CN114306737A - 一种丝素蛋白基多孔微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白基多孔微球及其制备方法，该方法包括：利用微流控装置在不同的管道中分别通入水相和油相，水相和油相在管道交叉处汇合，油相剪切水相使水相在油相中分散形成微球，得到W/O乳液，其中，水相包括丝素蛋白溶液、添加剂和表面活性剂；将W/O乳液静置6h～24h凝胶化，洗脱油相，收集微球，微球经预冻和冻干，得到丝素蛋白基多孔微球。由此制得的微球能注射入人体内，稳定、安全无毒，并且孔径可调控。

Description

一种丝素蛋白基多孔微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白基多孔微球及其制备方法。

背景技术

微创干细胞注射是将干细胞直接导入受损组织，从而使其靶向富集、增殖和分化，并加速组织修复和再生。与常规手术相比，干细胞注射的优点是实施简单，侵入性小，不良反应少，疼痛耐受性好且不受空间限制，这使得高效注射成为可能。然而，在注射过程中流体的剪切应力会损害干细胞活力，并且由于缺乏粘附力而迅速分散。因此，相关技术中通过将细胞加载到可注射的微球支架中来实现，载有细胞的微球材料可以直接注射到受伤区域，以促进组织修复。微球支架的主要优点是生产速度快和尺寸可控性，并且封装的干细胞受到载体保护，可避免注射过程中引起机械损伤和免疫排斥反应，微球支架的渗透性有利于细胞代谢物和局部微环境之间进行交换。

对于微球支架，中国发明专利申请CN 111249524 A公开了一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法，其聚己内酯(PCL)是一种人工高分子合成材料，难以形成理想的材料—细胞界面，影响细胞在材料的黏附、增殖、分化，同时材料的机械强度和降解速度之间的矛盾还无法解决，且材料在体内仍有一定的抗原性；再者，其制备过程中涉及到有机溶剂，有一定潜在的生物毒性。CN 111333898 A公开了一种高度多孔明胶微球的制备方法，其以EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)与明胶微球冷冻交联形成具有优良生物相容性的高度多孔明胶微球，孔径尺寸在10～40μm之间，但由于明胶易溶解/溶胀导致结构稳定性差，在三维动态细胞培养中，微载体结构不稳定，甚至破碎，造成细胞黏附性变差。CN 111269444 A公开了一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，其涉及有机交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉基)乙磺酸，有潜在的生物毒性，且所得的微球尺寸不可控，缺乏良好的单分散性。CN 108553690 A公开了一种掺锶的多孔丝素微球的制备方法，通过形成冰晶结合冷冻干燥技术制备掺锶丝素蛋白基多孔微球，孔径为5～40μm，但因其技术存在一定的局限性，难以制备获得具有较大孔径的微球。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种丝素蛋白基多孔微球及其制备方法。该方法制得的微球能注射入人体内，稳定、安全无毒，并且孔径可调控。

为了实现上述目的，本发明的实施例在第一方面提出了一种丝素蛋白基多孔微球的制备方法，其包括以下步骤：

(1)利用微流控装置在不同的管道中分别通入水相和油相，水相和油相在管道交叉处汇合，油相剪切水相使水相在油相中分散形成微球，得到W/O乳液，其中，所述水相包括丝素蛋白溶液、添加剂和表面活性剂；

(2)将所述W/O乳液静置6h～24h凝胶化，洗脱油相，收集微球，微球经预冻和冻干，得到丝素蛋白基多孔微球。

根据本发明实施例的一种丝素蛋白基多孔微球的制备方法，该方法采用丝素蛋白制备微球多孔支架，可保持丝素蛋白的优异特性，并且通过微流控装置制备蛋白微球，可在微米级尺度上进行操控，使得所制备得到的微球尺寸均一可调控，整体制备过程反应温和，操作便捷，成本低，可大规模生产，产物微球具有生物安全性。

可选地，在步骤(1)中，所述添加剂为牛血清白蛋白、羊毛角蛋白、氯化钙中的一种或多种；所述表面活性剂为嵌段式聚醚F-127溶液。其中，F-127是一种非离子型表面活性剂(平均分子量约12.6kDa)，能够融合蛋白质，并在生理环境中促进蛋白的缓慢溶解，缓慢释放出干细胞或药物。

