CN114317614B - 一种利用木质素前体制备类腐殖酸的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于应用真菌学、有机合成化学、环境修复学和植物生理学等交叉互融领域，涉及一种利用木质素前体制备类腐殖酸的方法与应用。具体而言，是以云芝漆酶作为绿色催化剂，以木质素前体(邻苯二酚、香草酸、没食子酸和阿魏酸)和双酚A作为共存底物，通过云芝漆酶启动木质素前体和双酚A的共价结合作用，实现水体中酚类污染物的简单、高效转化，同时生成分子量大、结构复杂、功能稳定的类腐殖酸产品。所产生的类腐殖酸产品完全消除了木质素前体和双酚A的生态毒性，甚至可用于刺激樱桃萝卜的生长发育。本发明符合绿色、低碳、节能、环保的设计理念，在处理水体酚类污染、制备类腐殖酸产品和提高农作物产量等方面的应用前景广阔。

Description

一种利用木质素前体制备类腐殖酸的方法与应用

技术领域

本发明属于应用真菌学、有机合成化学、环境修复学和植物生理学等交叉互融领域，涉及一种利用木质素前体制备类腐殖酸的方法与应用。

背景技术

双酚A(BPA)作为一种代表性的酚类污染物，对生物体具有内分泌干扰效应，已在全球范围内引发重要的环境和健康问题。例如，研究者在野生动物和人体血液中均检测到高浓度BPA。已证实，高剂量BPA可引发生物体生殖障碍，甚至死亡；低剂量BPA能长期干扰生物体的性别分化、生长发育、免疫系统和生理行为。人体摄入高剂量BPA诱发的健康风险包括内分泌失调、新陈代谢紊乱、性早熟、心血管疾病和癌症等。虽然，吸附、膜分离、化学氧化和微生物代谢等技术可用于去除水体中BPA；但是，这些方法存在转化效率低、降解不彻底、代谢周期长、操作工艺复杂等缺点。水体中残存的BPA可被生物吸收、积累并在食物链内传递，严重威胁野生物种和人群健康。因此，开发新型、高效的BPA处理工艺，有利于维护生态系统稳定和人群健康。

需强调，水生态系统中还存在大量高附加值的邻苯二酚(CT)、香草酸(VA)、没食子酸(GG)和阿魏酸(FA)等酚类单体，它们主要由木质素氧化腐解产生。这些小分子木质素前体和BPA等酚类化合物在长期、复杂的生物地球化学循环过程中，会被部分的氧化聚合成天然的超分子腐殖酸。天然腐殖化过程不仅消除了BPA等酚类单体对生态系统的负面影响，也有利于生成腐殖酸、促进自然界中有机碳循环和稳定。基于此，科学家试图模拟天然腐殖化过程和机理，通过类芬顿反应、水热法等途径加速酚类污染物和木质素单体的氧化聚合作用，不仅实现酚类污染物的去除和解毒，同时达到快速制备类腐殖酸产品的目的。尽管如此，这些腐殖化聚合技术尚存在诸多缺陷，如需要额外添加过氧化氢、反应条件复杂、合成产率低、能量损耗高等。如何构建一种全新的类腐殖酸生产工艺和技术，最大限度地提高酚类污染物去除和产品转化率至关重要。白腐真菌分泌的胞外漆酶(EC 1.10.3.2；一类含铜多酚氧化还原酶)普遍存在于自然界中，该类酶介导的腐殖化反应可有效地调控水体中酚类底物的单电子氧化和聚合，促进酚类污染物的解毒和类腐殖酸产品的形成，且具有操作流程简单、催化效率高、能量损耗低、绿色无污染等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种利用木质素前体制备类腐殖酸产品的方法；如何通过木质素前体引发的酚自由基共价结合，高效转化水体中双酚A；如何采用木质素前体和双酚A共聚合产生的类腐殖酸产品，刺激樱桃萝卜生长发育。

本发明的技术方案为：一种利用木质素前体制备类腐殖酸产品的方法，该方法以云芝漆酶作为催化剂，以木质素前体和双酚A(BPA)作为共存底物，通过酶启动酚自由基共价结合途径，生成结构复杂、性能稳定的大分子类腐殖酸产品；所述木质素前体为邻苯二酚(CT)与香草酸(VA)、没食子酸(GG)或阿魏酸(FA)的任意混合。

一类类腐殖酸产品，由云芝漆酶催化木质素前体和双酚A(BPA)的C-C和/或C-O共价键合而生成，所述木质素前体为邻苯二酚(CT)与香草酸(VA)、没食子酸(GG)或阿魏酸(FA)的任意混合。合成的类腐殖酸产品为CT-VA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-1)、CT-GG-BPA共聚合颗粒物(H-LP-2)、CT-FA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-3)和CT-VA-GG-FA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-4)。

