CN114317315B - 中间气单胞菌(Aeromonas media)及其应用 - Google Patents
中间气单胞菌(Aeromonas media)及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种中间气单胞菌(Aeromonas media)及其应用,具体地,本发明提供了一种中间气单胞菌,所述中间气单胞菌为中间气单胞菌(Aeromonas media),并且所述中间气单胞菌选自下组:Aeromonas media H1,保藏号为CGMCC No.20533;Aeromonas media 4S,保藏号为CGMCC No.20957;Aeromonas media 5R,保藏号为CGMCC No.20958;或其组合。本发明首次发现,中间气单胞菌(Aeromonas media)具有(i)增强植物抗逆性;和/或(ii)促进植物的生长的作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体地,涉及中间气单胞菌(Aeromonas media)及其应用。
背景技术
在农业上,为了促进植物生长或提高植物抗逆性能,往往使用农用化合物。然而,这些农用化合物往往会造成一定程度的环境污染。
以抗旱性为例,农业干旱胁迫问题极大地影响到农业生产。已发现,使用某些根际促生菌(PGPRs)是可能是解决生物和非生物胁迫下植物生长效率的有效方法之一。
然而,目前其他许多根际促生菌的特性、以及其在植物中应对压力的机制还未知,或者对抗逆性能的改善程度有限。
因此,本领域迫切需要开发能够显著增强植物抗干旱胁迫能力,抗盐胁迫能力和/或显著提高植物生长性能的菌株或农用制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供能够显著增强植物抗干旱胁迫能力,抗盐胁迫能力和/或显著提高植物生长性能的菌株或农用制剂。
本发明第一方面提供了一种中间气单胞菌,所述中间气单胞菌为中间气单胞菌(Aeromonas media),并且所述中间气单胞菌选自下组:Aeromonas media H1,保藏号为CGMCC No.20533;Aeromonas media 4S,保藏号为CGMCC No.20957;和Aeromonas media5R,保藏号为CGMCC No.20958;或其组合。
在另一优选例中,所述的中间气单胞菌Aeromonas media H1的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中,所述的中间气单胞菌Aeromonas media 4S的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中,所述的中间气单胞菌Aeromonas media 5R的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述中间气单胞菌一种根际促生菌。
在另一优选例中,所述中间气单胞菌来自植物的根际、发酵池、和/或生物组织。
本发明第二方面提供了一种农用制剂,所述农用制剂包括:(a)安全有效量的中间气单胞菌(Aeromonas media)和/或其代谢产物;以及(b)农业上可接受的载体。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)包括Aeromonas mediaH1。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)选自下组:Aeromonasmedia H1、Aeromonas media 4S、Aeromonas media 5R、或其组合。
在另一优选例中,组分(a)在农用制剂中的含量为1×10-1×1015cfu/mL或cfu/g中间气单孢菌(Aeromonas media),较佳地1×104-1×1010cfu/mL或cfu/g中间气单孢菌(Aeromonas media),按所述农用制剂的总体积或总重量计。
在另一优选例中,所述农用制剂中,含有0.0001-99wt%,较佳地0.1-90wt%的组分(a),以农用制剂的总重量计。
在另一优选例中,所述农用制剂还包括额外的抗旱剂(如抗旱种衣剂、抗旱保水剂、或抗旱喷洒剂)或其他农用活性成分。
在另一优选例中,所述的农用活性成分选自下组:杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、杀螨剂。
在另一优选例中,所述农用制剂还包括额外的抗盐剂。
在另一优选例中,所述抗盐剂选自下组:抗盐喷雾剂、铁肥、壳聚糖及其衍生物、或其组合。
在另一优选例中,所述农用制剂还包括其他促进植物的生长的物质。
在另一优选例中,所述其他促进植物生长的物质选自下组:化肥、有机农肥、根际促生菌的肥料制剂、或其组合。
在另一优选例中,所述农用制剂还包括表面活性剂(如阳离子型、阴离子型、两性、或非离子型表面活性剂)。
在另一优选例中,所述农用制剂还包括有助于保持中间气单胞菌活力的物质(如保护剂)。
在另一优选例中,所述有助于保持中间气单胞菌活力的物质(如保护剂)选自下组:半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。
在另一优选例中,所述农用制剂的剂型选自下组:溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
本发明第三方面提供了一种中间气单胞菌(Aeromonas media)、或本发明第二方面所述的农用制剂的用途,用于制备组合物或制剂,所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途:(i)增强植物抗逆性;(ii)促进植物的生长。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)包括Aeromonas mediaH1。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)选自下组:Aeromonasmedia H1、Aeromonas media 4S、Aeromonas media 5R、或其组合。
