CN114315817A

CN114315817A - 美洛昔康半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114315817A
Application number: CN202011035239.4A
Authority: CN
Inventors: 王战辉; 温凯; 余文博; 沈建忠; 米佳飞; 史为民
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN114315817B

Abstract

本发明提供美洛昔康半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。美洛昔康半抗原的结构如式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示：

Description

美洛昔康半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及美洛昔康半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

美洛昔康(Meloxicam，简称MLX)是一种昔康类非甾体抗炎药物，其作用机制是通过选择性抑制环氧化酶-2(COX-2)来减少前列腺素等炎性介质的生成而发挥解热、镇痛和抗炎作用。美洛昔康在畜牧养殖业中使用广泛，临床上常用于各种疾病感染导致的猪、牛、马等大型动物的急性炎症与疼痛；其与抗生素联合用药，具有显著的药物协同作用，能够有效改善疾病的临床症状。

由于美洛昔康具有良好的抗炎、镇痛效果与价格低廉等优点，使得其在预防与治疗食源性动物疾病感染时，缺少节制，过量使用，造成动物性食品中药物残留超标，危害人体健康。

为加强对动物源性食品中美洛昔康的残留监管，保证动物产品质量安全，许多国家和地区都对食源性动物组织中美洛昔康最大残留限量作出了规定：欧盟委员会规定美洛昔康在食源性动物不同组织的最大残留限量为15-65μg/kg；日本肯定列表规定美洛昔康在动物不同组织的最大残留限量为10-50μg/kg。

目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。这些方法虽然特异性强、灵敏度高，但是样品前处理复杂繁琐，检测时间长，成本也较高，推广使用受到限制。免疫分析方法是一种基于抗原与抗体特异性反应的定性定量分析方法，该方法特异性强、灵敏度高，操作简单，反应快速，适合现场大量样本的实时检测。

已知影响免疫分析方法的核心因素是抗体的特异性和亲和性，而抗体的性质又取决于半抗原的分子结构，因此半抗原的设计与合成即成为制备特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供美洛昔康半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供美洛昔康半抗原，其结构如式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示：

第二方面，本发明提供所述美洛昔康半抗原的制备方法，当所述半抗原为式Ⅰ所示化合物时，其制备方法包括如下步骤：

(1)称取10-30g 2-氨基噻唑-5-甲酸于5-20mL无水乙醇中，加入5％浓硫酸，50-60℃反应过夜，冷却至室温后倒入100mL饱和碳酸钠水溶液中，加乙酸乙酯提取，旋干，得化合物A；

(2)将化合物A和10-30g磺酰胺甲基物加入5-20mL二甲苯中，60-80℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得化合物C；

(3)将化合物C溶于30-70mL四氢呋喃中，滴加0.3-0.7mL 1M氢氧化钠溶液，40-60℃反应1-3h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出的固体物质即为式Ⅰ所示化合物。

其中，化合物A、磺酰胺甲基物和化合物C的结构分别如下：

当所述半抗原为式Ⅱ所示化合物时，其制备方法包括：称取10-20g对氨基苯丙酸和20-40g磺酰胺甲基物加入到10mL二甲苯中，60-80℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得到固体物质即为式Ⅱ所示化合物。

当所述半抗原为式Ⅲ所示化合物时，其制备方法包括如下步骤：

(1)称取10-20g 6-氨基烟酸于5-20mL无水乙醇中，加入5％浓硫酸，40-60℃反应过夜，冷却至室温后倒入30mL饱和碳酸钠水溶液中，加乙酸乙酯提取，旋干，得化合物F；

(2)将化合物F和20-40g磺酰胺甲基物加入10mL二甲苯中，70℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得化合物G；

(3)将化合物G溶于50mL四氢呋喃中，滴加0.5mL 1M氢氧化钠溶液，50℃反应2h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出的固体物质即为式Ⅲ所示化合物。

其中，化合物F和G的结构分别如下：

本发明中，磺酰胺甲基物购自北京百灵威科技有限公司。

第三方面，本发明提供美洛昔康人工抗原，其是将上述美洛昔康半抗原与载体蛋白偶联后得到的。所述美洛昔康人工抗原可以作为免疫原，也可以作为包被原。

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等中的至少一种；优选牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。