上述所述的酚自由基共价结合途径在维持云芝漆酶催化活性和稳定性、实现BPA高效转化和去除中的应用。

一种去除水体中双酚A的方法，该方法以云芝漆酶作为催化剂，以木质素前体和双酚A(BPA)作为共存底物，通过酶启动酚自由基共价结合途径，生成结构复杂、性能稳定的大分子类腐殖酸产品；所述木质素前体为邻苯二酚(CT)或邻苯二酚(CT)与香草酸(VA)、没食子酸(GG)或阿魏酸(FA)的任意混合。

上述所述的类腐殖酸产品在促进樱桃萝卜生长发育上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用云芝漆酶催化木质素前体和BPA的交叉聚合作用，在生成类腐殖酸产品的同时，还可维持漆酶催化活性和稳定性，实现BPA快速转化和消除。所形成的类腐殖酸产品分子量大、结构复杂、性能稳定、无毒无害，且具有芳香基、酚羟基、羧基、醌基等活性官能团，可用于模拟天然腐殖酸的植物学效益，刺激樱桃萝卜生长发育。

本发明提供的一种利用木质素前体制备类腐殖酸的方法，符合绿色、低碳、节能、环保的设计理念，同时兼有制备流程简洁、生产成本低、转化速率快、部分产品产率高等优点。云芝漆酶启动酚自由基共价结合途径在高效处理酚类污染物、实现人工合成类腐殖酸产品、增加农作物产量等方面具有极大的应用价值和商业前景。

附图说明

图1木质素前体对BPA转化的影响；

图2类腐殖酸产品的形态学特征；

图3类腐殖酸产品的结构稳定性；

图4类腐殖酸产品对ABTS自由基的清除能力；

图5类腐殖酸产品对DPPH自由基的清除能力；

图6类腐殖酸产品对植物根伸长的影响；

图7类腐殖酸产品对植株鲜重的影响。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1木质素前体和双酚A的共聚合反应

选择邻苯二酚(CT)、香草酸(VA)、没食子酸(GG)和阿魏酸(FA)等木质素前体作为类腐殖酸合成原料，研究云芝漆酶合成类腐殖酸对双酚A(BPA)转化的影响。详细操作步骤如下：(1)将500mL pH 5.0的10mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入到1L棕色的三角形酶促玻璃器内，加入表1所示的底物；(2)将上述酶促玻璃器置于磁力搅拌器上，添加1.0U·mL^-1云芝漆酶启动反应，25℃、150r·min^-1磁力搅拌72h；(3)定时吸取0.5mL酶促反应液，立刻混入0.5mL色谱纯甲醇，淬灭生成的活性酚自由基中间体；(4)将淬灭的混合液过0.22μm微孔滤膜，在12h内定量分析混合液中BPA的残留浓度，并计算BPA的转化速率常数(k)和半衰期(t_1/2)。高效液相色谱(HPLC,Milford,MA,USA)检测条件：20μL进样体积、1.0mL·min^-1流速、278nm吸收波长、40℃柱温、7:3色谱纯乙腈和水流动相(v/v)。通过比色皿显色法，测定酶促反应液中云芝漆酶的吸光度变化率，并计算酶活性(U·mL^-1)。

表1云芝漆酶合成类腐殖酸的底物组成

云芝漆酶能催化木质素前体和BPA的单电子氧化和聚合，生成紧密结合的大分子共聚合颗粒物。如图1所示，在酶促反应12h内，只添加BPA的转化率仅为40.0％；之后，随着聚合时间的延长，BPA的转化率趋于平缓，其k和t_1/2分别为0.008h^-1和90.0h(R²＝0.6927)。这是由于反应过程中生成的长链BPA自聚物会将云芝漆酶捆绑在分子内，因而阻断了漆酶活性位点与底物分子的进一步接触。添加木质素单体混合物，如CT-VA、CT-GG、CT-FA和CT-VA-GG-FA，明显地加速了云芝漆酶诱导的BPA转化(反应72h内，BPA的转化率分别高达99.2％、98.4％、99.1％和99.4％)，其t_1/2分别仅为10.7、11.9、9.8和9.0h(R²＝0.9253-0.9672)。该过程促进了木质素前体和BPA活性酚中间体的自由组合，形成复杂多样的木质素前体-BPA共聚物。所产生的木质素前体-BPA共聚物有效地减低了长链BPA自聚物的产量，并保持了云芝漆酶催化位点的活性和稳定性，从而实现木质素前体和BPA的持续氧化和聚合。可见，云芝漆酶启动木质素前体和BPA的共聚合作用，有利于维持酶促反应的稳定性和持久性，达到酚类污染物的高效转化和去除。