在另一优选例中,所述抗逆性选自下组:抗旱性、耐盐性、耐冷性、耐渗透压、耐热性、抗病性、或其组合。
在另一优选例中,所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途:
(a)减弱叶片的蒸腾作用;
(b)降低叶片的离子渗透率;
(c)提高植株干重;
(d)提高细菌定植量;
(e)增加光合作用效率;
(f)增加保卫细胞的活性氧;
(g)促进植物的营养生长;
(h)增强植物的抗旱性。
在另一优选例中,所述植物包括苔藓、蕨类、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中,所述的植物包括农业植物、园艺植物、林业植物。
在另一优选例中,所述的植物包括木本植物、草本植物。
在另一优选例中,所述的植物包括完整的植株、器官(如根、茎、叶、枝、花、果实、种子)、组织(如愈伤组织)、或细胞。
在另一优选例中,所述的植物选自下组:禾本科、藜科、苋科、菊科、百合科、十字花科、蔷薇科、豆科、茶科、梧桐科、松科、胡桃科、胡椒科、木兰科、杜鹃花科、猕猴桃科、葡萄科、秋海棠科、凤梨科、银杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、夹竹桃科、小檗科、芸香科、茄科、柏科、冬青科、或其组合。
在另一优选例中,所述植物选自下组:藜麦、籽粒苋、烟草、棉花、生菜、水稻、小麦、玉米、花生、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、大豆、马铃薯、荞麦、胡椒、葡萄、梨、苹果、香蕉、人参、番茄、辣椒、茄子、花椰菜、大白菜、油菜、黄瓜、西瓜、洋葱、向日葵、百合、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、樟树、梧桐、或其组合。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述农用制剂的制法,包括步骤:
将中间气单胞菌(Aeromonas media)和/或其代谢产物与植物培养中可接受的载体基质混合,从而形成本发明第二方面所述的农用制剂。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)包括Aeromonas mediaH1。
在另一优选例中,所述中间气单孢菌(Aeromonas media)选自下组:Aeromonasmedia H1、Aeromonas media 4S、Aeromonas media 5R、或其组合。
在另一优选例中,所述制法还包括与有助于保持中间气单胞菌活力的物质(如保护剂)混合的步骤。
在另一优选例中,所述有助于保持中间气单胞菌活力的物质(如保护剂)选自下组:半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。
本发明第五方面提供了一种生产本发明第二方面所述的农用制剂的方法,包括步骤:
(i)将中间气单胞菌(Aeromonas media)与农业上可接受的载体进行混合,从而制得本发明第二方面所述的农用制剂。
在另一优选例中,在步骤(i)之前,将所述中间气单胞菌进行扩增培养,并将其和/或其代谢产物从培养物中分离。
在另一优选例中,在步骤(i)之前,还包括将上一步骤获得的所述培养产物或所述中间气单胞菌菌体和/或其代谢产物与有助于保持巨大芽孢杆菌活力的物质(如保护剂)混合的步骤。
本发明第六方面提供了一种(i)增强植物抗逆性;和/或(ii)促进植物的生长的方法,给植物施用中间气单胞菌(Aeromonas media)或本发明第二方面所述的农用制剂。
在另一优选例中,所述的施用选自下组:喷洒、浇灌、滴灌、喷雾、包被、注射或本领域的普通技术人员已知的其他方法。
在另一优选例中,所述的施用可一次性施用、重复施用或连续施用。
在另一优选例中,所述的施用剂量为1×10-1×1015cfu/mL或cfu/g中间气单胞菌(Aeromonas media),较佳地1×104-1×1010cfu/mL或cfu/g中间气单胞菌(Aeromonasmedia),按所述农用制剂的总体积或总重量计。
在另一优选例中,所述的施用时间可以在植物的生命周期的早期或者中期以及中后期施用,包括种子萌发之前或萌发之后。
在另一优选例中,所述的施用方法为施用于植物、植物种子、或围绕植物或种子的土壤中。
在另一优选例中,所述植物包括苔藓、蕨类、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中,所述的植物包括农业植物、园艺植物、林业植物。
在另一优选例中,所述的植物包括木本植物、草本植物。
在另一优选例中,所述的植物包括完整的植株、器官(如根、茎、叶、枝、花、果实、种子)、组织(如愈伤组织)、或细胞。
在另一优选例中,所述的植物选自下组:禾本科、藜科、苋科、菊科、百合科、十字花科、蔷薇科、豆科、茶科、梧桐科、松科、胡桃科、胡椒科、木兰科、杜鹃花科、猕猴桃科、葡萄科、秋海棠科、凤梨科、银杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、夹竹桃科、小檗科、芸香科、茄科、柏科、冬青科、或其组合。
在另一优选例中,所述植物选自下组:藜麦、籽粒苋、烟草、棉花、生菜、水稻、小麦、玉米、花生、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、大豆、马铃薯、荞麦、胡椒、葡萄、梨、苹果、香蕉、人参、番茄、辣椒、茄子、花椰菜、大白菜、油菜、黄瓜、西瓜、洋葱、向日葵、百合、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、樟树、梧桐、或其组合。
本发明第七方面提供了一种植物种子包衣剂,所述包衣剂包括中间气单胞菌(Aeromonas media)。
本发明第八方面提供了一种对植物种子进行包衣的方法,所述方法包括向所述植物种子施用本发明第七方面所述的包衣剂。
本发明第九方面提供了一种微生物复合肥,包括中间气单胞菌(Aeromonasmedia)。