第四方面，本发明提供所述美洛昔康人工抗原的制备方法，其是将所述美洛昔康半抗原与载体蛋白通过酰胺键偶联得到的。

可选地，采用活泼酯法将所述美洛昔康半抗原(半抗原的羧基碳)连接到所述载体蛋白的氨基上。

第五方面，本发明提供所述美洛昔康半抗原或所述美洛昔康人工抗原的以下任一应用：

①在制备抗美洛昔康抗体中的应用；

②在检测抗美洛昔康抗体中的应用。

第六方面，本发明提供由所述美洛昔康人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。

所述多克隆抗体可通过美洛昔康人工抗原免疫实验动物(如新西兰大白兔、小鼠等)，收集血清纯化获得。

第七方面，本发明提供由所述抗体制备的美洛昔康检测试剂或试剂盒。

第八方面，本发明提供所述抗体的以下任一应用：

(1)在检测美洛昔康中的应用；

(2)在制备美洛昔康的检测试剂或试剂盒中的应用；

(3)在制备美洛昔康的免疫层析试纸条中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次公开了3种美洛昔康半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述美洛昔康人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的美洛昔康半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的美洛昔康检测方法提供了新手段。

利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备美洛昔康抗体(多抗)，制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度可达0.29ng/mL，实用价值高，本发明在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中式Ⅰ所示美洛昔康半抗原的核磁谱图。

图2为本发明实施例1中式Ⅱ所示美洛昔康半抗原的核磁谱图。

图3为本发明实施例1中式Ⅲ所示美洛昔康半抗原的核磁谱图。

图4为本发明实施例2中MLX-1-BSA的MALDI-TOF-MS谱图。

图5为本发明实施例2中MLX-2-BSA的MALDI-TOF-MS谱图。

图6为本发明实施例2中MLX-3-BSA的MALDI-TOF-MS谱图。

图7为本发明实施例3中MLX-1-KLH制备的多克隆抗体检测美洛昔康的标准曲线图。

图8为本发明实施例3中MLX-2-KLH制备的多克隆抗体检测美洛昔康的标准曲线图。

图9为本发明实施例3中MLX-3-KLH制备的多克隆抗体检测美洛昔康的标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液(简称PBS)均为pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液，所用碳酸盐缓冲液(简称CB)均为pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA，血蓝蛋白简称KLH。

DMF：N,N-二甲基甲酰胺。

EDC·HCL：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐。

NHS：N-羟基丁二酰亚胺。

TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

实施例1美洛昔康半抗原的制备和表征

一、美洛昔康半抗原的制备

1、式Ⅰ所示美洛昔康半抗原的制备

(1)化合物A的制备

称取14.4g 2-氨基噻唑-5-甲酸于10mL无水乙醇中，加入5％浓硫酸，50℃反应过夜，冷却至室温后倒入100mL饱和碳酸钠水溶液中，加乙酸乙酯提取，旋干，得化合物A。

(2)化合物C的制备

将化合物A和27g磺酰胺甲基物(化合物B)加入10mL二甲苯中，70℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得化合物C。

(3)化合物D的制备

将化合物C溶于50mL四氢呋喃中，滴加0.5mL 1M氢氧化钠溶液，50℃反应2h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出固体物质D，即为式Ⅰ所示美洛昔康半抗原。

2、式Ⅱ所示美洛昔康半抗原的制备

半抗原合成路线如下：

称取16.5g对氨基苯丙酸和27g磺酰胺甲基物(化合物B)加入到10mL二甲苯中，70℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得化合物E，即为式Ⅱ所示美洛昔康半抗原。

3、式Ⅲ所示美洛昔康半抗原的制备

(1)化合物F的制备

称取13.8g 6-氨基烟酸于10mL无水乙醇中，加入5％浓硫酸，50℃反应过夜，冷却至室温后倒入30mL饱和碳酸钠水溶液中，加乙酸乙酯提取，旋干，得化合物F。

(2)化合物G的制备

将化合物F和27g磺酰胺甲基物(化合物B)加入10mL二甲苯中，70℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得化合物G。

