CN114306275B - 一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子及其制备方法和应用，该复合纳米粒子包括豌豆肽和负载在所述豌豆肽上的大豆异黄酮，且其粒径为130‑395nm；其制备方法包括：将大豆异黄酮乙醇溶液缓慢滴加到豌豆肽水溶液中得到豌豆肽‑大豆异黄酮分散液，随后调节其pH小于7.0，置于40‑50℃的水浴中搅拌自组装，最后通过40‑45℃旋蒸除去乙醇后即得。本发明的产品的包封率和荷载率高，表明豌豆肽具备对大豆异黄酮较高的负载能力，是一种良好的大豆异黄酮纳米载体，其产品粒径小，性质稳定，表明可以制备出高稳定性的豌豆肽‑大豆异黄酮复合纳米粒子；制备工艺简便高效，成本低廉，易于实现工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品生产工艺技术领域，更具体地，涉及一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
大豆异黄酮是大豆生长过程中产生的一类次级代谢物，因在大豆中含量极低且提取困难，故有“植物软黄金”之称。研究表明，大豆异黄酮具有清除自由基、抗氧化和抗肿瘤等多种生理活性，在预防心脑血管疾病和延缓衰老等方面具有重要意义；然而，大豆异黄酮难溶于水，且在光、热、氧存在时易发生降解，导致其生物利用率低，严重影响了人体的吸收与利用，极大限制了其在食品领域的应用。
纳米载体具有提高难溶性生物活性分子的溶解度、保护其免受外部环境破坏和延长在血液的循环时间等功能，可以有效提高生物活性分子的效用和生物利用率。常见的纳米载体有多糖纳米载体、脂质体纳米载体和蛋白质纳米载体；其中，蛋白质纳米载体具备良好的生物相容性、可降解性和低致敏性等优点，被公认为是递送难溶性生物活性分子的最有前途和最有效的纳米载体之一，与多糖和脂质体类纳米载体相比，蛋白质基纳米粒子的制备简单、负载能力高、粒径可控且稳定性好。
豌豆蛋白生物价为48-64％，功效比为0.6-1.2，致敏性较低；此外，豌豆蛋白含有多种人体必需氨基酸，其中赖氨酸含量为6.3g/100g，显著优于其他谷物蛋白，是一种优质的植物蛋白来源，但豌豆蛋白因含有大量疏水基团导致溶解度低，不利于制备纳米载体。豌豆肽是以豌豆蛋白为原料通过酶解精制而得的，不仅具有比原料蛋白更好的溶解度、乳化性和起泡性等理化性质，而且具备抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生理活性，与大豆异黄酮的生理功能具有协同作用。
制备纳米载体的常用方法有乳化法、喷雾干燥法和反溶剂法等。乳化法制备过程通常需要加入表面活性剂，会对人体肠道菌群的改变造成一定影响，从而引起肥胖和代谢综合症等隐患；喷雾干燥法制备的粒子粒径通常比其他方法的大，且设备复杂、投资较高和热消耗大。反溶剂法的原理是将正溶剂加入反溶剂中，使正溶剂极性或电荷改变从而引起分子间聚集或沉淀，可获得纳米级的粒子。反溶剂法的优势在于可以控制纳米粒子的形貌和尺寸，且方法简单，成本低廉，不需要昂贵的仪器设备，试剂无毒环保，适合工业化大规模生产。迄今为止，尚未见到有关反溶剂法将大豆异黄酮与豌豆肽纳米载体自组装以提高大豆异黄酮溶解度、稳定性和生物利用率的相关报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子，包括豌豆肽和负载在所述豌豆肽上的大豆异黄酮，且其粒径为130-395nm。
在上述技术方案中，所述豌豆肽与所述大豆异黄酮的质量比为7.5-20∶1。
在本发明的优选实施方式中，所述豌豆肽与所述大豆异黄酮的质量比为10-12.5∶1。
本发明另一方面还提供了上述豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法，包括：
将大豆异黄酮乙醇溶液缓慢滴加到豌豆肽水溶液中得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，随后调节其pH小于7.0，置于40-50℃的水浴中搅拌自组装得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子，最后通过40-45℃旋蒸除去乙醇，即得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
在上述技术方案中，所述大豆异黄酮乙醇溶液的制备方法如下：
在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1∶0.75-1.4的比例混合，搅拌至溶液透明均匀，即得。
在上述技术方案中，所述豌豆肽水溶液的制备方法如下：
将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1∶0.8-1.6的比例混合，搅拌至溶液透明均匀，即得。
进一步地，在上述技术方案中，所述大豆异黄酮乙醇溶液的浓度为0.75-1.4mg/mL。
进一步地，在上述技术方案中，所述豌豆肽水溶液的浓度为0.8-1.6mg/mL。
进一步地，在上述技术方案中，所述大豆异黄酮乙醇溶液的滴加速度为0.85-1.2mL/min。
再进一步地，在上述技术方案中，所述豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH调节为4.0-7.0。
再进一步地，在上述技术方案中，所述搅拌自组装的时间为30-60min。
本发明再一方面还提供了上述豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子或上述豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法在制备食品、药品、保健品和化妆品中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明利用豌豆肽具备两亲性和自组装的特性，可以通过疏水相互作用等非共价相互作用与大豆异黄酮结合，豌豆肽在反溶剂过程中将大豆异黄酮负载在其疏水区域，从而形成载体保护大豆异黄酮，达到提高大豆异黄酮溶解度、稳定性和生物利用率的目的；