本发明第十方面提供了一种本发明第七方面所述的包衣剂、或本发明第九方面所述的微生物复合肥的用途,用于制备农用制剂或生物肥料,所述农用制剂或生物肥料用于选自下组的一种或多种用途:(i)增强植物抗逆性;(ii)促进植物的生长。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1[A]显示了用H1菌株处理过的植物,干旱复水后和未处理H1菌株的比较。[B]显示了光合作用效率,H1菌株处理过的植物与未处理H1菌株的比较。
图2[A]显示了干旱处理后,H1菌株处理后的苗子与为经H1处理后的苗子叶表面因蒸腾效率不同造成的温度差异。[B]显示了叶表面蒸腾效率比较,H1菌株处理后的苗子叶表面温度显著高于未处理的苗子,表示H1菌株处理的植物有更低的蒸腾效率。[C]显示了H1菌株处理后的植物,气孔活性氧聚集更多,帮助气孔关闭。[D]显示了H1处理后的植物,抗旱相关基因被显著上调。
图3[A]显示了用H1处理过的植物与未经处理过的植物比较,表现出更好的抗盐胁迫能力。[B]显示了H1处理过的植物与未经处理过的植物比较,表现出更低的叶片离子渗透效率。[C]显示了H1处理过的植物与未经处理过的植物比较,表现出更少的受盐害比率。
图4显示了用H1菌株处理过的藜麦,表现出明显的促生长表型。
图5显示了用H1菌株处理过的藜麦,各个定量促生长指标显著呈现H1菌株处理过的藜麦提高藜麦营养生长。其中,[A]H1菌株处理后的藜麦干重显著高于已知的促生长菌P.putida KT2440,[B]H1菌株处理后的藜麦根干重显著高于已知的促生长菌P.putidaKT2440,[C]H1菌株处理后的藜麦菌根定植量显著高于已知的促生长菌P.putida KT2440,[D]H1菌株处理后的藜麦光合作用效率显著高于已知的促生长菌P.putida KT2440。
图6显示了4S和5R促进植物营养生长,帮助植物抵御盐害和干旱胁迫。其中,[A]正常条件下,4S和5R明显促进植物的生长,处理了菌的植物与未处理菌的植物比起来表现出更大的植物叶片面积;[B]干旱条件下,4S和5R处理的植物表现出相较与对照组植物更健康的叶片态势,这表明4S和5R可以帮助植物更好的抵御干旱胁迫;[C]盐害处里条件下,4S和5R处理的植物表现出相较与对照组植物更健康的叶片态势,表明4S和5R可以帮助植物更好的抵御盐害胁迫;[D]植物叶片的定量结果显示,在正常条件下,4S和5R可以显著的增加植物叶片表面积;[E]干旱处理开始时,土壤的含水量的定量结果,菌处理组和对照组之间土壤含水量没有表现显著差异;[F]干旱处理后,腹水之后,植物的存活率,5R处理的植物的存活率比对照组显著增高,4S处理的植物存活率虽然没有比对照组显著增高,但是存活的植物数量要比对照组的植物多;[G]盐胁迫条件下,植物叶片的离子渗透率定量结果表明,4S和5R处理的植物叶片的离子渗透率低于对照组的植物叶片离子渗透率,虽然5R处理的植物叶片的离子渗透率并没有表现出显著性,但是离子渗透率比对照组低。
图7显示了4S和5R帮助大豆抵御盐害和干旱胁迫。[A]正常条件下,4S和5R并没有表现出影响植物营养生长;[B]高盐胁迫条件下,与对照组植物比起来,4S和5R处理的植物表现出更好的对高盐胁迫的抵御能力;[C]干旱条件下,与对照组植物比起来,4S和5R处理的植物表现出更好的对干旱的抵御能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究和实验,意外地发现,中间气单胞菌(Aeromonasmedia)可显著(i)增强植物抗逆性;和/或(ii)促进植物的生长,具体地,本发明的中间气单胞菌(Aeromonas media)具有显著提高植物抗干旱胁迫能力,并可显著提高植物生长性能。实验表明,本发明的中间气单胞菌(Aeromonas media)在胁迫条件下可高效地形成菌膜并定殖在植物根内部、从而显著提高多种寄主植物的抗干旱和盐胁迫等多种抗逆性,并且具有显著促进植物生长的能力。并且本发明人还意外分离获得新的菌株,中间气单胞菌为Aeromonas media H1,Aeromonas media 4S,Aeromonas media 5R。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用,术语“本发明菌株”、“本发明中间气单胞菌Aeromonas media H1”、“中间气单胞菌Aeromonas media H1”、“Aeromonas media”、“本发明的中间气单孢菌”可互换使用,指保藏号为CGMCC No.20533的菌株及其传代菌株或衍生菌株。
如本文所用,术语“本发明菌株”、“本发明中间气单胞菌Aeromonas media4S”、“中间气单胞菌Aeromonas media 4S”、“Aeromonas media”、“本发明的中间气单孢菌”可互换使用,指保藏号为CGMCC No.20957的菌株及其传代菌株或衍生菌株。
如本文所用,术语“本发明菌株”、“本发明中间气单胞菌Aeromonas media5R”、“中间气单胞菌Aeromonas media 5R”、“Aeromonas media”、“本发明的中间气单孢菌”可互换使用,指保藏号为CGMCC No.20958的菌株及其传代菌株或衍生菌株。
如本文所用,术语“抗旱性”或“抗干旱胁迫能力”或“对干旱的抵御能力”指在干旱胁迫下生存率提高,或提高植物对水利用率。
如本文所用,术语“抗盐性”指耐盐性、耐渗透性。如本文所用,术语“抗逆性”包括(但并不限于):抗旱性、耐盐性、耐冷性、耐渗透压、耐热性、抗病性。
中间气单胞菌及其应用
在本发明中,提供一种经筛选的、可显著(i)增强植物抗逆性;和/或(i i)促进植物的生长的新菌株。
本发明的菌株属于气单胞菌科,中间气单胞菌种,命名为Aeromonas media H1,Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R。该菌是发明人从根际土壤中分离鉴定的具有根际促生长菌特性的新菌株。
具体地,通过16sRNA鉴定,本发明的中间气单孢菌株属于中间气单胞菌(Aeromonas media)。
