CN114302738A - 减毒登革病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了修饰的黄病毒，例如修饰的1型、2型、3型、4型登革病毒，这些病毒的组合，或这些病毒的四价组合。与亲本病毒相比，根据本发明各个方面的修饰导致病毒蛋白表达降低，其中，表达降低是重新编码病毒的一个或多个区域的结果。例如，可对prM或包膜(E)区进行重新编码。在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来对一个或多个区域进行重新编码。这些修饰的黄病毒用作疫苗组合物以提供保护性免疫应答。
Description
相关申请的交叉引用
本申请包括2019年6月25日递交的美国临时专利申请No.62/866,477在35 U.S.C.§119(e)下的优先权的权益，在此以引用的方式将其整体并入。
技术领域
本发明提供高度减毒的黄病毒(flaviviruses)、特别是减毒登革病毒(dengueviruses)，以及疫苗。减毒病毒提供保护性免疫力使得免受相同谱系病毒的攻击，以及针对异源病毒的交叉保护。
背景技术
登革病毒(DENV)是属于黄病毒科(Flaviviridae)的单链正链RNA病毒，在同一属(黄病毒，Flavivirus)中包括寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、西尼罗病毒(West Nilevirus，WNV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)。根据世界卫生组织(WHO)，目前约有25亿人(占世界人口的近一半)处于来自DENV的风险中，并且估计全球每年可能有5000万例DENV感染病例。DENV在系统发育上与ZIKV密切相关，并与ZIKV和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，一种甲病毒)二者共享常见的蚊子介体埃及伊蚊(Aedes aegypti)。特别要担心的是旅游者处于DENV感染的风险中，另外还要担心这种流行病输入和传播到诸如美国南部的地方。在整个美国南部都发现了DENV的介体埃及伊蚊。白纹伊蚊(Aedesalbopictus，亚洲虎斑蚊)也具有传递DENV的能力。如果DENV在美国进入白纹伊蚊(A.albopictus)种群，其将大大扩展到美国中西部和东北部的延伸范围。
抗体依赖性增强(ADE)现象使黄病毒疫苗的开发更加复杂。先前一种黄病毒的感染使个体在再次感染不同血清型后易出现疾病严重程度增加时，发生ADE。在ADE期间，针对第一种病毒的抗体结合第二种病毒但不中和第二种病毒，反而增加其感染性。DENV在许多国家中很普遍，因此任何疫苗策略都必须考虑对已建立登革热免疫力的人群的影响。值得注意的是，具有潜在DENV免疫力的人可能经历来自DENV活疫苗的不良事件增加，因为其DENV免疫力可能增强DENV疫苗株的感染性，从而导致不良事件增加。这些情况都是在开发DENV疫苗(无论是活的、灭活的还是基于抗原/VLP/骨架载体的)时需要考虑的可能情况。由于由ADE引起的黄病毒感染增强的可能性很高，因此所有疫苗开发策略都需要考虑任何给定的DENV疫苗可能如何与现有的针对黄病毒的抗体或后续的黄病毒感染相互作用。
登革病毒包括黄病毒科中蚊子携带的黄病毒的四种血清型(DENV1-4)。登革病毒是具有二十面体病毒粒子的包膜病毒，其包含C(核心)、M(膜)和E(包膜)糖蛋白，直径为40-65纳米。登革病毒基因组为长度在10,000-11,000个碱基的单链正链RNA分子，编码结构蛋白(C、prM、E)和非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS4和NS5)。登革病毒在细胞胞质中转录并复制其基因组，并将基因组翻译成单个多肽，所述多肽被宿主和病毒蛋白切割并加工。登革病毒是在热带地区引起国际关注的新兴事物，并且各个血清型在遗传上和抗原上都是不同的病毒。
因此，在本领域中仍然需要开发预防或降低感染的疫苗。
发明内容
本文描述了通过大量同义核苷酸突变修饰E区而产生的重新编码的登革病毒在提供针对致死性野生型攻击的保护性免疫和针对不同谱系的交叉保护中高度有效。此外，所述病毒具有出色的安全性。
因此，本发明的各种实施方式提供了减毒的登革病毒，其中通过E编码区的密码子对去优化而降低病毒蛋白的表达。在某些实施方式中，E是所靶向的唯一的病毒蛋白编码区。在某些实施方式中，当对除E以外的另一登革病毒蛋白编码区去优化时，所述降低小于E的降低。根据本发明，本发明的病毒蛋白表达的降低通过以下实现：改变蛋白编码序列，例如通过减低蛋白编码序列的密码子对偏好性，置换稀有密码子，修饰G+C含量，修饰CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量，或者其组合。也可通过修饰蛋白的调节序列来实现表达的降低。
在某些实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在其它实施方式中，降低密码子对偏好性包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在某些实施方式中，E蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。如Coleman等，2000和本文中所述，来计算蛋白编码序列(即，开放阅读框)的密码子对偏好性。
在本发明的实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为宿主中较不频繁的同义密码子，使E蛋白编码序列的表达降低。
在本发明的实施方式中，E蛋白编码序列DENV血清型存在于来自相同DENV血清型的不同毒株或同源毒株的背景中。
本发明还提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含其中病毒翻译降低但与wt病毒保持至少90％的抗原同一性的病毒。在一些实施方式中，病毒翻译降低，但与wt病毒保持至少95％、96％、97％、98％或99％的抗原同一性。在一些实施方式中，病毒翻译降低，但与wt病毒保持100％抗原同一性。
本发明还提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含减毒登革病毒的疫苗组合物，其中，病毒蛋白的表达降低至少10％。在各种实施方式中，病毒蛋白的表达降低至少15％、至少20％或至少25％。在本发明的实施方式中，引发对与疫苗的减毒病毒相同谱系的登革病毒有效的免疫应答。在另一实施方式中，引发对异源登革病毒有效的免疫应答。
本发明还提供了制备减毒登革病毒基因组的方法，所述方法包括：a)获得基因组核苷酸；b)对包膜编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，并对非结构蛋白3编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，以及将重新编码的核苷酸序列置换进登革病毒基因组，以制备减毒登革病毒基因组。在某些实施方式中，仅靶向E区。在一些实施方式中，另一病毒蛋白编码区的表达也降低。
本发明还提供了使用重叠PCR(overlapping PCR)通过T7聚合酶构建模板登革病毒DNA序列的方法，所述模板登革病毒DNA序列用于转录感染性病毒RNA基因组。将具有同源骨架的所有登革基因组从5'末端开始分为三个片段(片段1：nt1-3596；片段2：nt3030-6959；和片段3：nt：nt6851-末端)，并进行化学/生物化学合成。与构建感染性cDNA克隆不同，将长的重叠延伸PCR策略用来获得全长登革基因组(或：同时获得syn-wt和min登革基因组)。为了在DENV2 16681骨架中构建异源登革基因组，合成了前2.5Kb片段，所述片段包含DENV2 16681 5'UTR，来自个体DENV血清型的C结构域和prM/M、E(野生型或去优化)结构域，以及DENV2 16681NS1结构域的一小部分。包含所有NS结构域和3'UTR的8Kb DENV2 16681骨架获得自编码野生型或去优化的DENV2 16681的感染性克隆。使用不对称融合PCR方法将2.5Kb和8Kb片段融合在一起。
本发明的各种实施方式提供了修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含重新编码的prM蛋白、重新编码的包膜(E)蛋白或两者，其中重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，并且其中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
在各种实施方式中，与其亲本登革病毒相比，prM蛋白或E蛋白或两者的表达可降低。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白可具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比可具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比可具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比可具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列可各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列各自的密码子对偏好性可降低至少0.05。
在各种实施方式中，修饰的登革病毒可以选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。在各种实施方式中，修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒。
本发明的各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，所述登革疫苗组合物包含如上文和本文所述的修饰的登革病毒，以及药学上可接受的赋形剂或载体。本发明的各种实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予有效剂量的组合物，所述组合物包含如上文和本文所述的修饰的登革病毒，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
在各种实施方式中，免疫应答可为保护性免疫应答，并且可以给予预防有效剂量或治疗有效剂量的权利要求所述的疫苗组合物。在各种实施方式中，免疫应答可为针对异源登革病毒而言交叉保护性的。
在各种实施方式中，所述方法可进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。
本发明的各种实施方式提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的(i)通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒登革病毒，或(ii)修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含重新编码的prM蛋白、重新编码的包膜(E)蛋白、或两者，其中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，并且其中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸；以及向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的(i)所述通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒登革病毒，或(ii)所述修饰的登革病毒，其中，至少所述初次剂量或所述一个或多个加强剂量为所述修饰的登革病毒。
在各种实施方式中，所述一个或多个加强剂量中的第一个可以在所述初次剂量后约2周进行给予。
