CN114304688A

CN114304688A - 玉米醇溶蛋白包被剂、利用该包被剂进行包被的益生菌制剂及其制备方法

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Publication number: CN114304688A
Application number: CN202111413856.8A
Authority: CN
Inventors: 张晓琳; 邹球龙; 张忠鑫; 仉磊; 刘晓萌; 印铁; 姜德铭
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114304688B

Abstract

本发明涉及一种利用玉米醇溶蛋白为主要保护材料包被的益生菌制剂及其制备方法，特别是针对食品用益生菌或饲料添加剂用益生菌的玉米醇溶蛋白包被剂、利用该包被剂进行包被的益生菌制剂及其制备方法。本发明的益生菌制剂通过采用玉米醇溶蛋白包被剂进行包被，显著提高了益生菌在逆性环境(特别是高温高湿逆性环境)中的存活率。

Description

玉米醇溶蛋白包被剂、利用该包被剂进行包被的益生菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于玉米蛋白加工及应用领域，具体而言，涉及一种利用玉米醇溶蛋白为主要保护材料包被的益生菌制剂及其制备方法，特别是针对食品用益生菌或饲料添加剂用益生菌的玉米醇溶蛋白包被剂、利用该包被剂进行包被的益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

人体和动物的肠道微生态环境寄居着种类繁多、数量惊人的菌群，如人体肠道中栖居的细菌约有10¹³～10¹⁴个，约为人体细胞总数的1.3倍。它们中的大多数参与宿主的营养利用、抗感染、免疫系统成熟和代谢等过程。目前，干预肠道微生态的有效手段之一为摄入益生菌。

益生菌是具有一定数量且对宿主健康有益的活体微生物。由于其产品需要以“活体”形式存在，一般采用使菌体本身与溶剂、载体、保护剂等形成相对稳定的益生菌制剂的方式来提供保护作用。然而，在对抗生产、加工、储存、运输和使用过程中的逆性因素(尤其是对抗高温高湿环境)时，现有益生菌制剂很难保持其原有活菌数，极易失活。因此，改进益生菌制剂的制备方法和研发新的制剂材料是亟需解决的问题。

玉米醇溶蛋白是玉米中主要的贮藏蛋白质，含有大量的疏水性氨基酸，不能溶于水，能溶于醇、丙酮水溶液和醋酸。这种廉价的蛋白分子结构中亲水部分和疏水部分分区明显，具有独特的自组装特性、成膜性、凝胶性，良好的生物兼容性和生物粘附性等，因此在各种活性物质以及药物输送载体系统、可食性材料等制备方面具有天然优势。特别地，玉米醇溶蛋白原料丰富，价格可控，国内玉米产量超过2亿吨以上，作为玉米加工业的副产品，其产出量大、价格低廉。另一方面，玉米醇溶蛋白平均分子量大，易于通过简单手段形成薄膜，隔氧、隔湿、隔水蒸气，且具有良好的弹性、柔韧性等机械性能。

目前，玉米醇溶蛋白已被用于保健食品及医药制剂辅料加工技术领域等，主要用于包埋各种目标活性成分。例如，CN104758315A公开了一种利用玉米醇溶蛋白包裹鱼油的方法，包括如下步骤：S1、将玉米醇溶蛋白溶解于乙醇水溶液中，搅拌至溶液均匀透明，从而制成玉米醇溶蛋白溶液；S2、将鱼油溶解于乙醇水溶液中，搅拌至溶液均匀透明，从而制成鱼油溶液；S3、将所述玉米醇溶蛋白溶液与所述鱼油溶液混合；S4、对所述玉米醇溶蛋白溶液与所述鱼油溶液的混合溶液进行干燥，得到用玉米醇溶蛋白以微球形状包裹鱼油而形成核壳结构的玉米醇溶蛋白-鱼油粉末。又例如，CN107595809A公开了一种玉米醇溶蛋白纳米包埋缓释填充物及其制备方法，所述玉米醇溶蛋白纳米包埋缓释填充物包含：玉米醇溶蛋白5～15份、抗肿瘤药物2～10份。所述制备方法包括取玉米醇溶蛋白加入乙醇水溶液中并搅拌至溶液均匀透明；取抗肿瘤药物加入乙醇水溶液或水中并搅拌至溶液均匀透明；将抗肿瘤药物乙醇水溶液或抗肿瘤药物水溶液与玉米醇溶蛋白溶液混合；将玉米醇溶蛋白纳米包埋混合液经冷冻干燥或喷雾干燥，得到玉米醇溶蛋白纳米包埋缓释填充物。再例如，CN111317135A公开了一种多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米粒子包埋缓释姜黄素的方法，其包括以下步骤：(1)称取玉米醇溶蛋白粉末溶于乙醇水溶液，配制成10-30mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液；称取多酚溶于乙醇水溶液，配制成2-6mg/mL的多酚溶液；(2)用碱液分别将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液的pH调至9.0±0.1；(3)将调好PH值的玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液混合，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；然后将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，除去游离多酚；(4)称取姜黄素适量，将其加入到步骤(3)得到的混合溶液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1～5；(5)在磁力搅拌下，使用注射器将步骤(4)得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1.0～4.0mg/mL，搅拌形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

