CN114316028A - 一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，属于生物工程技术领域，所述工艺包括以下步骤：搅浆、磨浆、酶解、全切割、离心、微滤、超滤、纳滤和喷雾干燥等。本发明的工艺具有产品得率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点，与现有技术相比，本发明工艺流程更短、周期更短，污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺。
背景技术
蛋白质是人体生长发育、保持生命正常活动必不可少的物质之一。现代生物代谢研究表明，蛋白质消化后主要是以多肽的形式直接吸收。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时还具有防病治病、调节人体生理机能的功效。有些水解多肽具有原食品蛋白或其组成氨基酸所没有的独特生理机能。
胶原多肽的制备方法主要包括化学方法和酶法等。化学方法是利用酸或碱水解胶原蛋白，虽然方法简单、成本低廉，但水解过程中会破坏L-型氨基酸而形成D-型氨基酸，产物复杂，蛋白质的营养损失大，并且生产过程产生的废水多，生产周期长，不利于工业化生产。与酸法和碱法相比，酶法具有水解效率高、条件温和、易于控制水解进程等优点，尤其最重要的一点是能对蛋白质进行定向水解而产生具有特定生物活性的肽类。另外，酶法被广泛用来改善蛋白质的功能性质，如溶解性、乳化性、胶凝性能、起泡性、持水性和包油性等。
目前，胶原多肽的制备多是采用酶法，按照用酶的种类多少分为单酶水解法和多酶水解法。由于每种酶都有自己的酶切位点，因此单酶水解只能切断有限的位点，不仅水解程度有限，而且水解产生的肽片段的端基氨基酸也是单一的，导致获得的胶原多肽纯度低，产品得率不高。
经检索，未发现以鱼为原料，采用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺公开的文献，因此本发明工艺创新性较强。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，以解决如何采用鱼生产高质量胶原多肽，并且提高纯度和产品得率的问题。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，包括以下步骤：
(1)将10-15kg的水生动物放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入1.5-2.1‰抗坏血酸溶液，并加入350-720kg纯净水，在转速为60-80r/min下搅拌5-7min，获得抗氧化水生动物混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化水生动物混合浆中加入质量为2.5-3.5‰的环状糊精，在转速为100-150r/min下搅拌3-5min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为42-48℃，制得细度为200-300目的水生动物浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为5.0-6.0，加入底物质量2.5-3％的复合酶a，将原料与液体比按1:19-21投入高效热能反应釜，调pH值为8.5-9.0后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为15-18KW，温度为38-42℃，反应釜转速为200-300r/min，运行9-11min，对物料定性定量；调pH值为6.0-7.0，加入底物质量2-2.5％的复合酶b，调温为49-52℃，频率为915MHz，反应釜转速为100-200r/min，进行粗肽切割18-22min，测肽量，降温至39-41℃，调pH为7.4-7.6，加入底物质量1-2％的复合酶c，调温为55-57℃，频率为2450MHz，转速为200-250r/min，复合粗肽切割14-16min；
(4)测调pH为7.4-7.6，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为15-18KW，温度为89-91℃，反应釜转速为250-350r/min，全切割19-21min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.4-7.6，加入1-1.5％的壳聚糖，在反应釜转速为140-160r/min下搅拌5-6min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.1-0.26MPa、pH值为6.3-6.8、温度为42-48℃、膜面流速为2-3.5M/S、浓缩比为3.3-3.6倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.24-0.38MPa、pH值为5.2-5.7、温度为40-48℃、膜面流速为1.5-2.7M/S、浓缩比为5.1-5.8倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.3-0.34MPa、pH值为5.3-5.5、温度为42-45℃、膜面流速为2-2.5M/S、浓缩比为5.3-5.6倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.7-0.9MPa，循环流量为1.5-2.5m3/h，浓缩倍数为7-9；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
进一步地，步骤(3)中所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为3-5:2-3组成。