可选地，在步骤(1)中，所述油相包括油酸、乙醇和聚甘油蓖麻醇酯。其中，聚甘油蓖麻醇酯在油相中的质量分数为5wt％-10wt％；聚甘油蓖麻醇酯易溶于油酸和乙醇，不溶于水，易于融合油相并剪切水相，使水相形成规则的小球。

可选地，在步骤(1)中，所述油相包括豆油和聚甘油蓖麻醇酯。其中，聚甘油蓖麻醇酯在油相中的质量分数为5wt％-10wt％；聚甘油蓖麻醇酯易溶于油酸和乙醇，不溶于水，易于融合油相并剪切水相，使水相形成规则的小球。

可选地，在步骤(1)中，所述丝素蛋白溶液的质量分数为1wt％～10wt％，所述添加剂的质量分数为0.3wt％～7wt％，所述表面活性剂的质量分数为1wt％～5wt％；所述丝素蛋白溶液、所述添加剂和所述表面活性剂的混合体积比为(20～100)：10：(1～5)。

可选地，在步骤(1)中，所述油相的流速为10μL/h～300mL/h，所述水相的流速为100μL/h～800μL/h。当保持油相流速不变，随着水相流速的增快，微球直径会增大。当保持水相流速不变，随着油相流速的增快，微球直径减小。例如，控制油相的速为10mL/h，控制水相的流速为800μL/h，制备出微球直径为500μm。当保持水相的流速为500μL/h不变，通过控制油相的流速为10mL/h～300mL/h，制备出微球直径随油相流速的增快而持续减小。

可选地，在步骤(2)中，所述预冻为在-30℃～-20℃下速冻0.5h～3h。由此，可实现冰晶的形成。

可选地，在步骤(2)中，所述冻干为在-10℃～-5℃中冻存12h～96h，再经冷冻干燥得到丝素蛋白基多孔微球。由此，可促进微球内部冰晶的缓慢生长。再者，通过调节冻干曲线，可使获得的丝素蛋白微球多孔具有较大范围的可调控的内外孔径和孔隙率。

本发明的实施例在第二方面提供了一种丝素蛋白基多孔微球，其是由上述的丝素蛋白基多孔微球的制备方法制得。

根据本发明试试的丝素蛋白基多孔微球，其微球直径可以控制为25μm～500μm，微球上的孔径大小为可调的2μm～75μm，微球能注射入人体内，稳定、安全无毒。

本发明的实施例在第三方面提供了上述丝素蛋白基多孔微球的用途，其用于体外3D细胞培养或药物缓释支架。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的微流控装置中的液滴微流控芯片的工作原理图；

图2为根据本发明实施例的控制水相流速在500μL/h时，微球尺寸随油相流速的变化曲线图；

图3为根据本发明实施例的丝素蛋白乳液在油相中分散的光学显微图像图；

图4为根据本发明实施例的丝素蛋白微球在水中分散的光学显微图像；

图5为根据本发明实施例的具有不同孔径的牛血清白蛋白/丝素蛋白微球的扫描电镜图像；

图6为根据本发明实施例的具有不同孔径的牛血清白蛋白/丝素蛋白微球的扫描电镜图像；

图7为根据本发明实施例的具有不同孔径的牛血清白蛋白/丝素蛋白微球的扫描电镜图像；

图8为根据本发明实施例的羊毛角蛋白/丝素蛋白微球的扫描电镜图像；

图9为根据本发明实施例的氯化钙/丝素蛋白微球的扫描电镜图像；

图10为根据本发明实施例的明胶/丝素蛋白微球体外生物相容性荧光显微图像；

图11为根据本发明实施例的明胶/丝素蛋白微球体小鼠静脉注射给药7天后不同器官的组织病理切片图像(HE染色，200倍放大)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，微流控装置涉及到的液滴微流控芯片，其工作原理如图1。该液滴微流控芯片由含尖端(孔径10μm～800μm)圆形毛细管、方形毛细管，承接端圆形毛细管多级嵌套构成，经由聚四氟乙烯软管连接，通过改变分散相与连续相的流速，来制备不同尺寸的微球。其中，分散相为液相，连续相为油相。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