具体地,本发明的中间气单胞菌Aeromonas media H1(Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R与Aeromonas media H1的生理特性相同,这里以Aeromonas media H1为例)的生理特性如下:该菌株表征为革兰氏阴性菌,棒状细菌,单个细菌大小为2-3微米。菌落形态特性为表面光滑,淡黄色,不透明。经过多次不同调节参数下筛选培养,通过测试发现该菌具有嗜温性(温度范围为22-42℃,最适温度为28℃),嗜盐性(盐浓度范围为0-3M,最适盐浓度为1-2M),PH不敏感(PH范围为2-9,最适PH为6-7),对多种重金属离子具有抵抗能力,如砷、铅、镉等,以及一些植物免疫化合物的特点。并且根据生化检测,该菌株已被确定能够产生吲哚乙酸(IAA),并且能够增加磷的溶解性。在完全脱水恢复测试中,超过35%的细菌能够存活。体外实验和纤维观察发现,该细菌能够形成孢子,依靠鞭毛运动,能够形成菌膜。通过显微观察、培养实验以及遗传检测,该细菌为内寄生细菌。该菌株生长的土壤条件范围值如表1所示。
表1.H1生长的土壤条件范围值
土壤条件 | 菌株 |
H1 | |
pH | 5-9(7) |
盐(NaCl)(M) | 0.125-2(0.125) |
镉(Cd2+)(mM) | 0.25-0.5(0.5) |
铬(Cr2+)(μg/mL) | 2.5-20(20) |
钴(Co2+)(mM) | 0.25-2(1) |
铝(Al3+)(mM) | 0.25-8(1) |
一般氮磷钾肥料(g/L) | 0.25-8(1) |
草甘膦(除草剂)(mL/L) | <2.5(2.5) |
噻虫嗪(TMX)(杀虫剂)(mM) | 0.0025-0.08(0.0025) |
多菌灵(CBD)(除真菌蠕虫剂)(mg/mL) | 3.125-12.5(12.5) |
()–括弧内的值代表最适合H1生长的土壤条件值
本发明还提供了中间气单胞菌在(a)减弱叶片的蒸腾作用;和/或(b)降低叶片的离子渗透率;和/或(c)提高植株干重;和/或(d)提高细菌定植量;和/或(e)增加光合作用效率中的应用。
农用制剂
可将本发明的活性物质(中间气单胞菌)以常规的方法制备成农用制剂,例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。
这些制剂可用已知的方法生产,例如,将活性化合物与扩充剂混合,这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体,并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时,有机溶剂也可用作助剂。
用液体溶剂作稀释剂或载体时,基本上是合适的,如:芳香烃类,例如二甲苯,甲苯或烷基萘;氯化的芳香或氯化的脂肪烃类,例如氯苯,氯乙烯或二氯甲烷;脂肪烃类,例如环己烷或石蜡,例如矿物油馏分;醇类,例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类;酮类,例如丙酮,甲乙酮,甲基异丁基酮或环已酮;或不常用的极性溶剂,例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜,以及水。
就液化气的稀释剂或载体时,指的是在常温常压下将成为气体的液体,例如气溶胶推进剂,如卤化的烃类以及丁烷,丙烷,氮气和二氧化碳。
固体载体可用研磨的天然矿物质,例如高岭土,粘土,滑石,石英,活性白土,蒙脱土,或硅藻土,和研磨合成的矿物质,例如高度分散的硅酸,氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石,例如方解石,大理石,浮石,海泡石和白云石,以及无机和有机粗粉合成的颗粒,和有机材料例如锯木屑,椰子壳,玉米棒子和烟草梗的颗粒等。
非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类,聚氧乙烯-脂肪醇醚类,例如烷芳基聚乙二醇醚类,烷基磺酸酯类,烷基硫酸酯类,芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括,例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
在制剂中可以用粘合剂,例如羧甲基纤维素和以粉末,颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物,例如阿拉伯胶,聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。
可以用着色剂例如无机染料,如氧化铁,氧化钻和普鲁士蓝;有机染料,如有机染料,如偶氮染料或金属钛菁染料;和用痕量营养剂,如铁,猛,硼,铜,钴,铝和锌的盐等。
在本发明中,所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂,其含有中间气单胞菌的活性成分;以及农业上可接受的载体。
如本文所用,所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的中间气单胞菌传送给植物的农学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组:水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。
本发明的农用制剂可与其他促生剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中,这些其他的促生剂包括(并不限于):促生种衣剂、促生保水剂、或促生喷洒剂等。
此外,本发明的农用制剂也可与增效剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中,这些增效剂是提高活性菌作用的化合物,由于活性菌本身有活性,也可不必加增效剂。
本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的,只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的,从易于制备和施用的立场看,优选的农用制剂包括喷雾剂、溶液制剂或包衣剂。