然而，迄今为止，对玉米醇溶蛋白保护作用的研究还主要局限于化学制剂或医药制剂等(例如鱼油、DHA、白芦藜醇、姜黄素、抗肿瘤药物等)，对于生物制剂、特别是需要以“活体”形式存在的微生物(例如益生菌)而言，尚未有相关的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明人等进行了深入研究，首次采用玉米醇溶蛋白对益生菌进行包被，发现通过精心选择的玉米醇溶蛋白包被剂配方及制备工艺所得到的益生菌制剂对抗高温高湿的逆性环境效果显著，从生产源头提高了活菌存活率，还发现玉米醇溶蛋白包被剂中特有的青稞提取物的添加进一步增强了对益生菌的保护，由此完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了一种玉米醇溶蛋白包被剂(下文有时也称为“本发明的玉米醇溶蛋白包被剂”)，所述玉米醇溶蛋白包被剂包含：玉米醇溶蛋白0.25～2.5％(w/w)；甘油0.25～1.25％(w/w)；海藻酸钠50～90％(w/w)；氯化钙2.5～12.5％(w/w)；大豆乳清粉0.25～2.5％(w/w)；青稞提取物0.25～2.5％(w/w)。

在第二方面，本发明提供了一种利用本发明的玉米醇溶蛋白包被剂对益生菌进行包被来制备益生菌制剂的方法(下文有时也称为“本发明的制备益生菌制剂的方法”)，所述方法包括：

(1)向益生菌菌泥中加入甘油、大豆乳清粉、青稞提取物，与海藻酸钠溶液混合均匀，形成a液；优选地，向益生菌菌泥中依次加入甘油、大豆乳清粉、青稞提取物；

(2)将玉米醇溶蛋白溶于50～65％(v/v)乙醇中，形成b液；

(3)将b液加入氯化钙溶液，形成c液；

(4)将a液喷入c液中，搅拌超声、微囊化、干燥，

从而得到利用玉米醇溶蛋白包被剂进行包被的益生菌制剂，

其中，所述玉米醇溶蛋白包被剂包含：玉米醇溶蛋白0.25～2.5％(w/w)；甘油0.25～1.25％(w/w)；海藻酸钠50～90％(w/w)；氯化钙2.5～12.5％(w/w)；大豆乳清粉0.25～2.5％(w/w)；青稞提取物0.25～2.5％(w/w)，

其中，所述益生菌制剂中包含益生菌2.5～12.5％(w/w)。

在第三方面，本发明提供了一种通过本发明的制备益生菌制剂的方法得到的益生菌制剂(下文有时也称为“本发明的益生菌制剂”)。

有益效果

(1)本发明的玉米醇溶蛋白包被剂对食品用益生菌或饲料添加剂用益生菌具有通用性和包被保护效力；本发明的制备益生菌制剂的方法的工艺和操作简单，成本低廉，适用于工业化生产。

(2)针对生产过程中对抗高温高湿的问题，本发明的益生菌制剂通过采用含有玉米醇溶蛋白为主要有效成分的包被剂，显著提高了益生菌在逆性环境(特别是高温高湿逆性环境)中的存活率。

(3)如实施例所示，本发明的益生菌制剂有效提高了模拟肠液中的存活率，并能在动物中有效降低腹泻率，显著提高动物的肠道健康性能。

具体实施方式

在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些实施方式中，所述玉米醇溶蛋白可为本领域技术人员可常规获得的任何玉米醇溶蛋白或其加工形式。