进一步地，所述酸性蛋白酶的酶活为10-15万U/g。
进一步地，所述胰酶的酶活为5-10万U/g。
进一步地，步骤(3)中所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为6-10:2-4组成。
进一步地，所述脂肪酶的酶活为10-15万U/g。
进一步地，所述动物蛋白水解酶活为6-12万U/g。
进一步地，步骤(3)中所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为4-7:2-5组成。
进一步地，所述中性蛋白酶的酶活为5-10万U/g。
进一步地，所述风味酶的酶活为5-9万U/g。
与现有技术相比，本发明的工艺具有以下优点和显著进步：
(1)本发明用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺具有产品得率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点。
(2)本发明经过磨浆后进入酶解步骤，与常规的磨浆后经过粗滤、微滤、超滤、碱溶、酶解相比，整个工艺流程更短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
(3)本发明工艺制得的多肽产品的乳化性高，乳化活力指数达到了11.02cm2/g以上；抗氧化性优，DPPH自由基清除率达到了95.6％以上；产品为淡黄色、口感平淡，润和、略微甜味，从以上检测指标可见，本发明工艺制得的胶原多肽产品质量优，可推广应用。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，现采用以下实施例加以说明，以下实施例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
以下实施例中，所述用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，包括以下步骤：
(1)将10-15kg的水生动物放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入1.5-2.1‰抗坏血酸溶液，并加入350-720kg纯净水，在转速为60-80r/min下搅拌5-7min，获得抗氧化水生动物混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化水生动物混合浆中加入质量为2.5-3.5‰的环状糊精，在转速为100-150r/min下搅拌3-5min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为42-48℃，制得细度为200-300目的水生动物浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为5.0-6.0，加入底物质量2.5-3％的复合酶a，所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为3-5:2-3组成，所述酸性蛋白酶的酶活为10-15万U/g，所述胰酶的酶活为5-10万U/g，将原料与液体比按1:19-21投入高效热能反应釜，调pH值为8.5-9.0后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为15-18KW，温度为38-42℃，反应釜转速为200-300r/min，运行9-11min，对物料定性定量；调pH值为6.0-7.0，加入底物质量2-2.5％的复合酶b，所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为6-10:2-4组成，所述脂肪酶的酶活为10-15万U/g，所述动物蛋白水解酶活为6-12万U/g，调温为49-52℃，频率为915MHz，反应釜转速为100-200r/min，进行粗肽切割18-22min，测肽量，降温至39-41℃，调pH为7.4-7.6，加入底物质量1-2％的复合酶c，所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为4-7:2-5组成，所述中性蛋白酶的酶活为5-10万U/g，所述风味酶的酶活为5-9万U/g，调温为55-57℃，频率为2450MHz，转速为200-250r/min，复合粗肽切割14-16min；
(4)测调pH为7.4-7.6，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为15-18KW，温度为89-91℃，反应釜转速为250-350r/min，全切割19-21min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.4-7.6，加入1-1.5％的壳聚糖，在反应釜转速为140-160r/min下搅拌5-6min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.1-0.26MPa、pH值为6.3-6.8、温度为42-48℃、膜面流速为2-3.5M/S、浓缩比为3.3-3.6倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.24-0.38MPa、pH值为5.2-5.7、温度为40-48℃、膜面流速为1.5-2.7M/S、浓缩比为5.1-5.8倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.3-0.34MPa、pH值为5.3-5.5、温度为42-45℃、膜面流速为2-2.5M/S、浓缩比为5.3-5.6倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.7-0.9MPa，循环流量为1.5-2.5m3/h，浓缩倍数为7-9；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