本发明所述的农用制剂通常含1×10-1×1015cfu/mL或cfu/g中间气单胞菌(Aeromonas media),较佳地1×104-1×1010cfu/mL或cfu/g中间气单胞菌(Aeromonasmedia),按所述农用制剂的总体积或总重量计。商品制剂或使用剂型中的本发明菌株的浓度可在广阔的范围内变动。
此外,在本发明的农用制剂中还可以含有其他农用化合物(包括有机肥)或农用菌株。其中,代表性的农用化合物包括(但并不限于)N、P、K等元素的化肥化合物、杀虫剂、除草剂等,代表性的菌株包括其他有助于提高植物生长性能和/或抗逆性的菌株,例如固氮菌。
菌种保藏
本发明的菌种中间气单胞菌Aeromonas media H1(与保藏名称相同)已于2020年08月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号:CGMCC No.20533。本发明的菌种中间气单胞菌Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R(均与保藏名称相同)于2020年10月26号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号分别是CGMCC No.20957和CGMCC No.20958。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明的中间气单胞菌能够显著增强植物抗干旱胁迫能力;显著增强植物抗盐胁迫能力;并且可以促进植物(如:藜麦等)的营养生长。并且能够增加磷的溶解性,效率达到50%;具有生长素生产能力,单克隆5天可产生80μM浓度的生长素;具有ACC脱氨酶活性高达60%;能够产生铁硫载体,效率约为110%。
(2)本发明所述的中间气单胞菌在胁迫条件下形成菌膜的效率、定殖在植物根内部的能力、其在多种寄主植物中抗干旱和盐胁迫、以及促进植物生长的能力,都显著高于各种不同的细菌,也显著优于其他一些已知的促生长菌菌种。
(3)本发明的中间气单胞菌对土壤无任何毒副作用,可降低农业生产中农药、化肥的使用量,减少农业面源污染,对改善农田土壤生态环境,提高农产品品质具有重要意义,且能够降低生产成本,适于大面积推广使用。
(4)本发明的中间气单胞菌是发明人首次分离、鉴定得到的新菌株,并首次作为植物根际促生长菌运用到植物当中,能够帮助植物抵抗干旱和盐胁迫,显著促进植物营养生长。因此,发明人分离得到的中间气单胞菌是一个新型的,不具有致病性,且具有显著的植物根际促生菌特性的中间气单胞菌属新菌株。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照《微生物:实验手册》(James Cappuccino和NatalieSherman编,Pearson Education出版社)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
如无特别说明,实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1中间气单胞菌Aeromonas media H1(以下简称H1)的筛选鉴定
本发明的菌株是从高盐的根际土壤中分离出来的(Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R与Aeromonas media H1的筛选条件相同)。为了探究H1的最佳生长环境,本发明人尝试了多种不同的条件。通过测试发现这种细菌具有嗜温性(温度范围为22-42℃,最适温度为28℃),嗜盐性(盐浓度范围为0-3M,最适盐浓度为1-2M),PH不敏感(PH范围为2-9,最适PH为6-7),对多种重金属离子具有抵抗能力,如砷、铅、镉等,以及一些植物免疫化合物。
通过生化实验发现,H1能够产生吲哚乙酸IAA,并且能够增加磷的溶解性。在完全脱水恢复测试中,超过35%的细菌能够存活。体外实验和纤维观察发现,该细菌能够形成孢子,依靠鞭毛运动,能够形成菌膜。通过显微观察、培养实验以及遗传检测,该细菌为内寄生细菌。根据基因组以及氮固定、多种药物或抗体耐受实验。H1的生存条件比较广泛,可以无氧也可以有氧,可以在15度的低温生长,也可以在37度的高温生长,在最适温度28度条件下,培育6到10小时就可以达到指数增长期,12小时便可以达到生长平台期。
中间气单胞菌Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R与Aeromonas mediaH1的上述生理生化特性基本相同,如具有基本一致的菌体大小,约为1-2μm;基本一致的单克隆形态,都为表面光滑的淡黄色克隆;都是兼氧型细菌;都具有生长素的分泌能力;都具有多胺酶功能;都在28℃生长状态最佳等。
通过使用常规的通用引物,比如799F:AACMGGATTAGATACCCKG和1193R:ACGTCATCCCCACCTTCC,扩增16S高变区V5-V7,将扩增好的PCR产物送去公司进行二代测序,从而鉴定出Aeromonas media H1的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示;Aeromonas media4S的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.2所示;Aeromonas media 5R的16S rDNA的序列如SEQID NO.3所示,将序列导入NCBI-blast,选择比对覆盖率≥99%,确定为该细菌的种属。
SEQ ID NO.1:中间气单胞菌H1的16s rDNA(V5-V7)的序列:
