CN114302888A - 5’-肌苷酸二钠的分离方法 - Google Patents

5’-肌苷酸二钠的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从含有5’‑肌苷酸的微生物培养液中分离5’‑肌苷酸的方法。

Description

5’-肌苷酸二钠的分离方法
技术领域
本发明涉及一种从微生物培养物中分离5’-肌苷酸二钠的方法。
背景技术
诸如肌苷酸二钠(disodium 5’-inosinate，IMP2Na)之类的嘌呤衍生物核苷酸在医药部门用作代谢紊乱的预防治疗剂、生长促进剂、抗癌剂等的原料，是在食品领域中用作调味品等食品添加剂的重要物质。肌苷酸二钠通过肌苷酸(inosinic acid，IMP)的鱼肉提取法、RNA酶分解法、微生物发酵法、发酵法和合成法的组合、RNA化学分解和合成的组合等来制备，所述肌苷酸为一种天然存在于肉类、鱼类等的物质。
肌苷酸为用于制备肌苷酸二钠的前体物质，对其制备方法进行了大量研究，为了获得可用作食品添加剂的优质5’-肌苷酸二钠，应该对肌苷酸进行纯化以去除杂质。
关于培养微生物并从其培养物生产5’-肌苷酸二钠的方法，在结晶化步骤中可以使用有机溶剂，但应该使用大量的有机溶剂，从而需要防爆设备和工人设备。另外，为了去除有机溶剂，可能会需要蒸馏工艺和相应的设备，从而需要一种替代方法。
发明内容
技术问题
本发明提供一种5’-肌苷酸二钠的分离方法，其包括：培养产生5’-肌苷酸的微生物；将所述微生物培养液的pH调节至7.4至8.0；将所述调节pH的培养液浓缩形成5’-肌苷酸二钠晶体；从所述含有5’-肌苷酸二钠晶体的所述培养液中分离5’-肌苷酸二钠晶体；以及将所分离的5’-肌苷酸二钠晶体与亲水性有机溶剂接触以洗涤所述晶体。
技术方案
如本文所用，“5’-肌苷酸(inosinic acid)”为核苷单磷酸酯，也称为次黄嘌呤核苷酸(inosine monophosphate，IMP)。“5’-肌苷酸”和“其盐”可互换使用。所述盐包括“5’-肌苷酸”或5’-肌苷酸二钠。
如本文所用，“培养物(culture)”是指通过培养微生物而获得的结果物。所述培养物可以包括微生物细胞或其代谢物。所述代谢物可以存在于细胞内或细胞外。所述代谢物可以为核酸代谢物。所述核酸代谢物可以为5’-肌苷酸或其盐。
如本文所用，“培养液(culture broth)”是指从培养物中除去微生物细胞的液体部分。所述培养液可以包括从微生物排出或衍生的产物。所述培养液可以包括可溶性产物。所述培养液可以包括5’-肌苷酸或其盐。
本发明的一方面提供一种5’-肌苷酸二钠的分离方法，其包括：培养产生5’-肌苷酸的微生物；将所述微生物培养液的pH调节至7.4至8.0；将所述调节pH的培养液浓缩形成5’-肌苷酸二钠晶体；从所述含有5’-肌苷酸二钠晶体的所述培养液中分离5’-肌苷酸二钠晶体；以及将所分离的5’-肌苷酸二钠晶体与亲水性有机溶剂接触以洗涤所述晶体。
所述方法可以包括从含有5’-肌苷酸的微生物培养物除去细胞体以获得培养液的步骤。
在所述获得培养液的步骤中，所述微生物可以为产生5’-肌苷酸的微生物。所述微生物可以为一种经过基因操作以增加5’-肌苷酸生产能力的微生物。所述微生物可以为细菌。所述微生物可以为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。所述细菌可以为棒状杆菌(Corynebacterium)属或埃希氏菌(Escherichia)属。所述细菌可以为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、产氨短杆菌(C.ammoniagenes)或大肠杆菌(E.coli)。所述微生物可以将5’-肌苷酸分泌到细胞外。