在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些实施方式中，相对于玉米醇溶蛋白包被剂的总量，包含玉米醇溶蛋白0.25～2.5％(w/w)，优选包含玉米醇溶蛋白0.5～2.5％(w/w)，更优选包含玉米醇溶蛋白1.0～2.5％(w/w)，进一步优选包含玉米醇溶蛋白1.4～2.4％(w/w)，特别优选包含玉米醇溶蛋白1.6～2.3％(w/w)。

在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些实施方式中，所述甘油、海藻酸钠、氯化钙、大豆乳清粉可由本领域技术人员常规获得。

在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些实施方式中，所述青稞提取物为青稞麸皮的水提取物。在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些优选实施方式中，所述青稞提取物的制备方法包括：将1～10g青稞麸皮用100～500g纯净水提取1～5次，每次20-30min；其间任选地辅助功率100～300W、温度40～80℃的超声10～60min，过滤，旋转蒸发，低温干燥。例如，超声以300W、温度50℃的条件进行30min，但本发明不限于此。

在本发明的玉米醇溶蛋白包被剂的一些实施方式中，相对于玉米醇溶蛋白包被剂的总量，包含青稞提取物0.25～2.5％(w/w)，优选包含青稞提取物0.3～2.0％(w/w)，更优选包含青稞提取物0.35～1.5％(w/w)，进一步优选包含青稞提取物0.45～0.8％(w/w)。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，所述益生菌为食品用益生菌或饲料添加剂用益生菌，但本发明不限于此。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，所述益生菌选自于以下益生菌中的一种或多种：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、布氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、清酒乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、嗜热链球菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、丁酸梭菌、肠膜明串珠菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌，但本发明不限于此。

上述益生菌均可以通过商业购买的方式获得。或者，也可以使用通过商业购买的方式获得的益生菌的改良菌株，但本发明不限于此。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些实施方式中，只要所得益生菌菌泥中含有所需量的活菌，可以通过本领域技术人员知晓的任何合适的方法获得所述益生菌菌泥，例如，可以通过对经过常规培养的含有所需量的益生菌的培养液进行离心来获得所述益生菌菌泥。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，所述益生菌菌泥中含有活菌数1.0×10¹⁰CFU/g以上，优选含有活菌数1.0×10¹¹CFU/g以上，更优选含有活菌数5.0×10¹¹CFU/g以上，进一步优选含有活菌数1.0×10¹²CFU/g以上，特别优选含有活菌数5.0×10¹²CFU/g以上；所述益生菌制剂中含有活菌数1.0×10¹⁰CFU/g以上，优选含有活菌数2.0×10¹⁰CFU/g以上，进一步优选含有活菌数3.0×10¹⁰CFU/g以上，特别优选含有活菌数5.0×10¹⁰CFU/g以上。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，所述益生菌菌泥的制备方法包括：将益生菌在无菌条件下活化并复壮，扩大培养，发酵，离心得到益生菌菌泥。就此而言，可根据益生菌的具体类型适当地选择对益生菌进行活化并复壮、扩大培养、发酵、离心的工艺和参数，这样的选择在本领域技术人员的能力范围内。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，活化时使用的活化培养基与发酵时使用的发酵培养基为MRS培养基或LB培养基，其中，所述MRS培养基包含：蛋白胨1％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)、牛肉浸膏1％(w/v)、无水乙酸钠0.5％(w/v)、酵母浸膏0.5％(w/v)、吐温80 0.1ml、磷酸氢二钾0.2％(w/v)、柠檬酸氢二铵0.2％(w/v)、七水合硫酸镁0.058％(w/v)、一水合硫酸锰0.025％(w/v)、水100ml，pH7.0±0.2，灭菌方法为湿热灭菌，115℃，30min；所述LB培养基包含胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化钠1％(w/v)、水100ml，pH7.0±0.2，灭菌方法为湿热灭菌，121℃，20min。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些优选实施方式中，向益生菌菌泥中依次加入甘油、大豆乳清粉、青稞提取物，与海藻酸钠溶液混合均匀，形成a液；将玉米醇溶蛋白溶于乙醇中，形成b液；将b液加入氯化钙溶液，形成c液；将a液喷入c液中。通过采用这样的添加顺序和工艺，所得到的益生菌制剂对抗高温高湿等逆性环境的效果更为显著，还能够进一步提高在动物肠道中的存活率。