实施例2类腐殖酸产品的提取和功能验证

云芝漆酶启动木质素前体和BPA活性中间体自由组合72h后，用高浓度盐酸将上述酶促反应液酸化至pH 1.0，于避光处静置24h，让CT-VA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-1)、CT-GG-BPA共聚合颗粒物(H-LP-2)、CT-FA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-3)和CT-VA-GG-FA-BPA共聚合颗粒物(H-LP-4)等四种类腐殖酸产品充分析出并沉淀。将获得的四种类腐殖酸产品用去离子水反复清洗数次，去除残存的缓冲液和物理吸附的酚类单体。之后，将它们冷冻干燥、研磨、过筛，分析四种类腐殖酸产品的表面形态、官能团、化学结构、稳定性和抗氧化能力。使用扫描电子显微镜(SEM,HITACHI S-4800,Japan)成像技术，观察类腐殖酸产品的微观形貌；通过傅立叶红外光谱(FTIR,NEXUS870,NICOLET,USA)分析手段，测定类腐殖酸产品的主要官能团；采用¹H-核磁共振(¹H-NMR,Agilent Technologies,USA)技术，解析类腐殖酸产品的共价结合特征。运用长期培养试验，量化类腐殖酸产品中BPA单体的释放量。方法简述如下：向4.5mL 10mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中加入0.5mL 1000mg·L^-1类腐殖酸产品母液，混合均匀，获得100mg·L^-1类腐殖酸产品溶液，于25℃静置培养30d，定时取样(5、10、15、20、25和30d)，测定样品中BPA单体的释放量。

此外，利用2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除法，评估四种类腐殖酸产品的抗氧化能力。ABTS自由基清除试验步骤如下：将50mL 7mM ABTS溶液和50mL 2.45mM过硫酸钾溶液等体积混合，25℃避光静置12h后，用无水乙醇稀释至吸光度为0.7(734nm)，获得ABTS工作液。在工作液中添加不同浓度梯度的类腐殖酸产品(H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4的浓度分别为0.1-8、0.01-1、0.1-12和0.1-12mg·L^-1)，于25℃避光反应30min，测定溶液在734nm处吸光度值。DPPH自由基清除试验的测定方法如下：采用无水乙醇制备100mL 0.1mM DPPH工作液，添加不同浓度梯度的类腐殖酸产品(H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4的浓度分别为0.1-16、0.1-4、0.1-16和0.5-16mg·L^-1)，于25℃避光反应30min，测定溶液在517nm处吸光度值。通过标准曲线，分别计算四种类腐殖酸产品对ABTS和DPPH自由基的半抑制浓度(IC₅₀)。

云芝漆酶诱导木质素前体和BPA共聚合形成H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4等四种类腐殖酸产品，它们的产率分别为54.7％、8.9％、87.3％和59.3％。由图2可知，四种类腐殖酸产品分别呈深灰色、熟褐色、深卡其色和深黑色，它们的表面形态差异显著，呈不规则状。FTIR和¹H-NMR结果显示，四种高度紧密结合的类腐殖酸产品是由云芝漆酶启动的酚自由基通过脱氢反应，生成C-O共价聚合产物；同时，这些酚自由基也可跃迁到邻位的酚碳上，形成C-C共价聚合产物。与传统的类腐殖酸制备技术相比，云芝漆酶诱导木质素前体和BPA的共聚合作用，符合绿色、低碳、节能、环保的设计理念。所形成的四种类腐殖酸产品具有分子量大、结构复杂、性能稳定等特点，并包含与天然腐殖酸类似的功能基团，如芳香基、酚羟基、羧基、醌基和醚键等。这些产品结构复杂、性能稳定，可在环境中长期存在。例如，将H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4等四种类腐殖酸产品置于水体中30d，它们分别仅释放出0.51％-0.66％、0.10％-0.20％、0.88％-0.90％和0.22％-0.26％松散结合的BPA单体，且随着存放时间的增加，BPA单体的释放量无显著性变，证实由C-C和/或C-O共价键合而生成的类腐殖酸产品的化学结构较稳定(图3)。

本发明的类腐殖酸产品具有较强的抗氧化能力，可通过清除生物体释放的活性自由基，避免植物产生氧化损伤。图4和图5分别展示了四种类腐殖酸产品对ABTS和DPPH自由基的清除能力。ABTS阳离子自由基氧化后，会形成稳定的蓝绿色水溶性自由基。由图4可知，H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4等四种类腐殖酸产品均能作为抗氧化剂，清除ABTS自由基，实现水溶液的褪色。当四种类腐殖酸产品的添加量均为0.5mg·L^-1时，它们对ABTS自由基的清除能力分别为19.17％、64.32％、13.67％和13.98％，其IC₅₀分别为3.09、0.44、5.97和4.91mg·L^-1。DPPH自由基接收电子时会在517nm处失去吸收光谱带。类腐殖酸产品可提供电子，将稳定的紫色DPPH自由基淬灭为淡黄色甚至无色。如图5所示，四种类腐殖酸产品(4.0mg·L^-1)对DPPH自由基的清除能力分别为24.20％、93.26％、20.85％和31.78％，其IC₅₀分别为8.36、1.78、13.82和9.80mg·L^-1。这些结果证实，四种类腐殖酸产品均可有效地清除ABTS和DPPH自由基，其中H-LP-2表现出最强的抗氧化能力。