所述微生物培养物可以通过在培养基中产生5’-肌苷酸的条件下培养所述微生物而获得。所述微生物培养物可以包括5’-肌苷酸。所述培养基可以为用于发酵5’-肌苷酸的已知培养基。所述培养基可以包括碳源、氮源和微量元素。所述培养基可以包括糖蜜或玉米浸泡液。所述培养基可以为LB培养基。基于每1L蒸馏水，所述培养基可以包括46g葡萄糖、30g果糖、10g酵母提取物、18g KH2PO4、42g KH2PO4、6g尿素、10g MgSO4·7H2O、30μg生物素和5mg盐酸硫胺。
基于培养物的总重量，所述微生物培养物可以包括0.5％至20％、1.0％至20％、2.5％至20％、5％至20％或5％至10％的5’-肌苷酸。所述5’-肌苷酸可以存在于细胞外培养基中。所述微生物培养物的pH值可以为6至9。所述微生物培养物可以为未经离子交换色谱法或有机溶剂，例如甲醇析晶的微生物培养物。
去除细胞体可以为从培养物的液体成分中去除细胞或细胞碎片(debris)。可以通过已知方法进行细胞体的去除。可以通过进行过滤、离心分离或其组合来去除细胞体。
所述方法可以包括将所述培养液的pH调节至7.4至8.0的步骤。可以通过向所述培养液添加酸或碱来调节pH。所述酸可以为盐酸。所述碱可以为NaOH。所述pH可以为pH7.4至pH8.0、pH7.6至pH8.0、pH7.8至pH8.0、pH7.4至pH7.8或pH7.4至pH7.6。
所述方法可以包括将所述调节pH的培养液浓缩形成5’-肌苷酸二钠晶体的步骤。所述步骤可以为通过浓缩培养液来使5’-肌苷酸转化为5’-肌苷酸二钠晶体的结晶化过程。本结晶化过程通过简单地浓缩所述培养液以增加培养液中5’-肌苷酸的浓度来进行，并且可以不使用有机溶剂。不使用的所述有机溶剂可以为亲水性有机溶剂。不使用的所述亲水性有机溶剂可以为C1-C5醇，或水和C1-C5醇的混合物。所述醇可以为选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇及其混合物中的至少一种。不使用的所述亲水性有机溶剂可以为乙醇。基于体积，所述乙醇在水中的浓度可以为50％至70％。
在将所述调节pH的培养液浓缩的步骤中，可以降低培养液的水分含量。在所述浓缩步骤中，可以加热所述培养液以蒸发水分。对于培养液，所述浓缩步骤可以在50℃或更高的温度、60℃或更高的温度、70℃或更高的温度、80℃或更高的温度、90℃或更高的温度、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至60℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃或60℃至65℃下进行。所述浓缩步骤可以在减压下进行浓缩。在所述浓缩步骤中，可以增加培养液中5’-肌苷酸的浓度，直至形成5’-肌苷酸二钠晶体。可以进行所述浓缩步骤，直至培养液中5’-肌苷酸的浓度达到380g/L至600g/L、400g/L至550g/L、400g/L至500g/L、400g/L至475g/L或425g/L至475g/L。可以进行所述浓缩步骤，直至形成5’-肌苷酸二钠晶体以使培养液具有含晶体的浆料形状。以下，将含有晶体的浆料溶液也称为“晶体浆料(crystalslurry)”。如本文所用，“浆料(slurry)”是指悬浮在液体，通常是水中的比重(specificgravity)大于1的固体，例如晶体的混合物。所述晶体可以具有20μm至400μm的粒度。
所述方法还可以包括在调节培养液pH的步骤之前浓缩所述培养液的步骤。在所述浓缩步骤中，培养基中可以不形成或基本上不形成5’-肌苷酸二钠晶体。在所述浓缩步骤中，可以降低培养液的水分含量。在所述浓缩步骤中，可以加热所述培养液以蒸发水分。可以进行所述浓缩步骤，直至培养液中5’-肌苷酸的浓度达到150g/L至360g/L。在所述浓缩步骤中，5’-肌苷酸的浓度可以为150g/L至360g/L、200g/L至300g/L、220g/L至280g/L或240g/L至280g/L。对于培养液，所述浓缩步骤可以在50℃或更高的温度、60℃或更高的温度、70℃或更高的温度、80℃或更高的温度、90℃或更高的温度、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至60℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃或60℃至65℃下进行。所述浓缩步骤可以在减压下进行浓缩。