在各种实施方式中，与其亲本登革病毒相比，prM蛋白或E蛋白或两者的表达可降低。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比可具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白可具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比可具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比可具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白可具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比可具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列各自的密码子对偏好性降低了至少0.05。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒。
本发明的各种实施方式提供了制备修饰的登革病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码登革病毒包膜蛋白的核苷酸序列；对包膜编码核苷酸序列进行重新编码以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸置换到亲本登革病毒基因组中，以制备修饰的登革病毒基因组；从而与亲本病毒相比，所述重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达降低。
附图说明
图1描绘了在无动物成分的条件下在Vero细胞中快速构建SAVE去优化的、减毒的活登革疫苗候选物。与人ORFeome相关的登革prM/E基因的密码子对偏好性以及其SAVE去优化的副本(counterparts)。密码子对偏好性(CPB)表示为给定基因的开放阅读框(ORF)的平均密码子对得分。CPB的正值和负值分别表示ORF中统计学上过度表现(over-represented)或低度表现(under-represented)的密码子对占优势。红色圆圈表示14,795个人ORF中的每一个的CPB，代表了我们分析时大多数已知的带注释的人基因(ORFeome)。野生型E基因的CPB处于人宿主细胞基因的正常范围内。通过SAVE进行密码子对“去优化”后，得到的去优化的prM/E基因区段现在主要由低度表现的人密码子对编码(由其极负的CPB所证实)，并且与任何人基因都大不相同。B.野生型和合成的“去优化的”嵌合登革疫苗变体的cDNA基因组。从头(de novo)合成SAVE去优化的合成E，并使用重叠PCR分别亚克隆到WT DENV基因组中，产生八个独立的cDNA基因组，每个基因组包含合成的“去优化”片段。我们构建了关于wtDENV1-4的感染性cDNA基因组，然后通过将RNA转染到Vero细胞(所有的DENV WT、E-W/MIN和E-MIN病毒)或BHK细胞中，重新获得具有完全感染性的复制病毒，以用作去优化的DENV疫苗候选物。
图2描绘了通过降低E编码区中去优化序列的长度来降低减毒或增加免疫原性的亚克隆策略的图表。第二代登革疫苗候选物利用SAVE平台的灵活性，将去优化区域从全长(E-min)降低到约一半长度(W-E-Min)，同时保持氨基酸序列100％相同。
图3描述了异源骨架登革疫苗候选物在无动物成分条件下在Vero细胞中的生长。将DENV1-4 E-Min用于在无动物成分条件下以0.01的MOI感染Vero细胞，并在感染后10天的过程中以多步生长曲线每天滴定上清液。DENV2、DENV3和DENV4候选物的滴度达到1-2×105FFU/mL，而DENV1 E-Min滴度与其它候选物相比降低了～1log10。
图4A-图4C描绘了在Vero细胞中对全长DENV1骨架中的合成DENV1 WT病毒(图4A)和由DENV1 WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV1 E-W/MIN(图4B)和E-MIN(图4C)进行的多步生长曲线。合成DENV1 WT在33℃和37℃下在Vero细胞中生长良好。对DENV而言典型地，在39℃下观测到病毒产量的短暂降低，但是，滴度在7dpi时恢复到37℃水平。然而，在33℃和37℃下，DENV1 E-W/MIN的可用滴度达到比DENV1 WT低约10倍。DENV1 E-MIN在Vero细胞中高度减毒，并且仅在感染后第10-14天开始在33℃下达到可检测的滴度。
图5描绘了在Vero细胞中对合成DENV2 WT病毒(在全长DENV2骨架中)和由DENV2WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV2 E-W/MIN和E-MIN进行的多步生长曲线。DENV2 E-W/MIN和E-MIN在体外均减毒，E-W/MIN具有1-2log10 FFU/mL的降低，DENV2 E-MIN具有更明显的2-3log10 FFU/mL降低(图3)。虽然生长动力学被延迟，但每1-2天定期更换培养基，对于DENV2 E-W/MIN，病毒滴度达到>106FFU/mL。重要的是，减毒与E区中的去优化程度相关。虽然DENV2-WT和DENV2 E-W/MIN在感染后第4天的温度敏感性(37℃和39℃下滴度之间的差异)相似，但在第5、6和7天存在显著差异。对于DENV2 E-MIN，没有观测到温度敏感性，因为在任何温度下直到6DPI都没有复制。然而，从第7-14天开始，DENV2 E-MIN开始产生可检测的病毒(但仅在33℃和37℃)。
图6描绘了在Vero细胞中对合成DENV3 WT病毒(在全长DENV3骨架中)和由DENV3WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV3 E-W/MIN和E-MIN进行的多步生长曲线。很明显，DENV3 E-W/MIN在39℃时比WT对温度更敏感，在感染后第3、4、5和7天可观测到显著更大的差异。由于DENV3 E-MIN在39℃时在Vero细胞中的复制水平最小，因此从37℃到39℃的病毒产量差异高达107FFU/mL。然而，当在容许的温度下生长时，DENV3 E-MIN达到了高滴度，这对于cGMP的制造而言有希望。
图7描绘了在Vero细胞中对合成DENV4 WT病毒(在全长DENV4骨架中)和由DENV4WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV4 E-W/MIN和E-MIN进行的多步生长曲线。DENV4 WT和E-W/MIN在Vero细胞中都生长至高滴度，其中在33℃和37℃时，DENV4 E-W/MIN的峰值滴度约低10倍，但仍然高(～107FFU/mL)。两种病毒在39℃时都受到部分限制，但没有达到DENV1-3所见的程度。在第5天，与WT相比，观测到从37℃到39℃的滴度的小但显著的变化(～5倍)。DENV4 E-MIN在Vero细胞中减毒，峰值滴度比WT低100倍。DENV4 E-MIN在33℃和37℃的复制相似，但是，DENV4 E-MIN在39℃下不存活，在感染后第1-14天没能检测到病毒。
图8A-图8B描述了DENV2疫苗候选物在AG129小鼠中的减毒、免疫原性和功效的评价。对基于DENV2 16681骨架的DENV-2E-min在缺乏干扰素α或γ受体的AG129小鼠中的免疫原性/剂量递增研究中进行了测试。用两种不同浓度的DENV-2E-min或DENV-2 16681免疫动物。确定了产生的中和抗体滴度，并评价了针对DENV2的小鼠适应的致死毒株D2S10所提供的保护功效。
图9描绘了构建的D2-E-min和D2-1/2-E-min，具有在异源DENV2 16681骨架中的来源自DENV-2/NI/BID-V533/2005的E序列，以提高我们的DENV2候选物的临床相关性。我们测试了D2-1/2-E-min，其具有由一半wt DENV-2/NI/BID-V533/2005序列和一半CPD组成的E区，以提高我们的病毒的免疫原性。用106或104FFU的D2-E-min、D2-1/2-E-min或D2-WTE(具有WT DENV-2/NI/BID-V533/2005E区的DENV2 16681骨架)对AG129和BALB/c小鼠(n＝5)进行免疫接种。在DENV2 D2-E-min、D2-1/2-E-min组中未观测到死亡或发病，表明至少100倍的减毒。我们的候选物的免疫原性通过降低CPD的程度得到改善，与D2-E-Min免疫接种的AG129小鼠相比，来自D2-1/2-E-min的血清PRNT50值更高。此外，由于在106(GM＝3447)和104(GM＝2867)FFU免疫接种组之间没有观测到显著差异，因此在D2-1/2-E-min免疫接种中维持了高中和抗体滴度。在具有免疫能力的BALB/c小鼠中，D2-E-min和D2-1/2-E-min均产生与野生型相当的中和抗体水平。
图10A-图10B描绘了用于测试DENV-3疫苗候选物DENV D2/D3-E-min的免疫原性和保护功效的AG129小鼠，所述DENV D2/D3-E-min包含具有来自DENV-3/VE/BID-V2268/2008的密码子去优化的prME盒的DENV-2毒株16681骨架。本研究被设计为评价这种候选疫苗针对有毒力的(virulent)DENV3 CO360/94攻击的功效和免疫原性。所有动物都良好地耐受了第一次免疫，没有重大相关的体重减轻，并且没有动物发展出临床体征。在用1.2×107PFUDENV-3 CO360/94进行致死性攻击后，溶媒对照组的动物发展出快速进行性感染，在8/9的动物中是致死的，其中死亡的动物的平均死亡天数(MDD)为4.0±0.8天。用较高接种量的DENV D2/D3-E-min进行免疫提供了显著的保护，组中的动物中没有致死或发病(通过>10％的体重减轻来衡量)。
图11A-图11B描绘了用于测试DENV-4疫苗候选物DENV D2/D4-E-min和D2/D4-1/2-E-min的免疫原性和保护功效的AG129小鼠，所述DENV D2/D4-E-min和D2/D4-1/2-E-min包含具有来自DENV4的密码子去优化的prME盒的DENV-2毒株16681骨架。用106D2/D4-E-min(N＝12)、106D2/D4-1/2-E-min(N＝12)、106D2/D4-WTE、或作为对照的溶媒(N＝9)对AG 129小鼠进行免疫接种。本研究被设计为评价这种候选疫苗针对用有毒力的DENV4 703/4进行的攻击的功效和免疫原性。所有动物组对所有毒株的第一次免疫都良好耐受，在5天的观察期内没有持续的体重减轻，但是，在D2/D4-WTE组中，一只小鼠必须在第二次免疫之前施安乐死并且额外的动物在第二次免疫后死亡。任何其它疫苗组中的动物都没有经历进行性体重减轻。在第35天收集血清以用于在攻击前测试中和抗体，并在攻击后第30天从所有存活动物中收集血清，以通过FRNT50测试最终效价。使用具有Vero细胞的96孔板方法，使用1:64-1:32784的血清稀释度与50FFU的DENV4 WT病毒一起孵育，以二重复方式对每个血清样品进行测试。各个疫苗候选物在35DPI时具有免疫原性，免疫接种D2/D4-E-min(GMT 332.9)和D2/D4-1/2-E-min(GMT 738.4)低于免疫接种D2/D4-WTE(GMT 1640)。在攻击后2天(DPC)，在接种D2/D4-WTE的4/12小鼠中检测到病毒血症。对于用其它两种病毒免疫的所有小鼠，病毒血症水平低于测定的检测限(500个基因组当量/mL)。DENV-4 703/4攻击在溶媒对照组中产生了具有普遍致死性的快速进行性感染。此外，用D2/D4-E-min免疫的三只动物经历了致死感染，而该组中的其它动物在研究期间保持健康。重要的是，在DENV-4 703/4攻击后，在任何D2/D4-1/2-E-min免疫动物中均未观察到由体重减轻确定的发病证据和致死。
图12描绘了测试的DENV1-4 WT以及关于DENV2-4的疫苗候选物在IFNα受体敲除小鼠中的免疫原性。所有WT病毒在这些小鼠中均具有高度免疫原性，中和抗体滴度>1024。DENV2-E-W/MIN在106和104FFU剂量下与DENV2 WT病毒具有同等的免疫原性。DENV3病毒的免疫原性随着剂量的减少和去优化的增加而减弱，但是，DENV3 E-W/MIN在104FFU剂量下仍然具有高度免疫原性(～1024FRNT50)。我们注意到与DENV2 16681骨架中的异源DENV4 WT(在小鼠中的免疫原性差)相比，DENV4 E-W/MIN和WT的免疫原性显著改善。
图13描绘了AG129小鼠中四价免疫接种针对用DENV3 CO360/94进行的致死性攻击的功效和免疫原性。AG129小鼠在第0天和第21天免疫接种106IFU单价D2/D3-E-min疫苗(N＝16；10只雄性和6只雌性)、含有四种单价DENV E-min病毒各106IFU的四价疫苗(N＝16；10只雄性和6只雌性)，或用溶媒模拟免疫接种(N＝13；8只雄性和5只雌性)。在攻击前收集血清以通过FRNT50测量中和抗体。所有用单价疫苗免疫的小鼠都发展出可检测的中和抗体滴度(范围20-160)。在用四价疫苗制剂免疫的小鼠中，滴度通常较低(范围<20-80)。在第35天，所有剩余的小鼠都用通过腹膜内途径递送的107IFU DENV3 CO360/94的攻击。正如预期的那样，溶媒对照组的动物发展出快速进行性感染，在8/9(89％)的动物中是致死的，死亡的动物中的平均死亡天数(MDD)为4.1±0.4天。用单价DENV D2/D3-E-min或四价疫苗免疫在任一组的动物中提供了显著的保护，没有致死或发病(通过>10％的体重减轻来衡量)。