cgatttaacgcgttagctccggaagccacgtctcaaggacacagcctccaaatcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctgagcgtcagtctttgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctacccccctctacaagactctagctggacagttttaaatgcaattcccaggttgagcccggggctttcacatctaacttatccaaccgcctgcgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggtgcttcttctgcgagtaacgtcacagctgttgggtattagccaacaacctttcctcctcgctgaaagtactttacaacccgaag
SEQ ID NO.2:中间气单胞菌4S的16s(V5-V7)rDNA的序列:
ACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGG
SEQ ID NO.3:中间气单胞菌5R的16s(V5-V7)rDNA的序列:
AGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC
表1.H1生长的土壤条件范围值
土壤条件 | 菌株 |
H1 | |
pH | 5-9(7) |
盐(NaCl)(M) | 0.125-2(0.125) |
镉(Cd2+)(mM) | 0.25-0.5(0.5) |
铬(Cr2+)(μg/mL) | 2.5-20(20) |
钴(Co2+)(mM) | 0.25-2(1) |
铝(Al3+)(mM) | 0.25-8(1) |
一般氮磷钾肥料(g/L) | 0.25-8(1) |
草甘膦(除草剂)(mL/L) | <2.5(2.5) |
噻虫嗪(TMX)(杀虫剂)(mM) | 0.0025-0.08(0.0025) |
多菌灵(CBD)(除真菌蠕虫剂)(mg/mL) | 3.125-12.5(12.5) |
()–括弧内的值代表最适合H1生长的土壤条件值
实施例2非生物胁迫实验
为了检测本发明的菌株对非生物胁迫的耐受水平和其帮助植物抵抗非生物胁迫的可适用性,本发明人设计了完全脱水回复实验、孢子形成实验、在2MNaCl和30%聚乙二醇条件下生长实验、以及30%聚乙二醇条件下生物膜形成实验。
2.1完全脱水恢复实验
本发明人参考2010年Narváez-Rinaldo等人的实验指征,准备了完全脱水恢复实验。0.45%NaCl处理后的形成菌落数(CFU/ml)与处理前的形成的菌落数的比值为存活率,存活率大于4%认为是能够强烈的抵抗失水,
结果表明,6个独立重复实验显示存活率超过35%,证明这个细菌在某种机制的作用下能够在强烈的干旱胁迫中生存。
2.2生长实验
分别增加LB培养基中NaCl(0.75-3M)和30%PEG的用量,观察细菌在盐胁迫和干旱胁迫条件下的生长状况。
结果表明,在盐浓度低于2M 37℃,200r.p.m的生长条件下,24小时内的生长曲线与正常条件下24小时内的生长曲线一样。此外,30%PEG条件下的生长曲线也与正常条件下一致。
2.3生物膜形成实验
形成菌膜是细菌能够在根际土壤持久生存的基础技能。在胁迫条件下,形成菌膜的能力会显著降低,并通过比色法测定菌膜。
结果表明,本发明的细菌在30%PEG生长条件下能够正常形成菌膜。
实施例3定殖和内生性
定殖在植物根部和其它组织是与宿主共生、提高对非生物胁迫的抵抗能力必不可少的特性。在本实施例中,通过体外实验检测该细菌的定殖能力。方法如下:
10株拟南芥的根部浸泡在含有107CFU/ml细菌的0.45%NaCl溶液中,28℃24小时。之后轻轻的用99%乙醇消毒根表面1分钟并水洗5次,确保洗干净根部表面但不破环根的结构,然后将根部捣碎,用0.45%NaCl溶液稀释统计细菌菌落形成数量。在本实施例中统计定殖率,但检测细菌定殖的位置。
结果:
超声波降解分散表面形成的结构,结果表明该细菌为内生菌。除此之外,dsRED红色荧光蛋白改造菌株能够在荧光共聚焦显微镜下观察到定殖在植物根内部,尤其是在细胞间隙。
实施例4耐旱性实验
在本实施例中,测定本发明细菌帮助植物抵抗干旱的能力。方法如下:
0.4升大小的盆,装满蔬菜育苗基质和蛭石(1:3),种植拟南芥5-9株八天的幼苗,大豆3-4株。H1/4S/5R在LB中培养过夜,28℃、220rpm,浓度约为OD600=1。0.45%(w/v)NaCl溶液作为重悬细菌,每个盆加入50ml重悬液或对照只加入盐溶液,每个条件至少有三个重复。在开始处理时,土壤含水量不应超过30%,植物生长箱条件为22℃,16h光照/8h黑暗。菌处理后,将拟南芥苗子转到生长条件为28℃,14h光照/10h黑暗进行干旱处理。结果如图1-2,图6B,图7C所示。
如图1(A和B)所示,处理14天之后的拟南芥,相比于其对照植株,菌处理的植株会表现抵抗干旱胁迫的能力,处理组存活率约为100%。而对照组约为0%。光合作用效率处理组也显著高于对照组,复水后,处理组为45%而对照组则降到了0.1%。
如图2(A、B、C、D)所示,干旱处理6天后,H1处理过的拟南芥植株叶片表面的温度27.8℃明显高于对照组的26.9℃,说明H1处理后的植株叶片表面的蒸腾速率被降低,帮助植物抗旱。同时,H1处理3天后的气孔活性氧聚集变多,抗旱相关基因上调明显,约为对照组的2~4倍。
如图6所示,干旱14天后,4S和5R处理的植物比未处理的植物长势更好[B],继续干旱至菌处理组的植物开始死亡,复水之后,5R处理的植物存活率约为30%,而对照组只有不到10%[F]。并且在开始干旱时,对照组和处理组在土壤含水量上并没有显著差异[E]。虽然最后的复水存活率,4S处理的植物并没有比对照组显著高出很多,但是在完全干旱之前,4S处理的植物比对照组长势更好,说明,4S可以一定程度帮助植物耐干旱。
如图7所示,干旱8天之后,4S和5R处理的大豆比对照组更加耐干旱,复水之后,大豆的存活率也更高[C]。对照组的植物存活率只有约2/10,而4S处理的大豆存活率可以达到近10/10,5R处理的大豆存活率约为6/10。
实施例5耐盐性实验