所述方法还可以包括冷却所述培养液的步骤，所述培养液包括在所述浓缩步骤之后形成的晶体。所述冷却可以为25℃至45℃、25℃至40℃、25℃至35℃或25℃至30℃的冷却。所述冷却步骤可以为以恒定速率冷却晶体浆料的步骤。所述冷却可以在所述冷却温度下进行1.0小时至3.0小时，例如1.5小时至2.5小时或2小时。所述恒定冷却速率可以为8.0℃/hr至17.0℃/hr，例如10.0℃/hr至15.0℃/hr、1.0℃/hr至14.0℃/hr、2.0℃/hr至13.0℃/hr或约12.5℃/hr。所述冷却可以在将所形成的晶体浆料注入到夹套玻璃晶体管中并搅拌的同时进行。当在较低温度下冷却时，溶解度降低，从而可以回收更多的晶体。另外，当以均匀的速率冷却时，可以获得更硬、质量更好的晶体。
所述方法还可以包括在冷却完成后在所述冷却温度下孵育所述浆料以使晶体熟化的步骤。所述孵育可以进行1小时至5小时、1小时至4小时、1小时至3小时、1.5小时至2.5小时或约2小时。所述孵育可以在将晶体浆料加入到夹套玻璃晶体管中并搅拌的同时进行。
所述方法还可以包括从含有所形成的5’-肌苷酸二钠晶体的所述培养液中分离5’-肌苷酸二钠晶体的步骤。
在不脱离本发明目的的范围内，所述分离晶体的步骤可以通过已知的晶体分离方法进行。所述分离晶体的步骤可以例如为进行离心分离、过滤或其组合。所述离心分离的转速可以为100g至1000g、100g至800g、100g至500g、300g至1000g或500g至1000g。所述离心分离的旋转时间可以为10分钟至30分钟。
所述方法可以包括将所分离的5’-肌苷酸二钠晶体与亲水性有机溶剂接触以洗涤晶体的步骤。
在洗涤步骤中，所述接触可以包括将所述晶体与亲水性有机溶剂混合。所述洗涤可以为通过从所述晶体去除杂质来降低杂质的含量。所述亲水性有机溶剂可以为C1-C5醇或水和C1-C5醇的混合物。所述醇可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇或其混合物。基于体积，所述亲水性有机溶剂在水中的浓度可以为50％至70％、60％至70％、55.0％至65.0％或60％。所述亲水性有机溶剂可以为乙醇或水和乙醇的混合物。所述乙醇可以具有价格低廉、有害性低的优点。基于体积，所述亲水性有机溶剂可以占所形成的含晶体样品的10％至50％，例如，20％至50％、15％至40％、20％至40％、25％至40％、25％至35％或25％至50％。
在所述方法中，分离晶体的步骤和洗涤晶体的步骤可以同时进行。另外，分离晶体的步骤和洗涤晶体的步骤可以分开进行。
本发明的方法还可以包括将所洗涤的晶体在水性溶剂中与活性炭接触以除去发色物质的步骤。所述接触可以为将所洗涤的晶体在水性溶剂中与活性炭混合和孵育。所述水性溶剂可以为水。
所述去除所述发色物质的步骤可以包括：将所述洗涤的晶体溶解在水中以使其浓度为250g/L至500g/L；以及基于5’-肌苷酸的重量，向含晶体的水溶液添加0.1％至10％的活性炭。所述接触可以在40℃至80℃下进行。
有益效果
根据本发明的5’-肌苷酸二钠的分离方法，可以有效地分离5’-肌苷酸二钠晶体。尤其，根据所述方法，由于有机溶剂仅用于洗涤步骤，因此其使用量很小。根据所述方法，分离得到的5’-肌苷酸二钠晶体的分离收率高，纯度高。
具体地，通过调节所述培养液的pH值，可以显着提高5’-肌苷酸二钠晶体的分离收率。另外，通过将所分离的5’-肌苷酸二钠晶体与亲水性有机溶剂接触以洗涤晶体，与水洗相比，避免收率降低，所形成的晶体颜色得到改善，晶体中有害有机溶剂的含量显着减少，从而可以确保经济性。
具体实施方式
下面将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是为了示例性地描述本发明，而本发明的范围不限于这些实施例。