图14描绘了同源骨架病毒的减毒(疫苗毒株与wt的焦点大小)，与wt相比，疫苗病毒在体外传播较少。计算用DENV1-4 WT、E-W/MIN或E-MIN感染的Vero细胞的单个灶面积(mm2)，并在33℃、37℃或39℃的温度下孵育3天。我们使用ImageJ软件(NIH,v1.52a)完成了对每种病毒的灶形成单位(FFU)大小的分析。使用ImageJ将FFA板的每个图像转换为二进制8位图像(图2中提供了示例)，将用于测量FFU面积的比例设置为24孔板的孔直径(15.5mm)。使用“分析粒子”功能，通过ImageJ计算各个FFU的面积，并通过Sidak的多重比较测试(GraphPad Prism 8.1.2)比较结果。
图15描绘了四价同源骨架疫苗的体内免疫原性数据。四价和单价同源骨架登革疫苗候选物在第0天和第21天用通过皮下途径递送的106或104FFU免疫接种后在IFNα受体敲除小鼠中具有免疫原性。在免疫接种后第0、21和35天针对DENV1-4 wt的每种毒株使用灶减少中和50％测试对中和抗体进行测试。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献均以引用的方式以其整体被并入，就如同完全阐述一样。除非另有定义，本文使用的技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本领域技术人员将认识到与本文所述的那些方法和材料相似或等同的许多方法和材料，它们可用于本发明的实践。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
除非本文另有具体规定，如本文所使用的术语“约”在与引用的数字指示结合使用时是指所引用的数字指示加上或减去该引用的数字指示的多至5％。例如，语言“约50％”覆盖了45％到55％的范围。在各种实施方式中，如果在权利要求中特别规定，术语“约”在与所引用的数字指示结合使用时可以意味着所引用的数字指示加上或减去所引用的数字指示的多至4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％。
密码子对偏好性(CPB)表示为给定基因的开放阅读框(ORF)的平均密码子对得分。
“受试者”是指任何动物或人工修饰的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠。在优选的实施方式中，受试者为人。鸟类的实施方式为驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。
“病毒宿主”是指病毒可以感染的任何动物或人工修饰的动物或昆虫。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠。在具体实施方式中，病毒宿主为人。鸟类的实施方式为驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。昆虫包括但不限于蚊子。
“预防有效剂量”是当向易受病毒感染或易受病毒相关紊乱影响的受试者给予时，在受试者中诱导保护受试者免于被病毒感染或免受紊乱影响的免疫应答的任何量的疫苗。“保护”受试者意味着将受试者感染病毒的可能性降低或者使受试者中紊乱发作的可能性减少至少两倍、优选至少十倍、25倍、50倍或100倍。例如，如果受试者有1％的机会被病毒感染，则受试者被病毒感染的可能性降低两倍将导致受试者有0.5％的机会被病毒感染。
如本文所用，“治疗有效剂量”是当向受紊乱影响的受试者给予(对于该紊乱，该疫苗是有效的)时，在受试者中诱导引起受试者经历紊乱和/或其症状的减少、缓解或消退的免疫应答的任何量的疫苗。在优选的实施方式中，防止紊乱和/或其症状的复发。在其它优选的实施方式中，受试者的紊乱和/或其症状被治愈。
本发明涉及减毒的登革病毒和减毒的登革病毒的生产，所述减毒的登革病毒可用于防止病毒感染和疾病。免疫接种的基本前提是向疫苗接受者充分递送保护性抗原，假设仅这些传统优势抗原性多肽的很高的剂量(“肽或病毒样颗粒”)或相当于活病毒感染的剂量(“ChimeriVax”)足以达到足够的疫苗效力。抛开那些预期，本发明受益于相反的方法。本发明提供了其中病毒蛋白表达降低的减毒登革病毒，其具有对于疫苗生产有用的优异的生长性能，还具有非凡的安全性和增强的保护特性。减毒病毒几乎与野生型病毒一样增殖；具有高度减毒的表型(如LD50值所揭示)；在提供针对登革病毒的同一毒株攻击的保护性免疫中异常有效；并且还针对登革病毒的其它毒株攻击提供保护性免疫。
在本发明的某些实施方式中，本发明的减毒登革病毒包含重新编码的pre-膜(prM)/包膜(E)编码区。在其中C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5蛋白编码区未重新编码的实施方式中并不排除这些序列中的突变和其它变异，而仅意味着在这些序列中进行的任何突变或变异对减毒几乎没有影响或者没有影响。对减毒几乎没有影响或没有影响包括以下一项或两项：1)当变异的C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区是测试的登革病毒中唯一的变体时，C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区中的突变或变异不使病毒复制或病毒感染性降低超过20％；2)在任何C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区中的突变或变异占该编码序列中少于10％的核苷酸。如果权利要求中特别规定，对减毒几乎没有影响或没有影响包括以下一项或两项：1)当变异的C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区是测试的登革病毒中的唯一的变体时，C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区的突变或变异不使病毒复制或病毒感染性降低超过10％；2)在任何C、NS1、NS2、NS3、NS4或NS5编码区中的突变或变异占该编码序列中少于5％的核苷酸。
在各种实施方式中，本发明的病毒为减毒的。在本发明的实施方式中，与野生型相比，所述病毒在AG129小鼠模型中与具有相同氨基酸序列但由不同核苷酸序列编码的蛋白质的野生型病毒相比减毒至少10倍、减毒至少50倍、或减毒至少100倍、或减毒至少200倍、或减毒至少500倍、或减毒至少1000倍、或减毒至少2000倍。
所述减毒病毒还针对野生型病毒的相同毒株是高度保护性的。在本发明的实施方式中，当通过小鼠模型(例如本文所例示)测量时，病毒的保护剂量(PD50)是。
本发明的减毒病毒还显示出很大的安全性(即，LD50和PD50之间的差异)，因此具有高安全系数，在本文中定义为LD50/PD50的比。在本发明的某些实施方式中，安全系数为至少102、或至少103、或至少104、或至少105、或至少2×105、或至少3×105、或至少4×105、或至少5×105、或至少106、或至少2×106、或至少3×106、或至少4×106、或至少5×106。在某些实施方式中，安全系数为102至103、或103至104、或104至105、或105至106。
本发明的减毒病毒还具有针对相同血清型内的登革病毒的异源毒株的高度保护性。在本发明的某些实施方式中，当通过小鼠模型(例如本文所例示)测量时，本发明的减毒病毒的保护剂量(PD50)小于1000PFU、或小于750PFU、或小于500PFU、或小于200PFU、或小于100PFU、或小于50PFU。
根据本文讨论的公开内容，本领域技术人员已经进行或可以进行对本发明的减毒病毒的E蛋白编码序列的重新编码。根据本发明，在E编码序列中的多个位置进行核苷酸置换工程化，其中，所述置换将多个同义密码子引入基因组。在某些实施方式中，同义密码子置换改变基因组中密码子偏好性、密码子对偏好性、不频繁密码子或不频繁出现的密码子对的密度、RNA二级结构、CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量、C+G含量、翻译移码位点、翻译暂停位点(translation pause sites)、microRNA识别序列存在与否、或其任意组合。可在遍布E编码序列的多个位置或者在限于E编码序列的一部分的多个位置进行密码子置换工程化。由于涉及大量缺陷点(defect)(即核苷酸置换)，本发明提供了产生稳定的减毒病毒和活疫苗的手段。
如以下进一步讨论的，在一些实施方式中，通过将一个或多个密码子置换为在登革宿主(例如，哺乳动物、人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子，来重新编码病毒编码序列。在一些实施方式中，通过将一个或多个密码子置换为在登革病毒中较不频繁使用的同义密码子，来重新编码病毒编码序列。在某些实施方式中，用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个。在一些实施方式中，至少10个或至少20个密码子被置换为同义密码子。在一些实施方式中，用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少125个、或至少150个、或至少175个。
在一些实施方式中，对病毒密码子对进行重新编码以降低密码子对偏好性(即，使其值减小)。在某些实施方式中，通过以下降低密码子对偏好性：鉴别E编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，并通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在一些实施方式中，这种密码子对置换采取重排序列的现有密码子的形式。在一些此类实施方式中，通过重排同义密码子的子集对密码子对的子集进行置换。在其它实施方式中，通过最大化重排的同义密码子的数量，对密码子对进行置换。应当指出，虽然密码子的重排导致整个病毒编码序列的密码子对偏好性降低(使变得更负)，并且重排导致许多位置的CPS降低，在其它位置可能伴随着CPS的增加，但是平均而言，密码子对得分以及由此而来的修饰序列的CPB降低。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变E编码序列的G+C含量。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变E编码序列中CG和/或TA二核苷酸的频率。
在某些实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。在某些实施方式中，与亲本E蛋白编码序列相比，重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述重新编码的E蛋白编码序列由所述亲本E蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型病毒的E蛋白编码序列)相比较。
在某些实施方式中，与亲本E蛋白编码序列相比，E蛋白编码序列的同义密码子的重排提供了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5的密码子对偏好性降低，所述E蛋白编码序列由所述亲本E蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型病毒的E蛋白编码序列)相比较。
通常，进行这些置换和改变并降低编码病毒蛋白的表达，而不改变编码的蛋白的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明还包括导致编码的蛋白中非同义密码子和氨基酸置换的E编码序列的改变，这可以是保守的，也可以不是保守的。在各种实施方式中，有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸置换。