下面通过更具体的实施例加以说明。
实施例1
一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，包括以下步骤：
(1)将11kg的罗非鱼放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入1.6‰抗坏血酸溶液，并加入380kg纯净水，在转速为60r/min下搅拌7min，获得抗氧化罗非鱼混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化罗非鱼混合浆中加入质量为2.5‰的环状糊精，在转速为100r/min下搅拌5min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为42℃，制得细度为200目的罗非鱼浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为5.2，加入底物质量2.5％的复合酶a，所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为3:2组成，所述酸性蛋白酶的酶活为10万U/g，所述胰酶的酶活为6万U/g，将原料与液体比按1:20投入高效热能反应釜，调pH值为8.5后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为15KW，温度为38℃，反应釜转速为200r/min，运行11min，对物料定性定量；调pH值为6.0，加入底物质量2％的复合酶b，所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为7:2组成，所述脂肪酶的酶活为10万U/g，所述动物蛋白水解酶活为6万U/g，调温为49℃，频率为915MHz，反应釜转速为100r/min，进行粗肽切割22min，测肽量，降温至39℃，调pH为7.4，加入底物质量1％的复合酶c，所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为4:3组成，所述中性蛋白酶的酶活为6万U/g，所述风味酶的酶活为5万U/g，调温为55℃，频率为2450MHz，转速为200r/min，复合粗肽切割16min；
(4)测调pH为7.4，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为15KW，温度为89℃，反应釜转速为250r/min，全切割21min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.4，加入1.1％的壳聚糖，在反应釜转速为140r/min下搅拌6min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.12MPa、pH值为6.4、温度为43℃、膜面流速为2.3M/S、浓缩比为3.4倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.25MPa、pH值为5.2、温度为42℃、膜面流速为1.6M/S、浓缩比为5.2倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.32MPa、pH值为5.3、温度为43℃、膜面流速为.1M/S、浓缩比为5.3倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.7MPa，循环流量为1.7m3/h，浓缩倍数为7；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
实施例2
一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，包括以下步骤：
(1)将13kg的安康鱼放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入1.8‰抗坏血酸溶液，并加入560kg纯净水，在转速为70r/min下搅拌6min，获得抗氧化安康鱼混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化安康鱼混合浆中加入质量为3‰的环状糊精，在转速为120r/min下搅拌4min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为45℃，制得细度为300目的安康鱼浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为5.6，加入底物质量2.8％的复合酶a，所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为4:3组成，所述酸性蛋白酶的酶活为13万U/g，所述胰酶的酶活为8万U/g，将原料与液体比按1:20投入高效热能反应釜，调pH值为8.70后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为17KW，温度为40℃，反应釜转速为300r/min，运行9min，对物料定性定量；调pH值为6.4，加入底物质量2.3％的复合酶b，所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为9:4组成，所述脂肪酶的酶活为12万U/g，所述动物蛋白水解酶活为7万U/g，调温为50℃，频率为915MHz，反应釜转速为200r/min，进行粗肽切割18min，测肽量，降温至40℃，调pH为7.5，加入底物质量1.3％的复合酶c，所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为6:5组成，所述中性蛋白酶的酶活为8万U/g，所述风味酶的酶活为6万U/g，调温为56℃，频率为2450MHz，转速为230r/min，复合粗肽切割15min；