在本发明的制备益生菌制剂的方法的一些特别优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

a.用MRS培养基或LB培养基作为种子培养基，在30～39℃有氧或微好氧条件下将目标益生菌培养8～16h，成为一级种子；

b.将步骤a所得的一级种子按1～8％接种量接入种子罐中扩大培养，在30～39℃有氧或微好氧条件下培养6～12h，成为二级种子；

c.将步骤b所得的二级种子按1～8％接种量接入发酵罐中进行发酵培养，在30～39℃有氧或微好氧条件下培养24～48h；

d.发酵过程完毕后，将发酵液用台式离心机4000～6000rpm或管式离心机8000～12000rpm离心得到菌泥，立即依次添加占玉米醇溶蛋白包被剂总量0.25～1.25％(w/w)的甘油、0.25～2.5％(w/w)的大豆乳清粉、0.25～2.5％(w/w)的青稞提取物、水(与菌泥比例为1:1～10:1)，充分溶解后加入占玉米醇溶蛋白包被剂总量50～90％(w/w)的海藻酸钠；分散搅匀，形成a液，备用；

e.将占玉米醇溶蛋白包被剂总量0.25～2.5％(w/w)的玉米醇溶蛋白加入到50～65％(v/v)乙醇溶液中，充分分散，形成b液，备用；

f.将占玉米醇溶蛋白包被剂总量2.5～12.5％(w/w)的氯化钙加入到水中，使其浓度为0.2～1％(w/v)；再将b液加入到氯化钙溶液中，高速搅拌，辅以300W超声，混合均匀且使乙醇浓度为0.5～15％(v/v)，形成c液，备用；

g.利用滴注或雾化喷头将a液以一定速率喷入c液，形成微胶囊，再过筛(例如100目筛)回收，20～45℃条件下旋流干燥，得到益生菌制剂成品。

在本发明的益生菌制剂的实施方式中，所述益生菌制剂形态结构稳定，在高温高湿环境中有效保护活菌。与不加保护剂的液态菌泥以及只加普通配方保护剂(如不加玉米醇溶蛋白、大豆乳清粉或青稞提取物的保护剂)的常规菌剂相比，本发明的益生菌制剂的高温高湿耐受力提高超过70％；在模拟肠液中的菌存活率高达90％以上。

在本发明的益生菌制剂的一些优选实施方式中，可将本发明的益生菌制剂应用于动物(包括但不限于鸡、猪)中，应用效果显著提高：

(1)改善仔鸡肠道健康，肠道中乳杆菌含量显著提高(P＜0.05)。

(2)改善仔猪腹泻状况，显著降低仔猪腹泻率达61.5％(P＜0.05)。

实施例

接下来通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。除非另有说明，实施例中的菌株和试剂均为商购获得。

在以下实施例中，如无特别说明，“普通配方”是指在制备菌剂样品时将菌泥与25倍重量的小麦麸皮均匀混合。

实施例1

(1)菌株：干酪乳杆菌(CGMCC 1.2435)

(2)培养方法：将干酪乳杆菌CGMCC 1.2435菌株在35℃、微好氧条件下、MRS培养基中培养8h，作为一级种子；一级种子液按5％接种量接入种子罐中扩大培养，在35℃、微好氧条件下、MRS培养基中培养6h，成为二级种子；按5％接种量接入发酵罐、使用MRS培养基进行发酵培养，在38℃、微好氧条件下培养24h。

(3)主要配方组成：50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物。

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用管式离心机10000rpm离心取菌泥150g，分成三份。其中一份加无菌水稀释20倍备用(样品一)，一份只加入小麦麸皮的普通配方组分制粒(样品二)，一份进行玉米醇溶蛋白包被制粒(样品三)。制粒、干燥后的最终制剂中的活菌数均在1.0×10¹⁰CFU/g以上(参见表1)。

(5)实验目的与方法：a.将3个样品置于85℃、90％湿度环境中5min，检测样品活菌数和存活率；b.将3个样品置于依照中国药典配制的模拟肠液(配方：取KH₂PO₄ 6.8g，加蒸馏水500mL溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000mL，每100mL溶液中加0.3g胆盐，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌)中2h，检测样品活菌数和存活率。

(6)实验结果如表1和表2所示。

表1玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对抗高温高湿的效果

表2玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂耐受模拟肠液的效果

(7)实验结论：a.高温高湿耐受实验表明：利用玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂(样品三)中有效活菌存活率显著高于不加任何辅料保护的菌液(样品一)和只加普通配方的制剂(样品二)，从低于1％大幅提升至超过70％；b.模拟肠液耐受实验表明：利用玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂中有效活菌存活率分别显著高于不加任何辅料保护的菌液、只加普通配方的制剂18.9％和19％，从70％左右大幅提升至超过90％。