大多数氨基酸由多于一个的密码子编码。参见表1中的遗传密码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三个氨基酸(Leu、Ser和Arg)由六个不同密码子编码，而只有Trp和Met具有唯一的密码子。“同义”密码子是编码相同氨基酸的密码子。因此，例如，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG是编码Leu的同义密码子。同义密码子的使用频率不相等。通常，特定有机体中最常用的密码子为同源tRNA(cognate tRNA)丰富的密码子，使用这些密码子提高蛋白质翻译的速率和/或准确性。相反，发现很少使用的密码子的tRNA处于相对低的水平，认为使用稀有的密码子降低翻译速率和/或准确性。
表1.遗传密码
a最左列显示编码特定氨基酸的各个密码子中的第一个核苷酸；第二个核苷酸显示在第一行；第三个核苷酸显示在最右边的列中。
密码子偏好性
如本文所用，“稀有”密码子是编码特定氨基酸的至少两个同义密码子之一，其在mRNA中以显著低于该氨基酸最常用的密码子的频率存在。因此，稀有密码子可以以比最常用的密码子低约2倍的频率存在。优选地，稀有密码子可以以比该氨基酸最常用的密码子低至少3倍、更优选至少5倍的频率存在。相反，“频繁”密码子是编码特定氨基酸的至少两个同义密码子之一，其在mRNA中以显著高于该氨基酸最不常用的密码子的频率存在。频繁密码子可以以比该氨基酸的最不常用的密码子高约2倍、优选至少3倍、更优选至少5倍的频率存在。例如，人基因40％的时间使用亮氨酸密码子CTG，仅7％的时间使用同义CTA(参见表2)。因此，CTG为频繁密码子，而CTA为稀有密码子。大致与这些使用频率一致，在基因组中用于识别CTG的tRNA的基因有6个拷贝，而对于识别CTA的tRNA的基因只有2个拷贝。同样，人基因分别在18％和22％的时间中使用频繁密码子TCT和TCC，而仅在5％的时间使用稀有密码子TCG。TCT和TCC通过摇摆(wobble)由同一tRNA进行读取，该tRNA在基因组中具有10个拷贝的基因，而TCG则由仅有4个拷贝的tRNA读取。众所周知，非常活跃地翻译的那些mRNA强烈偏向于仅使用最频繁的密码子。这包括核糖体蛋白和糖酵解酶的基因。另一方面，相对不丰富的蛋白质的mRNA可能使用稀有密码子。
表2.智人中的密码子使用(来源：www.kazusa.or.jp/codon/)
高表达基因使用频繁密码子的倾向被称为“密码子偏好性”。核糖体蛋白的基因可能仅使用61个密码子中最频繁的20至25个，并且具有高的密码子偏好性(密码子偏好性接近1)，而低表达的基因可能使用所有61个密码子，而具有很小的或无密码子偏好性(密码子偏好性接近0)。据认为，频繁使用的密码子是其中的同源tRNA大量表达的密码子，并且这些密码子的使用使得翻译可以更快或更准确地或者二者皆有地进行。例如，PV衣壳蛋白被非常活跃地翻译，并且具有高密码子偏好性。
密码子对偏好性
此外，给定有机体对给定密码子A最近的密码子邻居具有偏爱(preference)，称为密码子对利用方面的偏好性。改变密码子对偏好性而不改变现有的密码子会影响蛋白合成的速率和蛋白产量。
可通过考虑氨基酸对Ala-Glu来说明密码子对偏好性，所述氨基酸对可由8种不同的密码子对编码。如果除了每个单独的密码子的频率(如表2所示)之外没有因素对密码子对频率负责，则可通过将两个相关密码子的频率相乘来计算这8种编码中每一种的预期频率。例如，通过这种计算，预计密码子对GCA-GAA以所有Ala-Glu编码对中的0.097的频率出现(0.23×0.42；基于表2中的频率)。为了将每个密码子对的预期(假设)频率与人基因组中的实际观测频率相关联，使用包含总共14,795个人基因的一致注释人编码区的ConsensusCDS(CCDS)数据库。这组基因是人编码序列的最全面描绘。使用这组基因，通过将密码子的出现次数除以编码同一氨基酸的所有同义密码子的数量，可重新计算密码子的使用频率。不出所料，这些频率与先前公布的频率(如表2中给出的频率)密切相关。轻微的频率变异可能是由于Kazusa DNA Research Institute(www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)的密码子使用数据库提供的数据中的过采样效应(oversampling effect)所致，在所述数据库中，计算中包括了84949条人编码序列(远远超过人基因的实际数量)。然后，通过以下方式将由此计算的密码子频率用于计算预期的密码子对频率：首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(参见表3预期频率)，然后将该结果与观测频率(在整个CCDS数据集中)相乘，由所讨论中的密码子对编码的氨基酸对以所述观测频率出现。在密码子对GCA-GAA的实例中，此第二计算得出的预期频率为0.098(与使用Kazusa数据集进行的第一计算中的0.097相比)。最后，通过对集中每个密码子对的出现总数进行计数并用其除以该集中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数量，来确定在14,795个人基因的集中观测的实际密码子对频率(表3；观测频率)。表3提供了用此方法以14,795个人基因组的集为基础的3721(612)个密码子对的完整集的频率和观测值/预期值。
表3.以氨基酸对Ala-Glu例示的密码子对得分
如果密码子对的观测频率/预期频率之比大于1，则认为该密码子对过度表现(overrepresented)。如果该比率小于1，则认为低度表现(underrepresented)。在实例中，密码子对GCA-GAA过度表现了1.65倍，而编码对GCC-GAA低度表现超过5倍。
许多其它密码子对表现出非常强的偏好性；一些对低度表现，而另一些对则过度表现。例如，密码子对GCCGAA(AlaGlu)和GATCTG(AspLeu)三至六倍低度表现(优选对分别为GCAGAG和GACCTG)，而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGAA(AsnGlu)过度表现约两倍。值得注意的是，密码子对的偏好性与氨基酸对的频率无关，也与单个密码子的频率无关。例如，低度表现的对GATCTG(AspLeu)恰好使用了最频繁的Leu密码子(CTG)。
如下面更全面地讨论的，密码子对偏好性考虑了在编码序列中每个密码子对的得分，该得分在编码序列的整个长度上进行平均。根据本发明，密码子对偏好性由下式确定：
因此，例如可通过在整个子序列上使密码子对得分最小化或在编码序列的全长上使密码子对得分中等程度地减小来获得编码序列的相似密码子对偏好性。
密码子对偏好性的计算
可能的3721个包含非“STOP”的密码子对的每个单独的密码子对(例如，GTT-GCT)都带有指定的“密码子对得分”或“CPS”，其对于给定的基因“训练集(training set)”具有特异性。给定密码子对的CPS定义为观测的出现次数与在该组基因(在此示例中为人基因组)中所预期的次数的对数比。确定特定密码子对的实际出现次数(或者换句话说，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)仅是计算在特定编码序列集中的密码子对的实际出现次数的问题。然而，确定预期次数需要额外的计算。类似于Gutman和Hatfield，计算预期次数以使其独立于氨基酸频率并独立于密码子偏好性。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算预期频率。正CPS值表示给定的密码子对在统计学上过度表现，而负CPS表示该对在人基因组中在统计学上低度表现。
为了在人环境中执行这些计算，使用最新的一致注释人编码区的Consensus CDS(CCDS)数据库，该数据库包含总共14,795个基因。该数据集提供了密码子和密码子对，以及由此而来的基因组规模的氨基酸和氨基酸对频率。
将Federov等(2002)的范例用来进一步增强Gutman和Hatfield(1989)的方法。这允许独立于密码子频率以及与编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机关联来计算给定密码子对的预期频率。在WO2008/121992和WO 2011/044561中公开了用于计算CPB的详细方程，将其通过引用的方式并入。
在该计算中，Pij是在其同义组中以NO(Pij)的频率出现的密码子对。Ci和Cj是Pij包含的两个密码子，在其同义组中分别以频率F(Ci)和F(Cj)出现。更明确地，F(Ci)是在所有编码区中由密码子Ci编码相应氨基酸Xi的频率，并且F(Ci)＝NO(Cj)/NO(Xi)，其中，NO(Ci)和NO(Xi)分别为密码子Ci和氨基酸Xi的观测出现次数。相应地计算F(Cj)。此外，NO(Xij)是在所有编码区中氨基酸对Xij的出现次数。以观测频率No(Pij)与预期的出现次数Ne(Pij)的对数比率比(log-odds ratio)计算Pij的密码子对偏好性得分S(Pij)。
然后，使用上述公式来确定，当与通过使用整个人CCDS数据集计算出的相应基因组Ne(Pij)值相比时，各个编码序列中的各个密码子对是否过度表现或低度表现。此计算导致在人编码区中正值S(Pij)得分值为过度表现而负值为低度表现密码子对。
根据以下方程，通过对所有密码子对得分进行平均，计算个体编码序列的“组合”密码子对偏好性：
因此，整个编码区的密码子对偏好性通过以下进行计算：将包含在该区域中的所有个体密码子对得分相加并将该总和除以该编码序列的长度。
密码子对偏好性的计算，改变密码子对偏好性的算法的实现。
开发了算法来量化密码子对偏好性。每个可能的个体密码子对都有“密码子对得分”或“CPS”。CPS定义为在所有人编码区中每个密码子对的观测出现次数与预期出现次数之比的自然对数，其中，人代表待重新编码的本发明的疫苗病毒的宿主物种。
尽管特定密码子对的观测出现的计算很简单(基因集中的实际计数)，但密码子对的预期出现次数需要额外的计算。我们计算出该预期次数，与氨基酸频率和密码子偏好性均无关，这与Gutman和Hatfield类似。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算期望频率。正CPS值表示给定密码子对在统计学上过度表现，而负CPS表示在人基因组中该对在统计学上低度表现。
使用这些计算的CPS，然后可按照使用过度表现或低度表现的密码子对，通过对密码子对得分进行平均对任何编码区进行评定，从而得出整个基因的密码子对偏好性(CPB)。
已经使用所示的方程计算了所有带注释的人基因的CPB并进行了绘制(图1)。图表中的每个点对应于单个人基因的CPB。分布的峰具有0.07的正密码子对偏好性，这是所有带注释的人基因的平均得分。同样，很少有带有负密码子对偏好性的基因。建立用来定义和计算CPB的方程然后用于操纵此偏好性。
降低密码子对偏好性以减毒的算法。
可借助或不借助计算机，例如使用梯度下降、或模拟退火或其它最小化程式，来进行蛋白编码序列的重新编码。重排起始序列中存在的密码子的程序的示例可通过以下步骤表示：
(1)获取野生型病毒基因组序列。
(2)选择靶向的蛋白编码序列以用于减毒设计。
(3)锁定已知或推测的具有非编码功能的DNA区段。
(4)为重新设计的蛋白中的剩余氨基酸选择所需的密码子分布。
(5)对至少两个同义的非锁定密码子位置执行随机改组，并计算密码子对得分。
(6)进一步降低(或增加)密码子对得分，任选地采用模拟退火程序。
(7)就过多的二级结构和不需要的限制位点对所得的设计进行检查：
·如果yes->转到步骤(5)或通过用野生型序列替换有问题的区域来修正设计，并转到步骤(8)。
(8)合成与病毒设计相对应的DNA序列。
(9)创建病毒构建体并评估病毒表型：
·如果减毒过度，则制备亚克隆构建体并转到9；
·如果减毒不充分，转到2。
在WO 2008/121992和WO 2011/044561中公开了通过降低密码子对偏好性进行的病毒减毒，将其以引用的方式并入。
获得嵌入野生型黄病毒或登革基因组序列中的密码子对去优化序列或者全长黄病毒或登革基因组序列的方法可包括，例如，使用重叠延伸PCR策略或基于长PCR融合策略构建感染性cDNA克隆。
修饰的黄病毒
本发明的各种实施方式提供了修饰的黄病毒，与亲本病毒相比，所述修饰的黄病毒中病毒蛋白的表达降低。表达的降低是重新编码prM、或包膜(E)区、或两者的结果。在一些实施方式中，亲本病毒是野生型黄病毒，并且因此，与野生型病毒或野生型病毒中的序列进行比较。
在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码E蛋白编码序列。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将该密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在其它实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。