实施例：IMP发酵和从培养物中分离IMP
1、IMP生产和微生物的培养
将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)接种到含有18L培养基的30L发酵培养箱中，并在31℃培养140小时以在培养物中产生5’-肌苷酸(IMP)。所述5’-肌苷酸分泌到细胞外并存在于培养液中。所述培养基的初始pH值为7.2，基于每1L蒸馏水，包括46g葡萄糖、30g果糖、10g酵母提取物、18g KH2PO4、42g KH2PO4、6g尿素、10g MgSO4·7H2O、30μg生物素和5mg盐酸硫胺。最终所得培养物的pH为6.8。
在向所得培养物加入50w/w％含量的NaOH以将pH调节至10.5后，将其通过微量过滤器过滤以除去菌体并获得上清液。使用HPLC测量上清液中5’-IMP的浓度。所述上清液含有140g/L的5’-IMP。
2、5’-肌苷酸二钠晶体的形成
将所述2L滤液放入旋转蒸发仪(rotary evaporator N-1110V:EYELA，日本)中，蒸发滤液中的水分，浓缩滤液，直至5’-IMP浓度达到260g/L。使用真空控制器NVC-2200在120mmHg的蒸发器内压、65℃的容器温度和1L/hr的蒸发速率下进行蒸发。此时，容器内部滤液的温度为55℃。下面将所述浓缩过程称为“第一次浓缩”。
结果，所得浓缩滤液的pH为9.0，温度为55℃。初始滤液的pH值从10.5变为9.0的原因被认为是因为在蒸发过程中去除了氨。
接下来，向所获得的浓缩滤液1077mL中，每1L添加4.5mL 35％(v/v)的盐酸以将pH调节至7.4，并且温度保持在55℃。下面将所述过程称为“pH调节过程”。
将调好pH的所述浓缩滤液1082mL放入所述旋转蒸发仪中，在与上述相同的条件下进行浓缩，直至所述滤液成为浆料状态，所述浆料状态是指滤液中5’-IMP的浓度为460g/L的晶体与液体混合而成的过饱和溶液。其中，5’-IMP的浓度“460g/L”是指所溶解的5’-IMP和5’-IMP 2Na晶体的总量。结果，所述过饱和溶液608mL中的5’-IMP和2Na+离子以5’-肌苷酸二钠(以下也称为“5’-IMP2Na”)晶体的形式析出，所述浓缩滤液成为由固体状的晶体与液体状的滤液混合的粘性悬浮液(以下也称为“浆料”)。在结晶化刚完成后，所得浆料的温度为55℃，pH为8.0。下面将所述过程称为“第二次浓缩和结晶化过程”。即，5’-IMP2Na晶体通过所述第二次浓缩和结晶化过程形成，这意味着5’-IMP可以在不使用有机溶剂的情况下通过浓缩转化为5’-IMP2Na晶体。这是本领域技术人员难以预测的显着效果。
将所述浆料608mL注入夹套玻璃晶体管中，在上部安装顶置式搅拌器(eyela,zz-2121)，在以200rpm搅拌的同时以12.5℃/hr的冷却速度冷却至30℃2小时。为了以恒定速率冷却浆料，使用夹套玻璃晶体管。在冷却完成后，搅拌含有所述浆料的夹套玻璃晶体管，同时将其在30℃孵育2小时。所述过程为一种维持晶体生长的熟化过程。下面将所述过程称为“冷却和熟化过程”。
3、5’-肌苷酸二钠晶体的回收
从所获得的熟化浆料分离出5’-IMP2Na晶体。具体地，将所获得的熟化浆料608mL置于篮式分离器H-110F(KOKUSAN Co.Ltd.，日本)中并以340×g离心20分钟。所述H-110F离心分离器内部设有带孔的篮子(perforated basket)，所述篮子与外部旋驱动机(externalrotation supply)连接。带孔的篮子由聚酰胺复丝纤维滤布(polyamide multifilamentfiber filter fabric)制成，过滤器的透气率在2mbar时为250L/m2/s。作为离心分离的结果，获得了从浆料中除去液体的含有IMP2Na晶体的滤饼(cake)300g。