实施例2：

(1)菌株：布氏乳杆菌(CGMCC 1.3114)。

(2)培养方法：将布氏乳杆菌CGMCC 1.3114菌株在37℃、微好氧条件下、MRS培养基中培养8h，作为一级种子；一级种子液按5％接种量接入种子罐中扩大培养，在37℃、微好氧条件下、MRS培养基中培养8h，成为二级种子；按8％接种量接入发酵罐、使用MRS培养基进行发酵培养，在38℃、微好氧条件下培养24h。

(3)主要配方组成：50g菌泥、20g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物。

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用台式离心机6000rpm离心取菌泥1000g，制粒(包被剂加量：1000g菌泥、400g玉米醇溶蛋白、100g食品级甘油、20kg海藻酸钠、2kg氯化钙、200g大豆乳清粉、120g青稞提取物)、干燥后保证活菌数在1.0×10¹⁰CFU/g以上。

(5)实验目的：对比只加普通配方的益生菌制剂与玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对肉仔鸡肠道健康的作用效果的差异。

(6)实验方法：

试验动物：艾拔益加(AA)公肉仔鸡20只；

试验期限：共计42d；

饲养管理：整个饲养期分为两个阶段：1-21d为前期，22-42d为后期。采用笼养(每个笼子就是一个重复)，整个试验期按常规进行免疫、消毒，全天24h光照，全期自由采食与饮水，自动控温控湿。育雏期前3d室温控制在33℃，以后每周下降3℃直至24℃恒温；湿度1-21d保持在65-70％，22-42d保持在60-65％；1-42d持续24h光照和通风。

分组设计：

将20只肉仔鸡随机分成2组，每组2个重复，每重复5只。

A组：(饲喂不加抗生素的基础日粮+只加普通配方益生菌制剂，益生菌含量为1.00×10¹⁰CFU/kg饲料)

B组：(饲喂不加抗生素的基础日粮+玉米醇溶蛋白包被益生菌制剂，益生菌含量为1.00×10¹⁰CFU/kg饲料)

(7)实验结果如表3所示。

肉仔鸡应用实验表明，与只加普通配方制剂的组别(A组)相比，玉米醇溶蛋白包被益生菌制剂组别(B组)中肉仔鸡肠道内乳杆菌数量显著增加，表明肠道功能更加健康。

表3玉米醇溶蛋白包被益生菌制剂对肉仔鸡肠道菌群的影响

注：同列数据肩标不同的字母表示显著性差异(P<0.05)。

实施例3：

(1)菌株：鼠李糖乳杆菌(CGMCC 1.2466)。

(2)培养方法：将鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2466菌株在37℃、微好氧条件下、MRS培养基中培养8h，作为一级种子；一级种子液按2％接种量接入种子罐中扩大培养，在37℃、微好氧条件下、LB培养基中培养8h，成为二级种子；按8％接种量接入发酵罐、使用LB培养基进行发酵培养，在37℃、微好氧条件下培养24h。

(3)主要配方组成：50g菌泥、25g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、8g青稞提取物。

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用高速管式离心机10000rpm离心取菌泥1000g，分成两份。其中一份只加入普通配方组分制粒(样品一)，另一份加入玉米醇溶蛋白包被剂制粒(包被剂加量：500g菌泥、250g玉米醇溶蛋白、50g食品级甘油、10kg海藻酸钠、1kg氯化钙、100g大豆乳清粉、80g青稞提取物)(样品二)。制粒、干燥后保证活菌数在1.0×10¹⁰CFU/g以上。

(5)实验目的：对比只加普通配方的益生菌制剂与玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对仔猪腹泻影响的差异。

(6)实验方法：

试验动物：断奶仔猪40头；

试验期限：试验自断奶后进行，试验期从35日龄检测至63日龄。

分组设计：

将断奶仔猪随机分成2组(样品一组和样品二组)，每组2个重复，每重复10只。

腹泻率＝腹泻仔猪头次/试验仔猪总头次

腹泻仔猪头次(从35日龄检测至63日龄)＝腹泻仔猪头次(第35日龄)+腹泻仔猪头次(第36日龄)+……+腹泻仔猪头次(第63日龄)