在各种实施方式中，重新编码的prM/E蛋白编码序列各自具有小于-0.05、小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。
在某些实施方式中，重新编码的prM蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。
在某些实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。
在某些实施方式中，与亲本prM蛋白编码序列相比，重新编码的prM蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述重新编码的prM蛋白编码序列由所述亲本prM蛋白编码序列衍生而来。
在某些实施方式中，与亲本E蛋白编码序列相比，重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述重新编码的E蛋白编码序列由所述亲本E蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型病毒的E蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，通过相比其亲本病毒而言增加CpG或UpA二核苷酸的数量，来对E蛋白编码序列进行重新编码。在各种实施方式中，通过相比其亲本病毒而言修饰G+C含量，来对E蛋白编码序列进行重新编码。
在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为在病毒宿主(例如人)中较不频繁的同义密码子，来对E蛋白编码序列进行重新编码。
在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为在病毒本身中较不频繁的同义密码子，来对E蛋白编码序列进行重新编码。
在一些实施方式中，在prM蛋白编码序列中用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个、或至少10个、或至少30个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少150个。
在一些实施方式中，在E蛋白编码序列中用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个、或至少10个、或至少30个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少125个、或至少150个、或至少175个。
在各种实施方式中，亲本病毒为黄病毒，所述黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、斯庞德温尼病毒(Spondweni virus)、寨卡病毒、圣路易斯脑炎病毒(Saint Louisencephalitis virus)和波瓦桑病毒(Powassan virus)。在各种实施方式中，亲本病毒为天然分离株。在各种实施方式中，亲本病毒为天然分离株的突变体。
修饰的登革病毒
本发明的各种实施方式提供了修饰的登革病毒作为修饰的黄病毒。
在各种实施方式中，提供了修饰的登革病毒，与亲代病毒相比，在所述修饰的登革病毒中病毒蛋白的表达降低，其中，表达的降低是重新编码prM、或包膜(E)区、或二者的结果。在一些实施方式中，亲本登革病毒是野生型登革病毒。因此，可以参考野生型登革病毒进行比较。
在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码E蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。
本发明的各种实施方式提供了修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含重新编码的prM蛋白、重新编码的包膜(E)蛋白、或两者皆有，其中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，并且其中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，“其亲本蛋白编码序列”为“野生型登革蛋白编码序列”，例如，“野生型登革E蛋白编码序列”、“野生型登革prM蛋白编码序列”。
在各种实施方式中，与其亲本登革病毒相比，prM蛋白、或E蛋白、或两者的表达降低。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.05。在某些实施方式中，与亲本登革病毒的prM蛋白编码序列相比，登革病毒的重新编码的prM蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述重新编码的prM蛋白编码序列由所述亲本登革病毒的prM蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的prM蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的prM蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白具有置换为为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少10个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或55个密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒宿主(例如人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒本身中较不频繁使用的同义密码子。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有15-55个CpG或UpA二核苷酸的增加。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或55个CpG或UpA二核苷酸的增加。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性与其亲本E蛋白编码序列相比降低了至少0.05。在某些实施方式中，与其亲本登革病毒的E蛋白编码序列相比，登革病毒的重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述登革病毒的重新编码的E蛋白编码序列由所述亲本登革病毒的E蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的E蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少10个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个或175个密码子。在一些实施方式中，在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒宿主(例如人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒本身中较不频繁使用的同义密码子。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有5-12个CpG或UpA二核苷酸的增加。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个CpG或UpA二核苷酸的增加。
在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。在某些实施方式中，重新编码的prM蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。在某些实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。
在各种实施方式中，修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。例如，1型和2型、1型和3型、1型和4型、2型和3型、2型和4型、或3型和4型。额外的实例为1型、2型和3型；1型、3型和4型；或2型、3型和4型。在各种实施方式中，修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒(即，1型、2型、3型和4型)。
方法
各种实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予有效剂量的组合物，所述组合物包含如上文和本文所述的本发明的修饰的登革病毒。
在各种实施方式中，所述免疫应答为保护性免疫应答，并且给予103至107的预防有效剂量或治疗有效剂量的权利要求所述的疫苗组合物。在各种实施方式中，所述免疫应答为保护性免疫应答，并且给予103、104、105、106或107的预防有效剂量或治疗有效剂量的权利要求所述的疫苗组合物。在各种实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者给予至少一种佐剂。在各种实施方式中，所述免疫应答是针对异源登革病毒而言交叉保护性的。
各种实施方式提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的(i)通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒登革病毒，或(ii)修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含重新编码的prM蛋白、重新编码的包膜(E)蛋白、或两者皆有，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，并且其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸；以及向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的(i)通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒登革病毒，或(ii)所述修饰的登革病毒，其中，至少所述初次剂量或所述一个或多个加强剂量为所述修饰的登革病毒。
在各种实施方式中，所述一个或多个加强剂量中的第一个在所述初次剂量后约2周进行给予。
在各种实施方式中，与其亲本登革病毒相比，prM蛋白、或E蛋白、或两者的表达降低。在各种实施方式中，所述亲本登革病毒为野生型登革病毒。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.05。在某些实施方式中，与亲本登革病毒的prM蛋白编码序列相比，登革病毒的重新编码的prM蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述登革病毒的重新编码的prM蛋白编码序列由所述亲本登革病毒的prM蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的prM蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的prM蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少10个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或55个密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒宿主(例如人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒本身中较不频繁使用的同义密码子。