将蚕茧剪碎、脱胶、溶解，经过过滤、透析后，通过稀释，获得丝素蛋白溶液。

水相：分别选用1wt％～10wt％的丝素蛋白溶液、0.3wt％～7wt％的牛血清白蛋白溶液(具体参数见表1)，并加入2wt％的表面活性剂F-127(嵌段式聚醚)，混合后作为水相(也可称为分散相)。在水相中，丝素蛋白溶液、牛血清白蛋白溶液和F-127的混合体积比为50：10：3。

油相：将油酸、乙醇、聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)放入四维搅拌器混合均匀，混合后作为油相，油相在实验中起剪切水相的作用，又称为剪切相、连续相。在该油相中，油酸、乙醇、PGPR的质量比为5:4:1。

用注射泵将水相和油相以一定流速注入到微流控装置中，其中水相的流速控制在500μL/h，油相流速分别取10、20、40、60、80、100、200、300mL/h，形成W/O乳液，乳液中微球的尺寸随油相流速的变化关系如图2所示。待剪切形成稳定的液滴后，旋转载有凝固浴(即油相成分)的培养皿以承接W/O乳液，如图3所示。静置12h以使W/O乳液凝胶化，再用乙醇清洗除去微球表面的油相，后用去离子水洗涤干净，得到了丝素蛋白基微球在水中分散的微球悬液，该微球悬液的光学显微图如图4所示。

将上述获得的微球悬液在-30℃～-20℃下速冻0.5h～1.5h实现微球表面冰晶的形成，将预冻后的微球在-10℃～-5℃中冻存12h～96h以促进微球内部冰晶的缓慢生长，再经冷冻干燥机处理得到丝素蛋白基多孔微球。其中，冷冻干燥机可以设置为低压5pa～200pa、低温加热30℃左右进行。

本实施例得到的丝素蛋白基多孔微球的扫描电镜图，如表1中样品2(图5)、样品6(图6)、样品8(图7)和样品11(图8)所示，根据调节丝素蛋白浓度，牛血清白蛋白浓度，以及预冻参数曲线，获得的微球孔径在2μm～40μm，本实施例所得微球孔径与丝素蛋白浓度、牛血清白蛋白浓度、预冻曲线的对应关系如表1所示。

表1：

实施例2

将蚕茧剪碎、脱胶、溶解，经过过滤、透析后，通过稀释，获得丝素蛋白溶液。

水相：分别选用1wt％～5wt％的丝素蛋白溶液、0.3wt％～3.5wt％的羊毛角蛋白(具体参数见表2)，并加入5wt％的表面活性剂F-127(嵌段式聚醚)，混合后作为水相(也可称为分散相)。在水相中，丝素蛋白溶液、羊毛角蛋白和F-127的混合体积比为100：10：1。

油相：将豆油、聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)放入四维搅拌器混合均匀，混合后作为油相，油相在实验中起剪切水相的作用，又称为剪切相、连续相。在该油相中，豆油、PGPR的质量比为9:1。

用注射泵将水相和油相以一定流速注入到微流控装置中，其中水相的流速控制在500μL/h，油相流速分别取10、20、40、60、80、100、200、300mL/h，形成W/O乳液。待剪切形成稳定的液滴后，旋转载有凝固浴(即油相成分)的培养皿以承接W/O乳液。静置12h以使W/O乳液凝胶化，再用乙醇清洗除去微球表面的油相，后用去离子水洗涤干净，得到了丝素蛋白基微球在水中分散的微球悬液。

将上述获得的微球悬液在-25℃下速冻1h～3h实现微球表面冰晶的形成，将预冻后的微球在-5℃中冻存48h～96h以促进微球内部冰晶的缓慢生长，再经冷冻干燥机处理得到丝素蛋白基多孔微球。其中，冷冻干燥机可以设置为低压5pa～200pa、低温加热30℃左右进行。

本实施例得到的丝素蛋白基多孔微球的扫描电镜图，如表2样品7(图9)所示，根据调节丝素蛋白浓度，羊毛角蛋白浓度，以及预冻参数曲线，获得的微球孔径在25μm～75μm，本实施例所得微球孔径与丝素蛋白浓度、羊毛角蛋白浓度、预冻曲线的对应关系如表2所示。