接下来，在此，喷洒150ml 60％(v/v)的乙醇水溶液以洗涤IMP2Na晶体(以下也称为“乙醇洗涤”)。洗涤结果，回收272g的5’-IMP2Na晶体，室温干燥24小时，得到265g干燥柱状5’-IMP2Na晶体。所述5’-IMP2Na晶体也称为5’-IMP2Na晶体7.5水合物。
测量所获得的干燥后的5’-IMP2Na晶体的纯度和透过率。结果，干燥后的5’-IMP2Na晶体的收率为94.6％，纯度为95.7％，透过率为86.10％。根据下式计算所述收率和纯度。
[数学式1]
收率＝所得5’-IMP2Na晶体的重量/2L滤液中5’-IMP2Na晶体的重量×100
为了确定纯度，将干燥后的5’-IMP2Na晶体和标准5’-IMP2Na晶体(Sigma，≥9.0％(HPLC))1.0g溶解在三次蒸馏水1L中，分别制备浓度为1.0g/L的实验组和标准溶液。将实验组和标准溶液5uL加载到Agilent 1260 Infinity四元液相色谱(Agilent TechnologyInc.)系统的色谱柱上。所述色谱柱为Shiseido CAPCELL PAK C18 ACR(150mm×4.6mm，3μm)。接下来，在将乙腈2％(v/v)/磷酸盐缓冲液(pH 2.4)98％(v/v)以1ml/min的流速流入色谱柱时，测定流出的洗脱液在254nm处的吸光度。所述磷酸盐缓冲液含有2g/L的磷酸铵、0.2g/L的磷酸四丁铵和0.82g/L的磷酸。此时，温度为35℃。所述HPLC条件也用于测量滤液中5’-IMP的浓度。结果，根据下式计算纯度。
[数学式2]
纯度＝5’-IMP重量/固体重量×100
另外，为了测量透过率，将通过将所述实验组以5(w/v)％浓度溶解于水中而获得的溶液放入CARY 100 UV-VIS(Agilent Technology Inc.)装置的方形单元中，并且在420nm处测量透过率。
另外，在作为对照组1实验的“5’-肌苷酸二钠晶体的回收”中，除了在洗涤过程中不使用60％(v/v)乙醇水溶液(以下也称为“无洗涤”)外，以相同方式回收5’-IMP2Na晶体。结果，所获得的5’-IMP2Na的纯化晶体的干重为266g，收率为95％，纯度为86.40％，透过率为40.48％。
此外，作为对照组2实验，在“5’-肌苷酸二钠晶体的回收”中，除了在洗涤过程中使用相对于5’-IMP2Na晶体浆料体积具有25％含量的去离子水代替60％(v/v)乙醇水溶液外，以相同方式回收5’-IMP2Na晶体(以下也称为“水洗”)。结果，所获得的5’-IMP2Na的纯化晶体的干重为240g，收率为85.7％，纯度为94.64％，透过率为72.72％。
[表1]
干重(g) 收率(％) 纯度(％) 透过率(％)
实验组 265 94.6 95.70 86.10
对照组1 266 95.0 86.40 40.48
对照组2 240 85.7 94.64 72.72
表1显示了从实验组、对照组1和对照组2中获得的5’-IMP2Na晶体的干重、收率、纯度和透过率。如表1所示，当晶体的分离过程中使用60％(v/v)乙醇水溶液时，与未洗涤或用水洗涤的情况相比，晶体的纯度和透过率均得到改善。具体地，与对照组1和对照组2相比，实验组的纯度分别提高10.8％和1.1％，透过率分别提高112.7％和18.4％。这种纯度和透过率的提高为现有技术中难以预测的显着效果。尤其，透过率分别提高112.7％和18.4％意味着所生产的5’-IMP2Na晶体具有容易满足食品标准的优势。具体地，为了达到食品标准，透过率应达到98％水平，对照组1和对照组2需要进行2次或多次重结晶化，而实验组即使再进行1次也可以达到食品标准。另外，为了将对照组1和对照组2调整到实验组的水平，需要增加水洗量，回收率会降低。
4、结晶化步骤中pH值的影响
在本节中，确认了溶液的pH值对结晶化步骤中5’-IMP结晶化的影响。
具体地，在所述“2、5’-肌苷酸二钠晶体的形成”中，在“第一次浓缩”后得到的浓缩滤液(pH 9.0)2000mL中加入35％(v/v)盐酸以将pH调节至7.2，并保持温度在55℃。