在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有15-55个CpG或UpA二核苷酸的增加。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或55个CpG或UpA二核苷酸的增加。在某些实施方式中，与待由其进行计算的prM蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的prM蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性与其亲本E蛋白编码序列相比降低了至少0.05。在某些实施方式中，与其亲本登革病毒的E蛋白编码序列相比，登革病毒的重新编码的E蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述登革病毒的重新编码的E蛋白编码序列由所述亲本登革病毒的E蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的E蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。在各种实施方式中，重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少10个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个或175个密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒宿主(例如人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子。在一些实施方式中，用较不频繁使用的同义密码子进行的置换为在病毒本身中较不频繁使用的同义密码子。
在各种实施方式中，重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有5-12个CpG或UpA二核苷酸的增加。在各种实施方式中，重新编码的prM蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个CpG或UpA二核苷酸的增加。在某些实施方式中，与待由其进行计算的E蛋白编码序列(例如野生型登革病毒的E蛋白编码序列)相比较。
在各种实施方式中，重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。在某些实施方式中，重新编码的prM蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。在某些实施方式中，重新编码的E蛋白编码序列具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。例如，1型和2型、1型和3型、1型和4型、2型和3型、2型和4型、或3型和4型。额外的实例为1型、2型和3型；1型、3型和4型；或2型、3型和4型。在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒(即，1型、2型、3型和4型)。
制备修饰的黄病毒病毒基因组的方法
本发明的各种实施方式提供了制备修饰的黄病毒病毒基因组的方法。所述方法包括：获得编码黄病毒病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码黄病毒病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本黄病毒病毒基因组中，以制备修饰的黄病毒病毒基因组；由此，与所述亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。
本发明的各种实施方式提供了制备修饰的登革病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码登革病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码登革病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本登革病毒基因组中，以制备修饰的登革病毒基因组；由此，与所述亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。
本发明的各种实施方式提供了制备修饰的登革病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码登革病毒包膜蛋白的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸置换到亲本登革病毒基因组中，以制备修饰的登革病毒基因组；从而与所述亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达降低。
根据本发明的各种实施方式，病毒减毒通过由E编码序列的密码子对去优化引起病毒蛋白表达降低来实现。降低编码序列表达的一种方式是通过降低密码子对偏好性，但是也可单独或组合使用其它方法。尽管可改变密码子偏好性，但调节密码子对偏好性是特别有利的。例如，通过密码子偏好性来使病毒减毒通常需要消除普通密码子，因此核苷酸序列的复杂性降低。相反，可在保持更大的序列多样性的同时实现密码子对偏好性的降低或最小化，并因此更好地控制核酸二级结构、退火温度以及其它物理和生化性能。
蛋白编码序列(即，开放阅读框)的密码子对偏好性如上所述进行计算，并在Coleman等，2008中进行了描述。
可以以本领域普通技术人员众所周知的方式确认病毒减毒和诱导保护性免疫应答，包括但不限于本文公开的方法和测定。非限制性实例包括噬斑测定、生长测量、测试动物的致死率降低、以及针对随后的野生型病毒感染的保护。
在各种实施方式中，本发明提供了高度减毒并诱导针对多种登革类型和/或亚型的免疫力的病毒。此类登革病毒变种包括血清群1、血清群2、血清群3和血清群4中的病毒。下文提供了减毒的登革蛋白编码序列的实例。
表4.表达降低的登革病毒基因
| WT编码序列 | 重新编码的编码序列 | |
| 基因 | SEQ ID NO： | SEQ ID NO： |
| DENV1-WT | 1 | |
| DENV1-E-Min | 2 | |
| DENV2-WT | 3 | |
| DENV2-E-Min | 4 | |
| DENV3-WT | 5 | |
| DENV3-E-Min | 6 | |
| DENV4-WT | 7 | |
| DENV4-E-Min | 8 | |
| DENV1-E-W/Min | 9 | |
| DENV2-E-W/Min | 10 | |
| DENV3-E-W/Min | 11 | |
| DENV4-E-W/Min | 12 |
组合物
各种实施方式提供了用于在受试者中诱导免疫应答的黄病毒组合物，所述黄病毒组合物包含如本文所述的本发明的修饰的黄病毒。
各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的黄病毒疫苗组合物，所述黄病毒疫苗组合物包含如本文所述的本发明的修饰的黄病毒。
各种实施方式提供了用于在受试者中诱导免疫应答的修饰的登革病毒组合物，所述修饰的登革病毒组合物包含如上文和本文所述的本发明的修饰的登革病毒，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，所述登革疫苗组合物包含如上文和本文所述的本发明的修饰的登革病毒，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒为1型和2型修饰的登革病毒；1型和3型修饰的登革病毒；1型和4型修饰的登革病毒；2型和3型修饰的登革病毒；2型和4型修饰的登革病毒；3型和4型修饰的登革病毒。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒为1型、2型和3型修饰的登革病毒；1型、2型和4型修饰的登革病毒；1型、3型和4型修饰的登革病毒；或2型、3型和4型修饰的登革病毒。
在各种实施方式中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒；(1型、2型、3型和4型)。
野生型和修饰的登革病毒的非限制性实例在此：
SEQ ID NO:1–DENV-1-VN-BID-V1774-2007(WT)
SEQ ID NO:2–DENV-1-VN-BID-V1774-2007-EMin
SEQ ID NO:3–DENV-2-NI-BID-V533-2005
SEQ ID NO:4–DENV-2-NI-BID-V533-2005-E-Min
SEQ ID NO:5–DENV-3-VE-BID-V2268-2008
SEQ ID NO:6–DENV-3-VE-BID-V2268-2008-E-Min
SEQ ID NO:7–DENV4_Syn_WT
SEQ ID NO:8–DENV-4-EMin
SEQ ID NO:9–DENV-1-VN-BID-V1774-2007-E-W/Min
SEQ ID NO:10–DENV-2-NI-BID-V533-2005-E-W/Min
SEQ ID NO:11–DENV-3-VE-BID-V2268-2008-E-W/Min
SEQ ID NO:12–DENV4_Syn_E-W/Min
本发明提供了用于在受试者中诱导免疫应答的组合物，所述组合物包含本文所述的任何减毒病毒和药学上可接受的载体(carrier)。在各种实施方式中，所述组合物为疫苗组合物并且所述免疫应答是保护性免疫应答。
应该理解的是，本发明的减毒病毒以组合物的形式给予受试者，所述减毒病毒用于在受试者中引起免疫应答(或保护性免疫应答)或者用于使受试者免受病毒相关疾病的影响或降低受病毒相关疾病影响的可能性，所述组合物额外包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：0.01M-0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水(PBS)或0.9％盐水中的一种或多种。此类载体还包括水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。肠胃外运载体(vehicles)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油和不挥发性油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂)等。固体组合物可包含无毒的固体载体，例如，如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。为了以气溶胶给予(例如用于肺和/或鼻内递送)，优选将试剂或组合物与无毒表面活性剂(例如C6-C22脂肪酸的酯或部分酯或者天然甘油酯)和推进剂一起配制。可包括额外的载体(例如卵磷脂)以促进鼻内递送。药学上可接受的载体可进一步包括少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和其它添加剂(例如，如抗菌剂、抗氧化剂和螯合剂)，其提高了活性成分的有效性和/或保存期限。如本领域公知的，可对本发明的组合物进行配制，以便在给予受试者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在本发明的组合物或疫苗组合物的各种实施方式中，所述减毒病毒(i)基本上不改变感染细胞中病毒蛋白的合成和加工；(ii)产生与wt病毒相似的每感染细胞的病毒粒子量；和/或(iii)表现出比wt病毒显著低的病毒粒子特异性感染性。在进一步的实施方式中，所述减毒病毒在宿主动物中诱导与相应的wt病毒基本上相似的免疫应答。
本发明还提供了修饰的宿主细胞系，其被特别分离或工程化以容许在野生型宿主细胞中不能存活的减毒病毒。在其中减毒病毒不能在正常(野生型)宿主细胞中生长的实施方式中，其生长绝对依赖于特定的辅助细胞系。这为生成用于疫苗生产的病毒提供了很高水平的安全性。本发明的修饰的细胞系的各种实施方式容许减毒病毒生长，其中，所述细胞系的基因组被改变以增加编码稀有tRNA的基因的数量。
引发免疫应答的方法
各种实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效剂量的包含本发明的修饰的黄病毒的组合物。特定实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的黄病毒的疫苗组合物。在各种实施方式中，所述免疫应答对异源黄病毒病毒是交叉保护性的。
在各种实施方式中，所述方法进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。本文讨论了佐剂的非限制性实例。特定实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的登革病毒的疫苗组合物。
各种实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予有效剂量的包含本发明的修饰的登革病毒的组合物。
各种实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的登革病毒的疫苗组合物。