仔猪总头次(从35日龄检测至63日龄)＝仔猪头数(第35日龄)+仔猪头数(第36日龄)+……+仔猪头数(第63日龄)。

腹泻指数：腹泻指数反映了腹泻的严重程度，该指数越高，代表腹泻越严重。

腹泻指数＝粪便评分之和/试验仔猪总头数。评分标准见下表。

(7)实验结果如下表4和表5所示。

仔猪应用实验结果表明：与只加普通配方的制剂组别(样品一)相比，利用玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂组别(样品二)的仔猪腹泻率下降61.5％，腹泻指数下降53％。

表4腹泻状况评分标准

腹泻程度	粪便外观	评分
			正常	条形或粒状	0
轻度	软粪能成形	1
			中度	稠状，不成形，粪水无分离现象	2
严重	液状，不成形，粪水有分离现象，黏液便或浓便	3
			污染	猪的肛门及其周围有粪物挂样	4
红肿	猪的肛门红肿	5

表5仔猪腹泻率比较

处理	腹泻率，％	腹泻指数，％
			样品一	6.5<sup>b</sup>	1.735<sup>b</sup>
样品二	2.5<sup>a</sup>	0.815<sup>a</sup>

注：同列数据肩标不同的字母表示显著性差异(P<0.05)。

实施例4

(1)菌株：干酪乳杆菌(CGMCC 1.2435)

(3)主要配方组成：

a.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

b.50g菌泥、1.5g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

c.50g菌泥、50g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

d.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

e.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

f.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；

g.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、6g青稞提取物。

表6主要配方组成

配方

菌泥

玉米醇溶蛋白

食品级甘油

海藻酸钠

氯化钙

大豆乳清粉

青稞提取物

a

50g

23g

5g

1kg

100g

10g

6g

b

50g

1.5g

5g

1kg

100g

10g

6g

c

50g

5g

1kg

100g

10g

6g

d

50g

23g

-

1kg

100g

10g

6g

e

50g

23g

5g

-

100g

10g

6g

f

50g

23g

5g

1kg

-

10g

6g

g

50g

23g

5g

1kg

100g

-

6g

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用管式离心机10000rpm离心取菌泥350g，分成七份。其中样品一至样品七的配方依次为(3)中所示a～g。制粒、干燥后的最终制剂中的活菌数均在1.0×10¹⁰CFU/g以上(参见表7)。

(5)实验目的与方法：将7个样品置于85℃、90％湿度环境中5min，检测不同配方样品的活菌数和存活率。

(6)实验结果如表7所示。

表7玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对抗高温高湿的效果

(7)实验结论：高温高湿耐受实验表明：对比样品一至样品三可知，若配方中玉米醇溶蛋白不在0.25～2.5％(w/w)范围内，存活率会有不同程度的降低；对比样品一和样品四至样品七可知，若不添加甘油、海藻酸钠、氯化钙、大豆乳清粉中任一成分，存活率会大幅降低。

实施例5

(1)菌株：干酪乳杆菌(CGMCC 1.2435)

(3)主要配方组成：

a.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；(甘油、大豆乳清粉、青稞提取物依次添加)

b.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；(大豆乳清粉、甘油、青稞提取物依次添加)

c.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物；(青稞提取物、甘油、大豆乳清粉依次添加)

d.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉、6g青稞提取物。(青稞提取物、大豆乳清粉、甘油依次添加)

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用管式离心机10000rpm离心取菌泥200g，分成四份。其中样品一至样品四的配方和甘油、大豆乳清粉、青稞提取物等成分添加顺序依次为(3)中所示a～d。制粒、干燥后的最终制剂中的活菌数均在1.0×10¹⁰CFU/g以上(参见表8)。

(5)实验目的与方法：将4个样品置于85℃、90％湿度环境中5min，检测不同的成分添加顺序下样品活菌数和存活率。

(6)实验结果如表8所示。

表8玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对抗高温高湿的效果

(7)实验结论：高温高湿耐受实验表明：对比样品一至样品四可知，若改变配方甘油、大豆乳清粉和青稞提取物等成分的添加顺序，存活率有不同程度的降低。

实施例6

(1)菌株：干酪乳杆菌(CGMCC 1.2435)