(4)测调pH为7.5，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为17KW，温度为90℃，反应釜转速为300r/min，全切割20min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.5，加入1.2％的壳聚糖，在反应釜转速为150r/min下搅拌5min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.2MPa、pH值为6.6、温度为45℃、膜面流速为2.8M/S、浓缩比为3.5倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.32MPa、pH值为5.5、温度为45℃、膜面流速为2M/S、浓缩比为5.6倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.32MPa、pH值为5.4、温度为44℃、膜面流速为2.3M/S、浓缩比为5.5倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.8MPa，循环流量为2m3/h，浓缩倍数为8；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
实施例3
一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，包括以下步骤：
(1)将15kg的草鱼放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入2‰抗坏血酸溶液，并加入720kg纯净水，在转速为80r/min下搅拌5min，获得抗氧化草鱼混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化草鱼混合浆中加入质量为3.5‰的环状糊精，在转速为150r/min下搅拌3min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为48℃，制得细度为300目的草鱼浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为6.0，加入底物质量2.9％的复合酶a，所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为5:3组成，所述酸性蛋白酶的酶活为15万U/g，所述胰酶的酶活为10万U/g，将原料与液体比按1:21投入高效热能反应釜，调pH值为8.9后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为18KW，温度为42℃，反应釜转速为300r/min，运行9min，对物料定性定量；调pH值为7.0，加入底物质量2.5％的复合酶b，所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为10:3组成，所述脂肪酶的酶活为15万U/g，所述动物蛋白水解酶活为12万U/g，调温为52℃，频率为915MHz，反应釜转速为200r/min，进行粗肽切割18min，测肽量，降温至41℃，调pH为7.6，加入底物质量2％的复合酶c，所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为7:5组成，所述中性蛋白酶的酶活为9万U/g，所述风味酶的酶活为8万U/g，调温为57℃，频率为2450MHz，转速为250r/min，复合粗肽切割14min；
(4)测调pH为7.6，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为18KW，温度为91℃，反应釜转速为350r/min，全切割19min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.6，加入1.5％的壳聚糖，在反应釜转速为160r/min下搅拌5min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.24MPa、pH值为6.7、温度为46℃、膜面流速为3.2M/S、浓缩比为3.5倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.35MPa、pH值为5.6、温度为47℃、膜面流速为2.5M/S、浓缩比为5.8倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.32MPa、pH值为5.5、温度为45℃、膜面流速为2.4M/S、浓缩比为5.6倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.9MPa，循环流量为2.4m3/h，浓缩倍数为9；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
对比例1
与实施例2生产产品的工艺基本相同，不同之处在于不进行步骤(3)的酶解a。
对比例2
与对比例1生产产品的工艺基本相同，不同之处在于进行步骤(3)的酶解a，但加入的是底物质量2.8％的酸性蛋白酶，而不是复合酶a，步骤(3)的其他工艺参数与实施例2步骤(3)的工艺参数相同。
对比例3