如此，将调好pH的所述浓缩滤液2000mL放入所述旋转蒸发仪中，在与上述相同的条件下进行浓缩，直至所述滤液成为浆料状态，所述浆料状态是指滤液中5’-IMP的浓度为400g/L的晶体与液体混合而成的过饱和溶液。其中，5’-IMP的浓度“400g/L”是指所溶解的5’-IMP和5’-IMP 2Na晶体的总量。结果，所述过饱和溶液608mL中的5’-IMP和2Na+离子以5’-IMP2Na晶体的形式析出，从而所述浓缩的滤液变成固体状的晶体与液体状的滤液混合的粘性悬浮液(以下也称为“浆料”)。在结晶化刚完成后，所得浆料的温度为55℃，pH为8.0。
将所述浆料608mL注入夹套玻璃晶体管中，在上部安装顶置式搅拌器(eyela,zz-2121)，在以200rpm搅拌的同时以12.5℃/hr的冷却速度冷却至30℃2小时。为了以恒定速率冷却浆料，使用夹套玻璃晶体管。在冷却完成后，搅拌含有所述浆料的夹套玻璃晶体管，同时将其在30℃孵育2小时。所述过程为一种维持晶体生长的熟化过程。下面将所述过程称为“冷却和熟化过程”。
使用35％(v/v)盐酸和50％NaOH溶液将冷却的滤液608mL调节至pH7.4至9.0。如上所述，将各pH的滤液上清液加载到HPLC上并洗脱以测量滤液中5’-IMP的浓度。表2显示了根据pH值的滤液中5’-IMP浓度。
[表2]
Figure BDA0003513250620000101
如表2所示，5’-IMP的浓度在pH7.4至8.0中最低。在表2中，pH7.4至8.0的低溶解度意味着5’-IMP2Na晶体在该pH范围内形成良好。
5、5’-肌苷酸二钠晶体分离中所用有机溶剂、浓度和含量的影响
本节中在“3、5’-肌苷酸二钠晶体的回收”中，当使用其他有机溶剂、浓度和含量代替60％(v/v)乙醇水溶液时，确认了对5’-IMP的溶解度、5’-IMP2Na晶体的颜色、以及5’-IMP2Na晶体的纯度、水分含量和吸光度的影响。
(1)根据有机溶剂的5’-IMP的溶解度和溶解有晶体的溶液的吸光度
将所述“2、5’-肌苷酸二钠晶体的形成”中得到的熟化浆料608ml加入表3所示的有机溶剂1000ml中，在25℃下搅拌1小时以使所述浆料中的5’-IMP溶解在有机溶剂中。将该溶液以1500rpm离心分离10分钟以获得上清液。
然后，使用HPLC测量所述上清液中5’-IMP的浓度。如“3、5’-肌苷酸二钠晶体的回收”中所述，将晶体分离并溶解在水中以制备5(w/v)％水溶液，并测量在420nm处的吸光度。由于晶体中的主要杂质为黄棕色，因此选择420nm吸光度来测量这些有色物质的含量。使用CARY 100UV-VIS(Agilent Technology Inc.)仪器测量吸光度。
表3显示根据有机溶剂的类型和浓度的5’-IMP的溶解度。在表3和表4中，％基于体积/体积。
[表3]
区分 10％ 30％ 50％ 60％ 70％ 90％ 100％
水 - - - - - - 178.86
甲醇 100.71 29.76 4.91 2.51 1.50 0.80 1.14
乙醇 93.32 12.59 1.97 1.23 0.12 0.00 0.93
异丙醇 96.02 15.63 2.39 1.76 0.11 0.00 0.00
表4显示通过将使用不同类型和浓度的有机溶剂而获得的5’-IMP2Na晶体溶解在水中而获得的溶液的吸光度。
[表4]
区分 10％ 30％ 50％ 60％ 70％ 90％ 100％
水 - - - - - - 0.03
甲醇 0.03 0.04 0.04 0.05 0.06 0.14 0.23
乙醇 0.04 0.04 0.04 0.08 0.12 0.35 0.44
异丙醇 0.03 0.03 0.04 0.17 0.22 0.44 0.50
如表3和表4所示，当亲水性有机溶剂的浓度为50％至70％时，确认了母液中5’-IMP的浓度低，同时洗涤后的晶体的吸光度低。
(2)根据有机溶剂含量的晶体特征