表2：

实施例3

将蚕茧剪碎、脱胶、溶解，经过过滤、透析后，通过稀释，获得丝素蛋白溶液。

水相：分别选用5wt％的丝素蛋白溶液、3.5wt％的羊毛角蛋白，并加入3wt％的表面活性剂F-127(嵌段式聚醚)，混合后作为水相(也可称为分散相)。在水相中，丝素蛋白溶液、羊毛角蛋白和F-127的混合体积比为100：10：1。

油相：将豆油、聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)放入四维搅拌器混合均匀，混合后作为油相，油相在实验中起剪切水相的作用，又称为剪切相、连续相。在该油相中，豆油、PGPR的质量比为9:0.8。

用注射泵将水相和油相以一定流速注入到微流控装置中，其中水相的流速控制在500μL/h，油相流速分别取10、20、40、60、80、100、200、300mL/h，形成W/O乳液。待剪切形成稳定的液滴后，旋转载有凝固浴(即油相成分)的培养皿以承接W/O乳液。静置12h以使W/O乳液凝胶化，再用乙醇清洗除去微球表面的油相，后用去离子水洗涤干净，得到了丝素蛋白基微球在水中分散的微球悬液。

将上述获得的微球悬液在-25℃下速冻2.5h实现微球表面冰晶的形成，将预冻后的微球在-5℃中冻存96h以促进微球内部冰晶的缓慢生长，再经冷冻干燥机处理得到丝素蛋白基多孔微球。其中，冷冻干燥机可以设置为低压5pa～200pa、低温加热30℃左右进行。

本实施例得到的丝素蛋白基多孔微球的孔径为40μm，其与细胞共培养1、3、5天的荧光显微镜图像如图10所示，细胞在材料周围有明显的黏附聚集行为，体现出良好的生物相容性。本实施例得到的丝素蛋白基多孔微球，小鼠静脉给药7天后小鼠主要脏器组织病理切片分析如图11所示，采用磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照，未发现器官有明显病理改变，说明丝素小球静脉给药后小鼠体内生物安全性良好。

综上，根据本发明的实施例的方法，采用丝素蛋白作为微球多孔支架，可保持丝素蛋白的优异特性，并且通过微流控装置制备蛋白微球，可在微米级尺度上进行操控，使得所制备得到的微球尺寸均一可调控，整体制备过程反应温和，操作便捷，成本低，可大规模生产，产物微球具有生物安全性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种丝素蛋白基多孔微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用微流控装置在不同的管道中分别通入水相和油相，水相和油相在管道交叉处汇合，油相剪切水相使水相在油相中分散形成微球，得到W/O乳液，其中，所述水相包括丝素蛋白溶液、添加剂和表面活性剂；

(2)将所述W/O乳液静置6h～24h凝胶化，洗脱油相，收集微球，微球经预冻和冻干，得到丝素蛋白基多孔微球。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述添加剂为牛血清白蛋白、羊毛角蛋白、氯化钙中的一种或多种；所述表面活性剂为嵌段式聚醚F-127溶液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述油相组成为油酸、乙醇和聚甘油蓖麻醇酯的混合液，或者为豆油和聚甘油蓖麻醇酯的混合液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述丝素蛋白溶液的质量分数为1wt％～10wt％，所述添加剂的质量分数为0.3wt％～7wt％，所述表面活性剂的质量分数为1wt％～5wt％；所述丝素蛋白溶液、所述添加剂和所述表面活性剂的混合体积比为(20～100)：10：(1～5)。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述油相的流速为10μL/h～300mL/h，所述水相的流速为100μL/h～800μL/h。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述预冻为在-30℃～-20℃下速冻0.5h～3h。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述冻干为在-10℃～-5℃中冻存12h～96h，再经冷冻干燥得到丝素蛋白基多孔微球。

8.一种丝素蛋白基多孔微球，其特征在于，由权利要求1-7中任一项所述的丝素蛋白基多孔微球的制备方法制得。

9.如权利要求8所述的丝素蛋白基多孔微球的用途，其特征在于，用于体外3D细胞培养或药物缓释支架。

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