与对比例1生产产品的工艺基本相同，不同之处在于进行步骤(3)的酶解a，但加入的是底物质量2.8％的胰酶，而不是复合酶a，步骤(3)的其他工艺参数与实施例2步骤(3)的工艺参数相同。
对比例4
与实施例2生产产品的工艺基本相同，不同之处在于所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为1:5组成。
对比例5
与实施例2生产产品的工艺基本相同，不同之处在于所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为6:1组成。
对比例6
采用中国专利文献“一种胶原多肽及降低胶原多肽苦味的制备方法(专利号：ZL201510112017.0)”的实施例3工艺制备胶原多肽。
一、多肽纯度和产品得率检测
对实施例1-3和对比例1-6制得的产品进行检测多肽纯度和产品得率，其中多肽纯度采用高效液相色谱法检测，产品得率为胶原多肽的质量与原料使用的质量之比，结果用百分比(％)表示，结果如下表所示：
| 组别 | 多肽纯度(％) | 产品得率(％) |
| 实施例1 | 82.2 | 30.7 |
| 实施例2 | 85.4 | 32.5 |
| 实施例3 | 83.5 | 29.6 |
| 对比例1 | 53.7 | - |
| 对比例2 | 69.4 | - |
| 对比例3 | 63.9 | - |
| 对比例4 | 73.5 | - |
| 对比例5 | 76.3 | - |
| 对比例6 | 72.1 | 25.5 |
备注：“-”表示不检测。
由上表可知：(1)实施例1-3的工艺制得的产品多肽纯度为82.2-85.4％，产品得率29.6-32.5％，而现有技术(对比例6)的工艺制得的产品多肽纯度仅为72.1％，产品得率25.5％，其中本发明工艺制得的产品多肽纯度比现有技术制得的产品多肽纯度高至少14％，产品得率至少高16.1％。另外本发明的酶解温度可控，酶解时间少于1h，而现有技术(对比例6)的工艺酶解时间大于3h，可见酶解效率至少提高2倍，说明本发明技术与现有技术相比，具有显著进步。此外由实施例1-3的工艺制得的产品多肽纯度和产品得率数据可见，实施例2为本发明的最优实施例。
(2)由实施例2和对比例1-3的多肽纯度数据可见，生产胶原多肽工艺中缺少酸性蛋白酶、胰酶均使得多肽纯度大大降低，分别降低了21.5％和16％。实施例2和对比例1相比，多添加了酸性蛋白酶、胰酶，由实施例2和对比例1的多肽纯度数据，计算得出酸性蛋白酶、胰酶一起使用时提高多肽纯度的效果值＝85.4％-53.7％＝31.7％。对比例2和对比例1相比，多添加了酸性蛋白酶，由对比例2和对比例1的多肽纯度数据，计算得出酸性蛋白酶单独使用时提高多肽纯度的效果值＝69.4％-53.7％＝15.7％。对比例3和对比例1相比，多添加了胰酶，由对比例3和对比例1的多肽纯度数据，计算得出胰酶单独使用时提高多肽纯度的效果值＝63.9％-53.7％＝10.2％。那么酸性蛋白酶、胰酶分别单独使用时叠加提高多肽纯度的效果值＝15.7％+10.2％＝25.9％。而酸性蛋白酶、胰酶一起使用时提高多肽纯度的效果值为31.7％，那么酸性蛋白酶、胰酶一起使用时提高多肽纯度的效果值比酸性蛋白酶、胰酶分别单独使用时叠加提高多肽纯度的效果值提高的百分数＝(31.7％-25.9％)÷25.9％×100％＝22.4％，提高的百分数大于10％，说明酸性蛋白酶、胰酶一起使用时产生了协同作用，协同提高了多肽纯度，这是因为：实施例2选择起始较高的pH值，胰酶处于比较适宜的pH值，胰酶处于优势反应状态，酸性蛋白酶不在最佳pH值，活性不高，不发挥主要酶解作用；通过酶解反应产生的氨基酸官能团调整整个反应体系的pH下降，让底物的pH值进入酸性蛋白酶最适pH值阶段，此时胰酶仍然有一定的反应活性，随着酸性蛋白酶的活性升高，酶切割进入全面阶段，这样不但延续了蛋白水解的进程，同时确保不同时期不同蛋白酶反应过度，这样既不会让酶解速度下降，又可以让辅助酶辅助优势酶，不会过度酶解，实现了酸性蛋白酶、胰酶协同提高多肽纯度，取得了意想不到的技术效果，符合组合发明的创造性要求。
(3)对比例4、5中酸性蛋白酶、胰酶的重量比不在3-5:2-3的比例范围内时，对比例4和实施例2相比，多肽纯度下降了16.2％；对比例5和实施例2相比，多肽纯度下降了11.9％；两组酸性蛋白酶、胰酶的重量比不在3-5:2-3的比例范围内时，下降值均大于10％以上，且对比例4、5获得的多肽纯度数值与现有技术(对比例6)获得的多肽纯度数值相差不大。说明了本发明控制酸性蛋白酶、胰酶的重量比为3-5:2-3的必要性，在酸性蛋白酶、胰酶形成的酶切割体系中，通过平衡酸性蛋白酶、胰酶之间的比例，达到最佳的酶解效果，取得了意想不到的技术效果，符合选择发明的创造性要求。
二、对本发明产品其他质量指标检测
对实施例1-3制得的胶原多肽产品进行乳化性、抗氧化性进行检测，并进行感官评价，其中抗氧化性采用国标GB/T 39100-2020检测，依据国标GB31645-2018进行感官评价，乳化性是指单位质量的蛋白质(或多肽)能够稳定油水界面的面积(cm2/g)，用EAI(乳化活力指数)表示，本实验采用浑浊度法，检测方法如下：
称取一定量的胶原蛋白多肽，用0.2mol/L，pH7.0磷酸钠缓冲液溶解并配置成1％的溶液(w/v)，再按照0.025L/L的比例加入大豆色拉油，用均质机、匀浆机或电动搅拌使其形成均一的乳化液，然后分别于0min和30min各取1ml新配置的乳化液用99ml蒸馏水稀释100倍，再取1ml被稀释的乳化液加入到39ml的0.1％SDS进行稀释，最终稀释4000倍，将最后的溶液在500nm下进行吸光值测定(测定9次取平均值)，最后按照下面的公式计算出EAI值。
EAI＝2×T×(A×稀释倍数)/(C×Φ×100)
式中：
EAI——乳化活性；
T——2.303；
C——乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白浓度，g/ml；