在本实施例中,测定本发明细菌帮助植物抵抗盐胁迫的能力。方法如下:0.4升大小的盆,装满蔬菜育苗基质和蛭石(1:2),种植拟南芥5-9株八天的幼苗,大豆3-4株。H1/4S/5R在LB中培养过夜,28℃、220rpm,浓度约为OD600=1。0.45%(w/v)NaCl溶液作为重悬细菌,每个盆加入50ml重悬液或对照只加入盐溶液,每个条件至少有三个重复。在开始处理时,土壤含水量不应超过30%,植物生长箱条件为22℃,16h光照/8h黑暗。拟南芥中,菌处理后,每隔两天浇一次盐水,浓度为150或者250毫摩尔,一个托盘每次浇600毫升,结果如图3和图6C、G所示;大豆中,每隔两天浇一次盐水,浓度为300毫摩尔,一个托盘每次浇600毫升,结果如图7B所示。
如图3所示,经15天盐胁迫处理后,H1处理的拟南芥表现出盐胁迫抵抗能力[A],处理组存活效率为90%远远高于对照组的20%存活率。离子渗透率检测证明,H1处理后的植株叶片离子渗透率更低[B]下降了近20%,同时受到盐胁迫的死亡植株也越少,死亡植株下降了近70%[C]。
如图6所示,经14天盐胁迫处理后,4S和5R处理的拟南芥表现出盐胁迫抵抗能力[C],离子渗透率检测证明,4S和5R处理后的植株叶片离子渗透率更低[G]下降了约10%-20%。
如图7所示,正常条件下,4S和5R处理的大豆,没有表现出明显的生产差异[A];盐胁迫10天的大豆,4S和5R处理的大豆比不处理的大豆表现出更耐盐的生长状态[B]。
目前为止,发明人已经该细菌成功应用在拟南芥、玉米、水稻、苜蓿和其它作物中,均表现出增强植物的非生物胁迫能力。
实施例6促生长实验
在本实施例中,测定本发明细菌帮助植物促进生长的能力。方法如下:0.4升大小的盆,装满蔬菜育苗基质和蛭石(1:1),每隔盆里种植1株八天的幼苗。H1/4S/5R在LB中培养过夜,28℃、220rpm,浓度约为OD600=1。0.45%(w/v)NaCl溶液作为重悬细菌,每个盆加入50ml重悬液或对照只加入盐溶液,每个条件至少有三个重复。在开始处理时,土壤含水量不应超过30%,拟南芥生长箱条件为22℃,16h光照/8h黑暗;大豆和藜麦的生长室条件为28℃,14h光照/10h黑暗。菌处理后,每隔两天浇一次水,一个托盘每次浇400毫升(拟南芥)和600毫升(大豆)。结果如图4-6所示:
如图4所示,经35天H1处理后,H1处理的藜麦表现出促生长能力。
如图5A-D所示,处理35天之后,藜麦相比于其对照植株,H1菌处理的植株会表现出显著的促进生长的能力,并且明显强于已知的根际促生菌P.putida KT2440。像单株植株干重提高了近3倍[A],单株植株根的干重增加了近3.5倍[B],单位干重的细菌定植量提高了近6倍[C],光合作用效率也增加了约5%[D]。
如图6所示,在正常条件下,4S和5R处理14天之后的拟南芥比对照组长得更大[A],植物的叶片表面积也显著高于对照组,4S比对照组高了约1.5倍,而5R比对照组高了约2倍[D]。
目前为止,发明人已经该细菌成功应用在藜麦、籽粒苋和其它作物中,均表现出促进植物的营养生长。
菌种保藏
本发明的菌种中间气单胞菌Aeromonas media H1(与保藏名称相同)已于2020年08月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号:CGMCC No.20533。
本发明的菌种中间气单胞菌Aeromonas media 4S和Aeromonas media 5R(均与保藏名称相同)于2020年10月26号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号分别是CGMCC No.20957和CGMCCNo.20958。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 中间气单胞菌(Aeromonas media)及其应用
<130> P2021-2244
<150> CN202011061689.0
<151> 2020-09-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cgatttaacg cgttagctcc ggaagccacg tctcaaggac acagcctcca aatcgacatc 60
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctg 120
agcgtcagtc tttgtccagg gggccgcctt cgccaccggt attcctccag atctctacgc 180
atttcaccgc tacacctgga attctacccc cctctacaag actctagctg gacagtttta 240
aatgcaattc ccaggttgag cccggggctt tcacatctaa cttatccaac cgcctgcgtg 300
cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctc cgtattaccg cggctgctgg 360
cacggagtta gccggtgctt cttctgcgag taacgtcaca gctgttgggt attagccaac 420
aacctttcct cctcgctgaa agtactttac aacccgaag 459
<210> 2
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
acgatgtcga tttggaggct gtgtccttga gacgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat 60
cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 120
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac 180
atgtctggaa tcctgcagag atgcgggagt gccttcggga atcagaacac aggtgctgca 240
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc 300
tgtcctttgt tgccagcacg taatggtggg aactcaaggg agactgccgg 350
<210> 3