(2)本发明利用豌豆肽兼具纳米载体和营养的功能，利用其具备一定的抗氧化和抗肿瘤活性，与大豆异黄酮的生理功能具有协同作用，采用反溶剂法使豌豆肽与大豆异黄酮进行自组装，反溶剂法相较于其他纳米粒子制备方法，工艺简便高效、成本低廉和不需要昂贵的仪器设备，易于实现工业化大规模生产，且制备过程耗能低、耗材无毒，对环境比较友好；
(3)本发明的产品的包封率和荷载率较高，表明豌豆肽具备对大豆异黄酮较高的负载能力，是一种良好的大豆异黄酮纳米载体，其产品粒径较小，性质稳定，表明可以制备出高稳定性的豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
附图说明
图1为本发明实施例制备豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的工艺流程图；
图2为大豆异黄酮、豌豆肽和实施例1所制备的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的FTIR图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例所用的大豆异黄酮为市售产品(生产厂家：南京春秋生物工程有限公司)。
本发明实施例所用的豌豆肽为市售产品(生产厂家：烟台双塔食品股份有限公司)。
实施例1
本发明实施例提供了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法，如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到豌豆肽水溶液；
S2、在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到大豆异黄酮乙醇溶液；
S3、使用注射泵在1mL/min的速度下，将2mL步骤S2中的大豆异黄酮乙醇溶液(1mg/mL)加入20mL步骤S1中的豌豆肽水溶液(1mg/mL)中，得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，使用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液调节豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH至4.0，在40℃水浴下搅拌60min使豌豆肽和大豆异黄酮充分自组装，得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子；
S4、豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子通过40℃旋蒸除去乙醇，定容，制得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
实施例2
本发明实施例提供了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到豌豆肽水溶液；
S2、在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到大豆异黄酮乙醇溶液；
S3、使用注射泵在1mL/min的速度下，将2mL步骤S2中的大豆异黄酮溶液(1mg/mL)加入20mL步骤S1中的豌豆肽溶液(1mg/mL)中，得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，使用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液调节豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH至5.0，在40℃水浴下搅拌60min使豌豆肽和大豆异黄酮充分自组装，得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子；
S4、豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子通过40℃旋蒸除去乙醇，定容，制得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
实施例3
本发明实施例提供了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到豌豆肽水溶液；
S2、在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到大豆异黄酮乙醇溶液；
S3、使用注射泵在1mL/min的速度下，将2mL步骤S2中的大豆异黄酮溶液(1mg/mL)加入20mL步骤S1中的豌豆肽溶液(1mg/mL)中，得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，使用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液调节豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH至6.0，在40℃水浴下搅拌60min使豌豆肽和大豆异黄酮充分自组装，得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子；
S4、豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子通过40℃旋蒸除去乙醇，定容，制得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
实施例4
本发明实施例提供了一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到豌豆肽水溶液；