Φ——乳化液中油的体积分数，0.025；
A——溶液在500nm处的吸光值。
结果如下表所示：
由上表可知：本发明工艺制得的产品的乳化性高，乳化活力指数达到了11.02cm2/g以上；抗氧化性优，DPPH自由基清除率达到了95.6％以上；产品为淡黄色、口感平淡，润和、略微甜味，从以上检测指标可见，本发明工艺制得的胶原多肽产品质量优，可推广应用。
以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (10)
1.一种用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将10-15kg的水生动物放入冻肉绞肉机中绞成肉馅状原料，然后向肉馅状原料中加入1.5-2.1‰抗坏血酸溶液，并加入350-720kg纯净水，在转速为60-80r/min下搅拌5-7min，获得抗氧化水生动物混合浆；
(2)向步骤(1)获得的抗氧化水生动物混合浆中加入质量为2.5-3.5‰的环状糊精，在转速为100-150r/min下搅拌3-5min，制得均匀混料，接着将均匀混料投入胶体磨中研磨，研磨温度为42-48℃，制得细度为200-300目的水生动物浆液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的水生动物浆液降至室温，调pH值为5.0-6.0，加入底物质量2.5-3％的复合酶a，将原料与液体比按1:19-21投入高效热能反应釜，调pH值为8.5-9.0后，启动高效热能反应釜，频率为915MHz，功率为15-18KW，温度为38-42℃，反应釜转速为200-300r/min，运行9-11min，对物料定性定量；调pH值为6.0-7.0，加入底物质量2-2.5％的复合酶b，调温为49-52℃，频率为915MHz，反应釜转速为100-200r/min，进行粗肽切割18-22min，测肽量，降温至39-41℃，调pH为7.4-7.6，加入底物质量1-2％的复合酶c，调温为55-57℃，频率为2450MHz，转速为200-250r/min，复合粗肽切割14-16min；
(4)测调pH为7.4-7.6，启动高效热能反应釜，频率为2450MHz，功率为15-18KW，温度为89-91℃，反应釜转速为250-350r/min，全切割19-21min，制得全切割后的多肽液；
(5)将步骤(4)制得的多肽液调pH为7.4-7.6，加入1-1.5％的壳聚糖，在反应釜转速为140-160r/min下搅拌5-6min，抽取多肽液至离心机，离心析出清液，制得离心后的多肽液；
(6)将步骤(5)制得的离心后的多肽液用能截留30000分子量的膜进行微滤，制得浓缩液a，微滤的操作参数为：压泵为0.1-0.26MPa、pH值为6.3-6.8、温度为42-48℃、膜面流速为2-3.5M/S、浓缩比为3.3-3.6倍；
(7)将步骤(6)制得的浓缩液a依次进行两次超滤，制得浓缩液b，第一次超滤用能截留10000分子量的膜，第二次超滤用能截留5000分子量的膜，其中第一次超滤操作参数为：压泵为0.24-0.38MPa、pH值为5.2-5.7、温度为40-48℃、膜面流速为1.5-2.7M/S、浓缩比为5.1-5.8倍；第二次超滤操作参数为：压泵为0.3-0.34MPa、pH值为5.3-5.5、温度为42-45℃、膜面流速为2-2.5M/S、浓缩比为5.3-5.6倍；
(8)将步骤(7)制得的浓缩液b用能截留1000分子量的膜进行纳滤，制得浓缩液c，纳滤的操作参数为：压力为0.7-0.9MPa，循环流量为1.5-2.5m3/h，浓缩倍数为7-9；
(9)将步骤(8)制得的浓缩液c进行真空喷雾干燥，制得粉状胶原多肽。
2.根据权利要求1所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述复合酶a由酸性蛋白酶、胰酶按质量比为3-5:2-3组成。
3.根据权利要求2所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述酸性蛋白酶的酶活为10-15万U/g。
4.根据权利要求2所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述胰酶的酶活为5-10万U/g。
5.根据权利要求1所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述复合酶b由脂肪酶、动物蛋白水解酶按质量比为6-10:2-4组成。
6.根据权利要求5所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述脂肪酶的酶活为10-15万U/g。
7.根据权利要求5所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述动物蛋白水解酶活为6-12万U/g。
8.根据权利要求1所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，步骤(3)中所述复合酶c由中性蛋白酶、风味酶按质量比为4-7:2-5组成。
9.根据权利要求8所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述中性蛋白酶的酶活为5-10万U/g。
10.根据权利要求8所述的用物理、生物双切割一步法生产胶原多肽的工艺，其特征在于，所述风味酶的酶活为5-9万U/g。
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- 2021-12-30 CN CN202111669456.3A patent/CN114316028A/zh active Pending
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