(3)化合物H的制备

将化合物G溶于50mL四氢呋喃中，滴加0.5mL 1M氢氧化钠溶液，50℃反应2h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出固体物质H，即为式Ⅲ所示美洛昔康半抗原。

二、美洛昔康半抗原的表征

1、式Ⅰ所示美洛昔康半抗原的核磁鉴定结果如下：1H NMR(400MHz,dmso)δ8.22(s,1H，ArH),8.02(d,J＝7.3Hz,1H，ArH),7.83(m,3H，ArH),2.83(s,3H,CH3).核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，核磁共振鉴定结果见图1。

2、式Ⅱ所示美洛昔康半抗原核磁鉴定结果如下：1H NMR(400MHz,dmso)δ10.22(s,NH,1H),8.01(d,J＝7.5Hz,ArH,1H),7.88(d,J＝9.3Hz,ArH,3H),7.60(d,J＝8.3Hz,ArH,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,ArH,2H),2.83(s,CH3,3H),2.79(t,J＝7.5Hz,CH2,2H),2.51(t,J＝7.5Hz,CH2,2H).核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，核磁共振鉴定结果见图2。

3、式Ⅲ所示美洛昔康半抗原核磁鉴定结果如下：¹H NMR(400MHz,dmso)δ8.88(s,ArH,1H),8.33(d,J＝6.8Hz,ArH,1H),8.11(d,J＝8.8Hz,ArH,1H),8.03(d,J＝7.6Hz,ArH,1H),7.87(t,J＝7.9Hz,ArH,3H),2.84(s,CH₃,3H).核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，核磁共振鉴定结果见图3。

实施例2美洛昔康人工抗原的制备和表征

一、美洛昔康包被原的制备和表征

在免疫原与包被原的制备方法中，其区别主要在于载体蛋白的使用类型，其中免疫原载体蛋白主要采用KLH，包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活泼酯法。

1、美洛昔康包被原的制备

(1)将19mg实施例1制备得到的式Ⅰ所示化合物溶于0.5mL DMF中，加入15mg EDC·HCL和8mg NHS，室温条件下搅拌反应10小时，得到溶液A。

(2)将20mg BSA溶于10mL PBS缓冲液中，得到溶液B。

(3)将溶液A逐滴加入到溶液B中，室温搅拌，过夜反应，得到反应产物即美洛昔康包被原。将反应产物在PBS中透析72小时，中间换6次水。透析后将反应产物分装于2mL离心管中，-20℃保存备用。式I所示化合物合成的美洛昔康包被原简称MLX-1-BSA。

(4)采用与上述步骤(1)～(3)同样的方法制备式Ⅱ所示化合物对应的美洛昔康包被原，简称MLX-2-BSA；采用与上述步骤(1)～(3)同样的方法制备式Ⅲ所示化合物对应的美洛昔康包被原，简称MLX-3-BSA。

2、美洛昔康包被原偶联比的确定

将上述合成的美洛昔康包被原用MALDI-TOF-MS鉴定，并计算偶联比。

对于MLX-1-BSA，BSA的分子量为66156.216，合成产物的分子量为68532.795，表明包被原合成成功，偶联比为(68532.795-66156.216)/381＝6，即平均每个BSA分子与6个美洛昔康半抗原偶联(图4)。

对于MLX-2-BSA，BSA的分子量为66156.216，合成产物的分子量为73082.057，表明包被原合成成功，偶联比为(73082.057-66156.216)/402＝17，即平均每个BSA分子与17个美洛昔康半抗原偶联(图5)。

对于MLX-3-BSA，BSA的分子量为66156.216，合成产物的分子量为70355.079，表明包被原合成成功，偶联比为(70355.079-66156.216)/381＝11，即平均每个BSA分子与11个美洛昔康半抗原偶联(图6)。

二、美洛昔康免疫原的制备

1、美洛昔康免疫原的制备

用KLH代替BSA，其它同上述美洛昔康包被原的制备。

式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物各自对应的美洛昔康免疫原分别简称MLX-1-KLH、MLX-2-KLH和MLX-3-KLH。

