溶液将其水化，冰浴探头超声4min，制备得到NTA-Lipo/Sal/SB。将NTA-Lipo/Sal/SB置于离心管中，4000rmp/5min取上清，去除未载入药物。
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的负载药物的脂质体：
Ni2-NTA-Lipo/Sal/SB的制备。取10mg六水氯化镍溶于DD H2O中，得到浓度为1mg/mL的镍离子水溶液，取一份(7.5mg)NTA-Lipo，在搅拌中加入氯化镍的水溶液，加入的镍离子的量约为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1倍，搅拌2h后，3500KDa透析4h得到Ni2-NTA-Lipo/Sal/SB。
E-Lips的制备。取一份(7.1mg)Ni2-NTA-Lipo/Sal/SB，加入1μg E-选择素4℃过夜孵育。
采用高效液相色谱法测定Salinomycin和SB-431542的含量。经测定，E-选择素修饰的脂质体中Salinomycin、SB-431542含量分别为3.18％、1.90％。
实施例3 E-选择素修饰的脂质体给药系统在抗肿瘤及其转移灶的应用。
1、E-选择素修饰脂质体给药系统的体外抑制肿瘤细胞凋亡的应用
按照实施例2的制备方法制备了靶向药物，采用流式细胞仪考察不同组别纳米脂质体体外对肿瘤细胞的抑制作用。以每孔2×105个肿瘤的密度接种6孔培养板，待细胞贴壁后，先分别与不同组别脂质体制剂孵育24h后(对照组使用的是PBS溶液，实验组每组用的药物含量相同为IC50，下同)，收集各孔的培养液置于离心管中，板内的细胞用磷酸盐缓冲液洗三次，加入胰酶消化1min，用收集的培养液终止消化，收集细胞后1000rpm离心5min，弃去上清，磷酸盐缓冲液再洗三次，弃去上清，取0.5mL结合缓冲液加入EP管中，重悬细胞，依次加入Annexin V-FITC(5μL)及PI(10μL)，混匀，避光，于室温下染色20min，用流式细胞仪检测。
经测定E-选择素修饰的载药脂质体对细胞凋亡作用如图4所示，对照组的细胞几乎无凋亡，但是E-Lipo/Sal/SB组别的细胞凋亡从3.79％增加到59.1％；相较于Free AB组，E-Lipo/Sal/SB组别的细胞凋亡率提升了10％，相较于AB-lips组而言，E-Lipo/Sal/SB组别的细胞凋亡率提升了35％。可以看出本发明通过将抗肿瘤药物负载于本发明提供的脂质体靶向给药系统上，能够提高抗肿瘤药物对于肿瘤细胞的杀伤效果，提高肿瘤细胞的凋亡率。
2、E-选择素修饰脂质体给药系统体内抑制肿瘤转移的应用
以小鼠肝癌细胞H22为模型细胞，通过在尾静脉注射肿瘤细胞制备动物转移瘤模型:收集对数期生长的细胞并离心，用生理盐水洗两遍后，将洗涤后的细胞团重新分散于不含血清的DMEM培养液，计数并稀释至所需细胞浓度(5×105/mL)，将0.2mL细胞悬浮液注尾静脉，构建动物肺转移模型备用。
将动物肺转移模型构建成功的小鼠注射每隔两天注射0.2mL E-选择素修饰脂质体溶液，连续注射3次。继续养殖30天后，处死小鼠，取出肺组织，观察转移数目。
经测定E-选择素修饰的载药脂质体对抗体内肿瘤转移病灶效果如图5所示发现对照组双肺布满转移病灶(18-22个)，而注射E-Lipo/Sal/SB组别的老鼠肺组织转移病灶明显减少(3-6个)。FreeAB组肺转移灶有17-21个。说明本发明提供的给药系统能够显著提升抗肿瘤药物的靶向性，从而增强其对于肿瘤转移病灶和/或原位肿瘤的治疗效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统的制备方法，其包括：
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
将DSPE-PEG-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG-NTA；
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体：
采用薄膜分散法将对脂质体进行DSPE-PEG-NTA的修饰，得到DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下将步骤S2中得到的DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S1中所述的第一溶剂为混合有机溶剂；优选为甲醇和乙醇的混合溶剂；进一步优选为甲醇和乙醇的体积比为2:1；
所述第二溶剂为混合溶剂，优选为甲醇、去离子水和三乙胺的混合溶剂；进一步优选为甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S1中第一溶液中DSPE-PEG-NHS的浓度为10-30mg/mL；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S2中薄膜分散法的具体操作为：
将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NTA和DSPE-PEG溶于有机溶剂中，然后去除所述有机溶剂形成脂质薄膜，加入PBS溶液使脂质薄膜水化，冰浴探头超声2-8min，得到DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体；
其中，卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NTA和DSPE-PEG的摩尔比为2：1：0.1-0.5：0-0.12。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S3中所述的镍盐包括六水合氯化镍、无水氯化镍、醋酸镍、硫酸镍、溴化镍中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，所述镍盐的用量为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1-1.2倍；
所述E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
7.一种E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统，其是按照权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的；其粒径为80-150nm，表面电位为-7—-11.26mv。
8.一种用于治疗原位肿瘤和/或转移瘤的靶向药物，其是由权利要求8或9中所述的E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统上负载抗肿瘤药物制备而成。
9.根据权利要求8所述的靶向药物，其中，所述抗肿瘤药物包括盐霉素和/或SB-431542，其中，
所述盐霉素的负载量为3％-3.5％；
所述SB-431542的负载量为1.5％-2％。
10.权利要求9中所述的靶向药物的制备方法，其包括：
S1、DSPE-PEG-NTA的制备：
将DSPE-PEG-NHS溶于第一溶剂中，得到第一溶液；将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸溶于第二溶剂中，得到第二溶液；在搅拌条件下将第二溶液加入到第一溶液中，加完继续反应2-4h，反应完成后将反应液置于透析袋中进行透析，得到DSPE-PEG-NTA；
其中，第一溶剂为甲醇和乙醇的体积比为2:1的混合溶剂；第二溶剂为甲醇、去离子水和三乙胺的体积比为1:0.1:0.01的混合溶剂；DSPE-PEG-NHS的浓度为10-30mg/mL；第二溶液中N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸的浓度为5-10mg/mL；
S2、DSPE-PEG-NTA修饰脂质体及抗肿瘤药物负载：
将摩尔比为2：1：0.1-0.4：0.01-0.1：0.4-0.6：0.5-0.7的卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-NHS、DSPE-PEG、Salinomycin、SB-431542溶于有机溶剂中，然后去除所述有机溶剂，形成脂质薄膜，加入PBS溶液使其水化，冰浴条件下探头超声2min-8min，然后将反应液置于离心管中，4000rmp-6000rmp离心5min-10min，取上清，去除未载入药物；
S3、E-选择素修饰DSPE-PEG-NTA修饰的负载药物的脂质体：
将镍盐溶解于去离子水中，得到镍离子溶液；在搅拌条件下步骤S2中得到的产物加入镍离子溶液中，加完继续搅拌2-4h，然后用透析袋透析4-6h，后加入E-选择素，在0-8℃条件下孵育12-18h，得到E-选择素修饰的脂质体靶向给药系统；
其中，所述镍盐的用量为DSPE-PEG-NTA摩尔量的1-1.2倍，E-选择素的用量为以DSPE-PEG-NTA修饰的脂质体计，7mg修饰后的脂质体中添加0.5-1.5μg E-选择素。
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2021
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