在各种实施方式中，所述方法进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。在本文中描述了佐剂的非限制性实例。
在各种实施方式中，所述免疫应答对异源登革病毒是交叉保护性的。
本发明的各种实施方式提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸之外的方法产生的减毒黄病毒或者其中相比亲本病毒而言病毒蛋白表达降低的修饰的黄病毒，其中，表达降低是重新编码prM、或包膜(E)区的结果；以及向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的所述通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸之外的方法产生的减毒黄病毒、或者所述修饰的黄病毒，其中，所述初次剂量或者一个或多个加强剂量至少为所述修饰的病毒。在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量中的第一个。
在各种实施方式中，所述黄病毒为登革病毒。
在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码E蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。
在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加CpG或UpA二核苷酸的数量，来重新编码E蛋白编码序列。在各种实施方式中，重新编码的prM/E蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子偏好性。在各种实施方式中，通过用在病毒宿主(例如人)中较不频繁的同义密码子替换一个或多个密码子，来重新编码E蛋白编码序列中的一个或两个。在一些实施方式中，用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个、或至少10个、或至少30个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个。
另外，本发明提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的本文所述的任何疫苗组合物。本发明还提供了使受试者免受病毒相关疾病影响的方法，所述方法包括向所述受试者给予预防有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。在以上方法的实施方式中，所述受试者已经暴露于病原性病毒。“暴露于”病原性病毒是指与病毒接触，从而可能导致感染。
本发明进一步提供了用于在病毒感染的受试者中延迟与病毒相关的疾病的发作或减缓与病毒相关的疾病的进展速度的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。
如本文所用，“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种进行递送。可例如鼻内、腹膜内、脑内、静脉内、经口、经粘膜、皮下、经皮、皮内、肌内、局部、肠胃外、通过植入、鞘内、淋巴内、病灶内、经心包或硬膜外进行给予。试剂或组合物也可以以气溶胶给予，例如用于肺和/或鼻内递送。给予可例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行。
可例如通过向受试者给予初次剂量的疫苗然后在合适的时间段之后一次或多次后续给予所述疫苗，来实现在受试者中引发保护性免疫应答。疫苗给予之间的合适时间段可由本领域技术人员容易地确定，并且通常为约数周至数月。然而，本发明不限于任何特定的给予方法、途径或频率。
在各种实施方式中，本发明提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸之外的方法产生的减毒黄病毒或者其中相比亲本病毒而言病毒蛋白的表达降低的修饰的黄病毒，其中，表达降低是重新编码prM、或包膜(E)区、或二者的结果；以及向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的所述通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸之外的方法而来的减毒黄病毒或者所述修饰的黄病毒，其中，所述初次剂量或者所述一个或多个加强剂量至少为所述修饰的病毒。
在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，给予2个、3个、4个或5个加强剂量。在各种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。作为非限制性实例，可给予初次剂量；其后约两周可给予第一个加强剂量；在第一个加强剂量后约一个月，可给予第二个加强剂量；在第二个加强剂量后约6个月，可给予第三个加强剂量。作为另一非限制性实例，可给予初次剂量；其后约两周，可给予第一个加强剂量；在第一个加强剂量后约六个月，可给予第二个加强剂量；在第二个加强剂量后约12个月，可给予第三个加强剂量。在进一步的实施方式中，可定期给予额外的加强剂量；例如，每5年、每10年等。
在各种实施方式中，所述黄病毒为登革病毒。在各种实施方式中，所述黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和波瓦桑病毒。
在各种实施方式中，通过使蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性下降来重新编码E蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加CpG或UpA二核苷酸的数量来重新编码E蛋白编码序列。
在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。
在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。
在各种实施方式中，其包括修饰的病毒中CpG二核苷酸的增加。
在各种实施方式中，其包括修饰的病毒中UpA二核苷酸的增加。
在各种实施方式中，重新编码的prM/E蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.06、或小于-0.07、或小于-0.08、或小于-0.09、或小于-0.1、或小于-0.11、或小于-0.12、或小于-0.13、或小于-0.14、或小于-0.15、或小于-0.16、或小于-0.17、或小于-0.18、或小于-0.19、或小于-0.2、或小于-0.25、或小于-0.3、或小于-0.35、或小于-0.4、或小于-0.45、或小于-0.5的密码子对偏好性。
在某些实施方式中，与亲本prM/E蛋白编码序列相比，重新编码的prM蛋白编码序列、E蛋白编码序列或两者的密码子对偏好性降低至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5，所述重新编码的prM蛋白编码序列、E蛋白编码序列或两者由所述亲本prM/E蛋白编码序列衍生而来。
在各种实施方式中，通过用在病毒宿主中较不频繁的同义密码子替换一个或多个密码子来重新编码prM蛋白编码序列、E蛋白编码序列或两者。在一些实施方式中，用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个、或至少10个、或至少30个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个。
在各种实施方式中，将初次剂量皮下、肌内、皮内或鼻内给予。
在各种实施方式中，将一个或多个加强剂量肿瘤内、静脉内或鞘内给予。
初次剂量和加强剂量之间的时间安排可例如根据感染或疾病的阶段(例如，未感染、感染、感染后的天数)以及患者的健康而变化。在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量。即，给予初次剂量，其后约两周，给予加强剂量。
在各种实施方式中，剂量可在初次剂量和加强剂量之间变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初次剂量可包含较少的病毒拷贝。
在其它实施方式中，本发明的修饰的病毒或通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒病毒的类型可在初次剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，本发明的修饰的病毒可用于初次剂量，相同或不同科、属、种、组或目(order)的减毒病毒(通过密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生)可用于加强剂量。
在其它实施方式中，给予途径可在初次剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，可皮下给予初次剂量，并且可通过注射到肿瘤中来给予加强剂量；对于难以接近或难以到达的肿瘤，可静脉内给予加强剂量。
任何本发明的免疫和治疗方法的某些实施方式进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。“佐剂”应指适于在受试者中增强抗原的免疫原性并加强免疫应答的任何试剂。适用于与基于蛋白质和核酸的疫苗一起使用的多种佐剂(包括颗粒状佐剂)以及佐剂与抗原结合的方法是本领域技术人员众所周知的。适用于基于核酸的疫苗的佐剂包括但不限于以纯化的蛋白质或核酸形式递送的白介素-12、Quil A、咪喹莫特、和雷西莫特。适于与蛋白质免疫一起使用的佐剂包括但不限于明矾、弗氏不完全佐剂(FIA)、皂苷、Quil A和QS-21。
本发明还提供了用本发明的减毒病毒免疫受试者的试剂盒。所述试剂盒包含减毒病毒、药学上可接受的载体、施用器和其使用说明材料。在进一步的实施方式中，所述减毒病毒可为一种或多种登革病毒、一种或多种日本脑炎病毒、一种或多种西尼罗病毒、一种或多种黄热病毒、一种或多种寨卡病毒等。当希望针对特定病毒的多种不同分离株对宿主进行免疫，优选多于一种的病毒。本发明包括本领域技术人员已知的试剂盒的其它实施方式。所述说明可提供任何对指导减毒病毒的给予有用的信息。
在整个申请中，已引用了多种出版物、参考文本、教科书、技术手册、专利和专利申请。这些出版物、专利、专利申请和其它文件的教导和公开内容在此通过引用的方式整体并入本申请，以更充分地描述本发明所属的技术状况。然而，本文的参考文献引用不应被理解为承认此类参考文献是本发明的现有技术。
应当理解和期望的是，本领域技术人员可在本文公开的发明原理中进行变型，并且意在将此类修改包括在本发明的范围内。下列实施例进一步对本发明进行说明，但不应解释为以任何方式限制本发明的范围。常规方法的详细描述(例如用于重组质粒构建、用病毒构建体转染宿主细胞、聚合酶链式反应(PCR)和免疫学技术的方法)可以从许多出版物中获得，包括Sambrook等(1989)和Coligan等(1994)。将本文提及的所有参考文献通过引用的方式以其整体并入本申请。WO 2008/121992和WO 2011/044561的内容通过引用的方式并入。
实施例
实施例1
SAVE去优化的减毒活登革疫苗候选物的快速设计和构建。为了选择我们的靶标序列，我们从过去十年中所有DENV病毒分离株的所有prM-E序列开始，并进行了氨基酸共有序列分析，可在NCBI病毒变异数据库中获得。由于共有序列通常从不作为实际病毒存在，因此将其用作我们设计的基础是不明智的。我们优选自然病毒演化来告诉我们什么有效，什么无效。因此，然后使用tblastn算法针对整个Genbank搜索各个血清型的共有序列，以鉴别与共有序列最相同的复制病毒的实际基因组；然后我们使用该序列作为我们的靶标序列。此外，靶标序列在数据库中不能是独特的(可能的测序伪影)，在这种情况下，我们选择由两个以上的独立的病毒分离株代表的与共有序列同一性次高的序列。这种用于确定最相关的和复制的人类分离株的搜索算法产生如下的序列，所述序列为1)真正的人分离株和2)尽可能与DENV序列空间的其余部分同源的单个序列。使用这种方法，我们鉴别了以下病毒，从中选择出靶标prM-E抗原序列：DENV-1/VN/BID-V1774/2007、DENV-2/NI/BID-V533/2005、DENV-3/VE/BID-V2268/2008、DENV-4/US/BID-V2448/1999。我们使用DENV-2/NI/BID-V533/2005的E-Min启动了DENV疫苗程序，并生成了包含通过该过程选择的其它三个E基因的减毒活毒株(图1)。野生型prM/E基因的CPB处于人宿主细胞基因的正常范围内。通过SAVE进行密码子对“去优化”后，得到的去优化的prM/E基因区段现在主要由低度表现的人密码子对编码(由其极负的CPB所证实)，并且与任何人基因都大不相同。从头(de novo)合成图1的SAVE去优化的合成prM/E，并使用重叠PCR分别亚克隆到WT DENV基因组中，产生六个独立的cDNA基因组，每个基因组包含合成的“去优化”片段。我们构建了关于wt DENV1-4的感染性cDNA基因组，然后通过将RNA转染到Vero细胞或BHK细胞中，重新获得了具有完全感染性的复制病毒，以用作去优化的DENV疫苗候选物。