实施例3美洛昔康抗血清的制备

将实施例2制备的美洛昔康免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后免疫6-8周龄，体重为18-20g的雌性Balb/c小鼠，初次免疫使用弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)，加强免疫使用弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)。免疫方式为颈背部皮下多点注射，免疫剂量100μg/只，免疫间隔为4周，共免疫三次。每次免疫后第7天，尾静脉采血，4000rpm离心10min，收集上清液，即为抗血清，-20℃保存。

实施例4美洛昔康抗血清的鉴定

采用间接竞争ELISA方法，对实施例3得到的抗血清进行鉴定。具体操作步骤如下：

(1)包被：用CB液将美洛昔康包被原MLX-1-BSA稀释到1μg/mL，每孔100μL加至酶标板，37℃孵育2小时；

(2)洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，每次1min，在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1小时，洗涤；

(4)加样：每孔加入50μL PBS稀释的系列浓度的美洛昔康标准品和50μL工作浓度的抗血清，37℃孵育30min，洗涤；

(5)加二抗：每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，洗涤；

(6)显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB溶液，37℃避光显色15min；

(7)终止：每孔加入50μL浓度为2mol/L的H₂SO₄溶液终止反应；

(8)读数：用酶标仪读取各孔的OD_450nm值；

(9)建立标准曲线：以美洛昔康标准品浓度的对数值为横坐标，以各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准抑制曲线，并计算IC₅₀值。

三免后的抗血清鉴定结果如图7-图9所示，由标准曲线计算得到由MLX-1-KLH免疫原制备的美洛昔康抗血清的IC₅₀为1.00ng/mL，由MLX-2-KLH免疫原制备的美洛昔康抗血清的IC₅₀为1.39ng/mL，由MLX-3-KLH免疫原制备的美洛昔康抗血清的IC₅₀为0.29ng/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.美洛昔康半抗原，其特征在于，其结构如式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示：

2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，当所述半抗原为式Ⅰ所示化合物时，其制备方法包括如下步骤：

(3)将化合物C溶于30-70mL四氢呋喃中，滴加0.3-0.7mL 1M氢氧化钠溶液，40-60℃反应1-3h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出的固体物质即为式Ⅰ所示化合物；

其中，化合物A、磺酰胺甲基物和化合物C的结构分别如下：

3.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，当所述半抗原为式Ⅱ所示化合物时，其制备方法包括：称取10-20g对氨基苯丙酸和20-40g磺酰胺甲基物加入到10mL二甲苯中，60-80℃回流反应24h，冷却至室温后倒入20mL石油醚中，抽滤，得到固体物质即为式Ⅱ所示化合物；

其中，磺酰胺甲基物的结构同权利要求2中所述。

4.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，当所述半抗原为式Ⅲ所示化合物时，其制备方法包括如下步骤：

(3)将化合物G溶于50mL四氢呋喃中，滴加0.5mL 1M氢氧化钠溶液，50℃反应2h，浓缩除去四氢呋喃，加入20mL水，用1M盐酸调pH至3-4，析出的固体物质即为式Ⅲ所示化合物；

其中，磺酰胺甲基物的结构同权利要求2中所述，化合物F和G的结构分别如下：

5.美洛昔康人工抗原，其特征在于，其是将权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后得到的；

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；优选牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。

6.权利要求5所述人工抗原的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的半抗原与载体蛋白通过酰胺键偶联得到的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用活泼酯法将所述半抗原连接到所述载体蛋白的氨基上。

8.权利要求1所述半抗原或权利要求5所述人工抗原的以下任一应用：

①在制备抗美洛昔康抗体中的应用；

②在检测抗美洛昔康抗体中的应用。

9.由权利要求4所述人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。

10.权利要求9所述抗体的以下任一应用：

(1)在检测美洛昔康中的应用；

(2)在制备美洛昔康的检测试剂或试剂盒中的应用；

(3)在制备美洛昔康的免疫层析试纸条中的应用。