S2、在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1mg/mL的比例混合，搅拌至溶液均匀透明，制备得到大豆异黄酮乙醇溶液；
S3、使用注射泵在1mL/min的速度下，将2mL步骤S2中的大豆异黄酮溶液(1mg/mL)加入20mL步骤S1中的豌豆肽溶液(1mg/mL)中，得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，使用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液调节豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH至7.0，在40℃水浴下搅拌60min使豌豆肽和大豆异黄酮充分自组装，得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子；
S4、豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子通过40℃旋蒸除去乙醇，定容，制得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
分别采用乙酸乙酯萃取法检测实施例1-4所制备的复合纳米粒子的包封率和荷载率，具体过程包括：
取1mL复合纳米粒子样品，加入5mL乙酸乙酯，涡旋30s后于3100×g下离心5min，以乙酸乙酯为空白对照，测定上清液在260nm处的吸光度值，根据黄酮标准曲线方程计算游离的黄酮含量，包封率(EE)和荷载率(LC)分别按下式计算：
EE(％)＝[1-游离黄酮含量(mg)/黄酮总含量(mg)]×100％；
LC(％)＝[黄酮总含量(mg)-游离黄酮含量(mg)]/总蛋白含量(mg)×100％。
实施例1-4所制备的复合纳米粒子的粒径、Zeta-电位和多分散系数采用粒度分析仪进行测定，具体过程包括：将样品稀释适当倍数后，使用激光粒度仪测定粒径、Zeta-电位和多分散系数，测定温度为25℃，平衡时间5min。
结果如下表1所示。
表1复合纳米粒子的包封率、荷载率、粒径、Zeta-电位和多分散系数的检测结果
从表1可以看出，复合纳米粒子的包封率和荷载率随pH的升高而逐渐降低，在pH＝4时，获得最大的包封率(71.64％)和荷载率(7.16％)。大豆异黄酮分子中含有酚羟基，在酸性条件下较为稳定，因此较低的pH环境可能有利于大豆异黄酮与豌豆肽结合，从而提高复合纳米粒子的包封率和荷载率。
如图2所示为大豆异黄酮、豌豆肽和实施例1所制备的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子的FTIR图谱。
从图2可以看出，3100-3500cm-1范围内的宽带归因于羟基的拉伸振动，大豆异黄酮在3230cm-1和3430cm-1处出现宽峰，豌豆肽(PP)在3440cm-1处出现宽峰，而豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子羟基峰移至3420cm-1处，表明氢键参与了豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子的形成；大豆异黄酮在1630cm-1、1520cm-1和1190cm-1处的特征峰分别归因于苯环的C＝C伸缩振动、C＝O伸缩振动和C-O-C拉伸振动，大豆异黄酮的上述特征峰在豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子中消失，且复合纳米粒子出现了豌豆肽中没有的特征峰(1250cm-1处)，表明大豆异黄酮和豌豆肽发生了相互作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
包括：
将大豆异黄酮乙醇溶液缓慢滴加到豌豆肽水溶液中得到豌豆肽-大豆异黄酮分散液，随后调节其pH小于7.0，置于40-50 ℃的水浴中搅拌自组装得到豌豆肽-大豆异黄酮粗复合纳米粒子，最后通过40-45 ℃旋蒸除去乙醇，即得豌豆肽-大豆异黄酮复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述大豆异黄酮乙醇溶液的制备方法如下：
在避光条件下，将大豆异黄酮与无水乙醇按料液比为1：0.75-1.4的比例混合，搅拌至溶液透明均匀，即得；
和/或，所述豌豆肽水溶液的制备方法如下：
将豌豆肽与蒸馏水按料液比为1：0.8-1.6的比例混合，搅拌至溶液透明均匀，即得。
3.权利要求1或2所述豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述大豆异黄酮乙醇溶液的浓度为0.75-1.4 mg/mL；
和/或，所述豌豆肽水溶液的浓度为0.8-1.6 mg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述大豆异黄酮乙醇溶液的滴加速度为0.85-1.2 mL/min。
5.根据权利要求1或2所述的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述豌豆肽-大豆异黄酮分散液的pH调节为4.0-7.0。
6.根据权利要求1所述的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法，其特征在于，
所述搅拌自组装的时间为30-60 min。
7.根据权利要求1所述的豌豆肽负载大豆异黄酮复合纳米粒子制备方法所制得的纳米粒子，其特征在于，
所述豌豆肽和负载在所述豌豆肽上的大豆异黄酮，且其粒径为130 -395 nm，所述豌豆肽与所述大豆异黄酮的质量比为7.5-20：1。
8.根据权利要求7所述的纳米粒子，其特征在于，
所述豌豆肽与所述大豆异黄酮的质量比为10- 12.5：1。
9.权利要求7-8任一项所述的纳米粒子在制备食品、药品、保健品和化妆品中的应用。
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