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aggctgtgtc cttgagacgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag 60
tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 120
gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgtc tggaatcctg 180
cagagatgcg ggagtgcctt cgggaatcag aacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 240
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctgtcc tttgttgcca 300
gcacgtaatg gtgggaactc aagggagact gccggtgata aaccggagga aggtggggat 360
gacgtc 366
Claims (10)
1.一种中间气单胞菌,其特征在于,所述中间气单胞菌为中间气单胞菌(Aeromonas media),并且所述中间气单胞菌选自下组或其组合:Aeromonas media H1,保藏号为CGMCCNo. 20533;Aeromonas media 4S,保藏号为CGMCC No. 20957;Aeromonas media 5R,保藏号为CGMCC No. 20958。
2.一种农用制剂,其特征在于,所述农用制剂包括:(a)安全有效量的权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)和/或其代谢产物;以及(b)农业上可接受的载体。
3.一种权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)、或权利要求2所述的农用制剂的用途,其特征在于,用于制备组合物或制剂,所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途:(i) 增强植物抗逆性;(ii) 促进植物的生长,所述抗逆性选自:抗旱性、和/或耐盐性。
4.一种权利要求2所述农用制剂的制法,其特征在于,包括步骤:
将权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)和/或其代谢产物与植物培养中可接受的载体基质混合,从而形成权利要求2所述的农用制剂。
5.一种生产权利要求2所述的农用制剂的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)将权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)与农业上可接受的载体进行混合,从而制得权利要求2所述的农用制剂。
6.一种(i) 增强植物抗逆性;和/或(ii) 促进植物的生长的方法,其特征在于,给植物施用权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)或权利要求2所述的农用制剂。
7.一种植物种子包衣剂,其特征在于,所述包衣剂包括权利要求1所述的中间气单胞菌(Aeromonas media)。
8.一种对植物种子进行包衣的方法,其特征在于,所述方法包括向所述植物种子施用权利要求7所述的包衣剂。
9.一种微生物复合肥,其特征在于,包括权利要求1所述的中间气单孢菌 (Aeromonas media)。
10.一种权利要求7所述的包衣剂、或权利要求9所述的微生物复合肥的用途,其特征在于,用于制备农用制剂或生物肥料,所述农用制剂或生物肥料用于选自下组的一种或多种用途:(i) 增强植物抗逆性;(ii) 促进植物的生长,所述抗逆性选自:抗旱性和/或耐盐性。
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CN (1) | CN114317315B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108424866A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-08-21 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲟源中间气单胞菌AMth-1及PCR检测引物及应用 |
CN109402004A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-01 | 山东农业大学 | 一株简氏气单胞菌及其在提高植物抗逆性中的应用 |
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US9414602B1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pseudomonas fluorescens inhibit annual bluegrass and rough bluegrass root growth and germination |
-
2021
- 2021-09-26 CN CN202111139486.3A patent/CN114317315B/zh active Active
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Bacteriocin activity and probiotic activity of Aeromonas media;L F Gibson;J Appl Microbiol;摘要 * |
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CN114317315A (zh) | 2022-04-12 |
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