除了在所述“3、5’-肌苷酸二钠晶体的回收”中用的60％(v/v)乙醇水溶液的量改为相对于浆料体积的0％至40％(v/v)外，根据相同的过程分离5’-IMP2Na晶体，测量了晶体纯度、晶体水分和吸光度。通过干烘箱法测量晶体水分，所述干烘箱法为一种测量在125℃的烘箱中干燥3小时前后的重量的方法。如上所述测量晶体纯度和吸光度。
[表5]
区分 0％ 5％ 15％ 25％ 35％ 40％
晶体纯度(％) 86.4 91.18 92.60 95.7 96.00 96.01
晶体水分(％) 29.46 30.40 30.89 30.83 30.62 30.56
吸光度 0.42 0.24 0.17 0.12 0.09 0.09
如表5所示，当洗涤溶液60％(v/v)乙醇水溶液的用量为晶体浆料体积的25％或更多，例如25％至35％时，晶体纯度、晶体水分和吸光度均得到改善。

Claims (16)

1.一种5’-肌苷酸二钠的分离方法，其包括：培养产生5’-肌苷酸的微生物；
将所述微生物培养液的pH调节至7.4至8.0；
将所述调节pH的培养液浓缩形成5’-肌苷酸二钠晶体；
从所述含有5’-肌苷酸二钠晶体的所述培养液中分离5’-肌苷酸二钠晶体；以及
将所述5’-肌苷酸二钠晶体与亲水性有机溶剂接触以洗涤所述晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，基于所述培养液的总重量，所述微生物培养液含有5％至20％的5’-肌苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微生物为棒状杆菌属或埃希氏菌属的细菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述浓缩步骤在减压下进行浓缩。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，进行所述浓缩步骤，直至所述培养液中5’-肌苷酸的浓度达到400g/L至550g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括：在所述调节pH的步骤之前将所述培养液浓缩的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述调节pH的步骤之前，进行所述浓缩培养液的步骤，直至所述培养液中5’-肌苷酸的浓度达到150g/L至360g/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述调节pH的步骤之前将所述浓缩培养液的步骤在减压下进行浓缩。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括：在所述浓缩步骤之后将所形成的晶体冷却的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述冷却为25℃至30℃的冷却。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲水性有机溶剂为C1-C5醇。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述醇为选自甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的至少一种。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲水性有机溶剂为乙醇。
14.根据权利要求1所述的方法，所述亲水性有机溶剂的浓度为50％(v/v)至70％(v/v)。
15.根据权利要求1所述的方法，所述亲水性有机溶剂的体积为所形成的含晶体样品总体积的20％至50％。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括：将所洗涤的晶体在水性溶剂中与活性炭接触以除去发色物质的步骤。
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