实施例3类腐殖酸产品对植物生长发育的影响

樱桃萝卜属于小型萝卜类，其生长迅速、环境适应性强，常作为模式植株，用于植物促生长试验。采用温室平皿促生方法，研究H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4等四种类腐殖酸产品对樱桃萝卜根伸长和植株鲜重的影响。操作步骤简述如下：(1)将樱桃萝卜种子表面杀菌消毒(75％乙醇)2-3min后，用灭菌的去离子水冲洗数次，并置于30℃恒温水浴催芽2h；(2)选取粒度饱和、大小一致的催芽种子，均匀种植在分别含有50、100和200mg·L^-1的H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4固体MS介质(添加维生素和0.3％琼脂)中育苗3d，测定樱桃萝卜的根长和植株鲜重；(3)每组培养皿中添加30mL固体MS介质，并均匀种植15颗樱桃萝卜种子，人工气候箱(型号：HBRG-500LED)的湿度设置为65％，昼夜培育时间和温度分别设置为14/10h和25/20℃；(4)设置空白对照(仅含有固体MS介质)，以及分别添加50、100和200mg·L^-1的CT-VA-BPA(或CT-GG-BPA、CT-FA-BPA、CT-VA-GG-FA-BPA)作为试验对照；CT-VA-BPA指CT、VA和BPA的单体混合物，CT-GG-BPA、CT-FA-BPA、CT-VA-GG-FA-BPA同理，其中CT(或VA、GG、FA)和BPA的摩尔质量配比均为10:1。

类腐殖酸产品可模拟天然腐殖酸的植物学效益，促进樱桃萝卜根伸长，并提高植株鲜重。如图6所示，与添加类腐殖酸产品的处理组相比，CT-VA-BPA、CT-GG-BPA、CT-FA-BPA和CT-VA-GG-FA-BPA单体混合物均能显著地抑制樱桃萝卜根伸长。例如，当分别添加100mg·L^-1的四类单体混合物时，樱桃萝卜的根长分别为1.05、1.51、1.57和1.37cm；当分别添加等量的H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4时，樱桃萝卜的根长分别为3.54、3.90、4.40和4.00cm。可见，木质素前体和BPA对樱桃萝卜的生长有明显地毒害作用。此外，添加四种类腐殖酸产品处理的樱桃萝卜根长均高于空白对照组，说明所制备的类腐殖酸产品可用于促进植物根伸长。图7展示了H-LP-1、H-LP-2、H-LP-3和H-LP-4等四种类腐殖酸产品对樱桃萝卜根和茎叶鲜重的影响。与四类单体混合物处理组相比，添加类腐殖酸产品均显著地提高了植株根和茎叶鲜重；与空白对照组相比，总体来说，添加类腐殖酸产品的樱桃萝卜鲜重有一定的增加。这些结果进一步证实，云芝漆酶引发的木质素前体和BPA共聚合，不仅能简单、高效转化水体中酚类化合物，也可用于制备与天然腐殖酸具有类似植物促生长效益的类腐殖酸产品。可见，通过合理调控酶促反应的工艺流程、条件和路径，对实现水体中酚类污染物的高效转化和去除、人工制备类腐殖酸产品十分有效。

Claims (4)

1.一种利用木质素前体制备类腐殖酸产品的方法，其特征在于，该方法以云芝漆酶作为催化剂，以木质素前体和双酚A作为共存底物，催化生成类腐殖酸产品；所述木质素前体为邻苯二酚与香草酸、没食子酸或阿魏酸的任意混合。

2.一种无害化处理水体中双酚A的方法，其特征在于，该方法以云芝漆酶作为催化剂，以木质素前体和双酚A作为共存底物，催化生产类腐殖酸产品；所述木质素前体为邻苯二酚与香草酸、没食子酸或阿魏酸的任意混合。

3.一类类腐殖酸产品，其特征在于，由云芝漆酶催化木质素前体和双酚A的C−C和/或C−O共价键合而生成的邻苯二酚-香草酸-双酚A共聚合颗粒物、邻苯二酚-没食子酸-双酚A共聚合颗粒物、邻苯二酚-阿魏酸-双酚A共聚合颗粒物或邻苯二酚-香草酸-阿魏酸-双酚A共聚合颗粒物。

4.权利要求3所述的类腐殖酸产品在促进樱桃萝卜生长发育上的应用。