(3)主要配方组成：

b.50g菌泥、23g玉米醇溶蛋白、5g食品级甘油、1kg海藻酸钠、100g氯化钙、10g大豆乳清粉。

(4)制备方法：发酵过程完毕后，将发酵液用管式离心机10000rpm离心取菌泥100g，分成两份。由(3)中的a和b可知，相对样品一的配方，样品二的配方中没有青稞提取物。制粒、干燥后的最终制剂中的活菌数均在1.0×10¹⁰CFU/g以上(参见表9)。

(5)实验目的与方法：将2个样品置于85℃、90％湿度环境中5min，检测有无青稞提取物时样品的活菌数和存活率。

(6)实验结果如表9所示。

表9玉米醇溶蛋白包被的益生菌制剂对抗高温高湿的效果

(7)实验结论：高温高湿耐受实验表明：对比样品一和样品二可知，若配方中不加青稞提取物，存活率会降低约30％。

工业实用性

本发明的制备方法具有通用性、成本低、工艺简单，对食品用添加剂或饲料添加剂用益生菌(包括但不限于嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、布氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、清酒乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、嗜热链球菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、丁酸梭菌、肠膜明串珠菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌)具有广泛的适用性。

Claims

1.一种玉米醇溶蛋白包被剂，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白包被剂包含：玉米醇溶蛋白0.25～2.5％(w/w)；甘油0.25～1.25％(w/w)；海藻酸钠50～90％(w/w)；氯化钙2.5～12.5％(w/w)；大豆乳清粉0.25～2.5％(w/w)；青稞提取物0.25～2.5％(w/w)。

2.如权利要求1所述的玉米醇溶蛋白包被剂，其中，相对于玉米醇溶蛋白包被剂的总量，包含玉米醇溶蛋白0.5～2.5％(w/w)，优选包含玉米醇溶蛋白1.0～2.5％(w/w)，更优选包含玉米醇溶蛋白1.4～2.4％(w/w)，进一步优选包含玉米醇溶蛋白1.6～2.3％(w/w)。

3.如权利要求1或2所述的玉米醇溶蛋白包被剂，其中，所述青稞提取物为青稞麸皮的水提取物；

优选地，所述青稞提取物的制备方法包括：将1～10g青稞麸皮用100～500g纯净水提取1～5次，每次20-30min；其间任选地辅助功率100～300W、温度40～80℃的超声10～60min，过滤，旋转蒸发，低温干燥；

更优选地，所述超声以300W、温度50℃的条件进行30min。

4.如权利要求1～3中任一项所述的玉米醇溶蛋白包被剂，其中，相对于玉米醇溶蛋白包被剂的总量，包含青稞提取物0.25～2.5％(w/w)，优选包含青稞提取物0.3～2.0％(w/w)，更优选包含青稞提取物0.35～1.5％(w/w)，进一步优选包含青稞提取物0.45～0.8％(w/w)。

5.一种利用如权利要求1～4中任一项所述的玉米醇溶蛋白包被剂对益生菌进行包被来制备益生菌制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

(2)将玉米醇溶蛋白溶于50～65％(v/v)乙醇中，形成b液；

(3)将b液加入氯化钙溶液，形成c液；

(4)将a液喷入c液中，搅拌超声、微囊化、干燥，

从而得到利用玉米醇溶蛋白包被剂进行包被的益生菌制剂，

其中，所述益生菌制剂中包含益生菌2.5～12.5％(w/w)。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述益生菌为食品用益生菌或饲料添加剂用益生菌；

优选地，所述益生菌选自于以下益生菌中的一种或多种：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、布氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、清酒乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、嗜热链球菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、丁酸梭菌、肠膜明串珠菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中，所述益生菌菌泥中含有活菌数1.0×10¹⁰CFU/g以上，优选含有活菌数1.0×10¹¹CFU/g以上，更优选含有活菌数5.0×10¹¹CFU/g以上，进一步优选含有活菌数1.0×10¹²CFU/g以上，特别优选含有活菌数5.0×10¹²CFU/g以上；

其中，所述益生菌制剂中含有活菌数1.0×10¹⁰CFU/g以上，优选含有活菌数2.0×10¹⁰CFU/g以上，进一步优选含有活菌数3.0×10¹⁰CFU/g以上，特别优选含有活菌数5.0×10¹⁰CFU/g以上。

8.如权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述益生菌菌泥的制备方法包括：将益生菌在无菌条件下活化并复壮，扩大培养，发酵，离心得到益生菌菌泥。

9.如权利要求5～8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

10.通过如权利要求5～9中任一项所述的方法制备的益生菌制剂。