实施例2
利用SAVE平台的灵活性来创建第二代登革病毒疫苗候选物
为了微调减毒和免疫原性，使用SAVE平台构建了第二代登革病毒疫苗候选物(图2)。第二代登革疫苗候选物利用SAVE平台的灵活性，将去优化区域从2014bp(E-min)降低到997bp(W-E-Min)或进一步降低到664bp(W-W-E-Min)，同时保持同源骨架中的氨基酸序列100％相同。
实施例3
异源骨架登革疫苗候选物在无动物成分条件下在Vero细胞中的生长
为了优化未来cGMP生产的生产条件并在体外对减毒进行测试，将DENV1-4 E-Min用于在无动物成分条件下以0.01的MOI感染Vero细胞，并在感染后10天的过程中以多步生长曲线每天滴定上清液。DENV2、DENV3和DENV4候选物的滴度达到1-2×105FFU/mL，而DENV1E-Min滴度与其它候选者相比降低了～1log10(图3)。
实施例4
Vero细胞中同源骨架登革病毒1型疫苗候选物的生长和作为减毒机制的温度敏感性测试
将在低(33℃)、中(37℃)和高(39℃)温度下进行的生长动力学用于以下：对去优化的候选物的生产条件进行优化，在体外对减毒进行测试并关于增加的温度敏感性对CPD变体进行检查(作为解释减毒机制的手段)。在Vero细胞中对合成DENV1 WT病毒(全长DENV1骨架中)和由DENV1 WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV1 EW/MIN和E-MIN进行多步生长曲线。合成DENV1 WT在33℃和37℃下在Vero细胞中生长良好。对DENV而言典型地，在39℃时观察到病毒产量的短暂降低，但是，滴度在7dpi时恢复到37℃水平。然而，在33℃和37℃下，DENV1 E-W/MIN的可用滴度达到比DENV1 WT低约10倍。DENV1 E-MIN在Vero细胞中高度减毒，并且仅在感染后第10-14天开始在33℃时达到可检测的滴度。
实施例5
Vero细胞中同源骨架登革病毒2型疫苗候选物的生长和作为减毒机制的温度敏感性测试
将在低(33℃)、中(37℃)和高(39℃)温度下进行的生长动力学用于以下：对去优化的候选物的生产条件进行优化，在体外对减毒进行测试并关于增加的温度敏感性对CPD变体进行检查(作为解释减毒机制的手段)。在Vero细胞中对合成DENV2 WT病毒(在全长的同源DENV2骨架中)和由DENV2 WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV2 E-W/MIN和E-MIN进行多步生长曲线。DENV2 E-W/MIN和E-MIN在体外均减毒，E-W/MIN具有1-2log10 FFU/mL的降低，DENV2 E-MIN具有更明显的2-3log10 FFU/mL降低(图3)。虽然生长动力学被延迟，但每1-2天定期更换培养基，对于DENV2 E-W/MIN，病毒滴度达到>106FFU/mL。重要的是，减毒与E区中的去优化程度相关。虽然DENV2-WT和DENV2 E-W/MIN直到感染后第4天的温度敏感性(37℃和39℃下的滴度之间的差异)相似，但在第5、6和7天存在显著差异。对于DENV2 E-MIN，没有观测到温度敏感性，因为在任何温度下直到6DPI都没有复制。然而，从第7-14天开始，DENV2 E-MIN开始产生可检测的病毒(但仅在33℃和37℃)。
实施例6
Vero细胞中同源骨架登革病毒3型疫苗候选物的生长和作为减毒机制的温度敏感性测试
将在低(33℃)、中(37℃)和高(39℃)温度下进行的生长动力学用于以下：对去优化的候选物的生产条件进行优化，在体外对减毒进行测试并关于增加的温度敏感性对CPD变体进行检查(作为解释减毒机制的手段)。在Vero细胞中对合成DENV3 WT病毒(在全长DENV3骨架中)和由DENV3 WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV3 E-W/MIN和E-MIN进行多步生长曲线。明显地，DENV3 E-W/MIN在39℃时比WT对温度更敏感，在感染后第3、4、5和7天有可观测的显著更大的差异。由于DENV3 E-MIN在39℃下在Vero细胞中的复制水平最小，因此从37℃到39℃的病毒产量差异高达107FFU/mL。然而，当在容许的温度下生长时，DENV3E-MIN达到了高滴度，这对于cGMP制造而言有希望。
实施例7
Vero细胞中同源骨架登革病毒4型疫苗候选物的生长和作为减毒机制的温度敏感性测试
将在低(33℃)、中(37℃)和高(39℃)温度下进行的生长动力学用于如下：对去优化的候选物的生产条件进行优化，在体外对减毒进行测试并关于增加的温度敏感性对CPD变体进行检查(作为解释减毒机制的手段)。在Vero细胞中对合成DENV4 WT病毒(在全长DENV4骨架中)和由DENV4 WT衍生而来的减毒活疫苗候选物DENV4 E-W/MIN和E-MIN进行多步生长曲线。DENV4 WT和E-W/MIN在Vero细胞中都生长至高滴度，其中在33℃和37℃下，DENV4 E-W/MIN的峰值滴度约低10倍，但仍然高(～107FFU/mL)。两种病毒在39℃下都受到部分限制，但没有达到DENV1-3所见的程度。在第5天，与WT相比，观测到从37℃到39℃的滴度的小但显著的变化(～5倍)。DENV4 E-MIN在Vero细胞中减毒，峰值滴度比WT低100倍。DENV4 E-MIN在33℃和37℃的复制相似，但是，DENV4 E-MIN在39℃下不存活，在感染后第1-14天没能检测到病毒。
实施例8
评价DENV2疫苗候选物在AG129小鼠中的减毒、免疫原性和功效
如上所述，AG129成年小鼠模型正在获得黄病毒疫苗和治疗学研究的认可。我们使用AG129小鼠来测试：1)剂量为106的各种合成来源的野生型病毒DENV(阳性对照)；2)两种剂量(104和106PFU)的疫苗候选物。在整个实验过程中，每天收集存活、体重和临床体征数据。SAVE去优化的DENV毒株相比合成的野生型病毒而言减毒。基于DENV2 16681骨架的DENV-2E-min已被证明在新生ICR小鼠中具有免疫原性并减毒。在这项免疫原性/剂量递增研究中，该疫苗首次在AG129小鼠中进行了评价。用两种不同浓度的DENV-2E-min或DENV-216681免疫动物。确定了产生的中和抗体滴度，并评价了针对DENV2的小鼠适应的致死毒株D2S10所提供的保护功效[3]。用任一剂量的任一病毒免疫的动物均未显示出临床体征。在第一次免疫后两天从经免疫的小鼠收集血清并通过RT-PCR确定病毒血症。在55％(5/9)的用较高接种量的DENV-2 16681免疫的动物和11％(1/9)的接受较低接种量的动物中检测到病毒RNA，但在用DENV-2E-min免疫的任何小鼠中均未检测到。使用的RT-PCR引物不靶向该病毒中密码子去优化的病毒E基因，并且它们成功地扩增了测定中包含的DENV-2E-min病毒RNA。因此，我们不认为本研究中病毒血症的检测的缺乏是RT-PCR扩增不理想的结果，而是表明疫苗病毒在体内产生了非常低水平的病毒血症。免疫方案完成后，在病毒攻击之前从所有小鼠收集血清。在用D2S10进行病毒攻击之前，所有经免疫动物都具有可检测的DENV-2中和抗体滴度。各个疫苗组的数据散点图表明，随着DENV-2E-min和DENV-2 16681两者的疫苗剂量的增加，中和抗体滴度增加，并且在经E-min免疫的小鼠中观察到的滴度低于用相应剂量的DENV-2 16681免疫的小鼠中的滴度。溶媒对照组中的动物发展出快速进行性感染，所有动物均死亡。用低剂量DENV-2E-min疫苗免疫的小鼠没有受到保护，它们经历与在溶媒对照中观察到的没有显著差异的平均死亡天数(MDD)和高致死率(67％)。相比之下，用高剂量DENV-2 E-min疫苗和两种剂量的DENV-2 16681免疫的动物经历对DENV-2 D2S10攻击的显著的保护。在30天的观察期期间，在这些组中的任何一个组中，都没有致死或如体重减轻>10％所指示的发病。正如预期的，在采样的两天，在所有溶媒对照动物的血清中都检测到了高水平的病毒RNA。在这两天用较低剂量的E-min免疫的所有动物中也检测到了病毒RNA。这些动物中的水平在第2天与对照中的水平相当，但在第3天显著较低。对于用高剂量E-min免疫的动物，第2天在2/4动物的血清中检测到病毒RNA，并且在病毒血症动物中RNA水平显著低于对照。第3天，在任何高剂量E-min动物的血清中均未检测到病毒RNA。总体而言，用高剂量E-min进行的免疫显著降低了检测到病毒血症的动物数量(2/8vs 8/8；p<0.01)。对于用DENV-2 16681免疫的小鼠，在采样的两天中的任何一天中，在任一免疫剂量下，任何动物的血清中均未检测到病毒RNA。
实施例9
AG129小鼠中密码子对去优化的滴定产生改进的DENV2疫苗候选物
为了提高我们的DENV2候选物的临床相关性，我们接下来构建了D2-E-min和D2-1/2-E-min，具有在异源DENV2 16681骨架中的来源自DENV-2/NI/BID-V533/2005的E序列。我们测试了D2-1/2-E-min，其具有由一半wt DENV-2/NI/BID-V533/2005序列和一半CPD组成的E区以提高我们病毒的免疫原性，因为先前的研究表明，可以通过减少CPD序列而在DENV2中滴定减毒程度。用106或104FFU的D2-E-min、D2-1/2-E-min或D2-WTE(具有WT DENV-2/NI/BID-V533/2005E区的DENV2 16681骨架)对AG129和BALB/c小鼠(n＝5)进行免疫接种。有趣的是，新式的DENV-2/NI/BID-V533/2005E区的引入引起毒力增加，所有用106或104FFU进行感染的AG129小鼠都需要安乐死。在受感染的BALB/c小鼠或任何CPD DENV2组中未观测到致死或发病。
与免疫接种D2-E-Min的AG129小鼠相比，E区中CPD序列的减少与来自D2-1/2-E-min的血清的PRNT50值显著(约4倍)增加(p＝-0.0002，学生t检验)相关。此外，由于在106(GM＝3447)和104(GM＝2867)FFU免疫接种组之间没有观测到显著差异，因此在D2-1/2-E-min免疫接种中维持了高中和抗体滴度。在具有免疫能力的BALB/c小鼠中，D2-E-min和D2-1/2-E-min均产生与野生型相当的中和抗体水平。
实施例10
在AG129小鼠中DENV3疫苗候选物的免疫原性和保护功效的评价
AG129小鼠用于测试DENV-3疫苗候选物DENV D2/D3-E-min的免疫原性和保护功效，所述DENV D2/D3-E-min包含具有来自DENV-3/VE/BID-V2268/2008的密码子去优化的prME盒的DENV-2毒株16681骨架。本研究被设计为评价这种候选疫苗针对有毒力的DENV-3CO360/94攻击的功效和免疫原性。所有动物都良好地耐受了第一次免疫，没有重大相关的体重减轻，并且没有动物发展出临床体征。在第二次免疫后观察到了类似的结果，但出乎意料的是，第3组(106FFU DENV D2/D3-WT)中的一只动物在免疫后第2天发展出快速进行性体重减轻并变得垂死，需要进行安乐死。来自同一组的第二只动物随后在免疫后两周和在用有毒力的DENV-3攻击之前意外死亡。在用1.2×107PFU DENV-3CO360/94进行致死性攻击后，溶媒对照组的动物发展出快速进行性感染，在8/9的动物中是致死的，其中死亡的动物的平均死亡天数(MDD)为4.0±0.8天。用较高接种量的DENV D2/D3-E-min进行免疫提供了显著的保护，在组中的动物中没有致死或发病(通过>10％的体重减轻来衡量)。用较低接种量的DENV D2/D3-E-min进行的免疫也是保护性的，只有一只动物发展出致死感染。在DENV-3攻击之前接受DENV D2/D3-WT病毒的动物也受到保护，在任一组中均无致死，尽管较高接种量组中的2只动物失去了>10％的其原始体重。
实施例11
AG129小鼠中的DENV4疫苗候选物的免疫原性和保护功效的评价
将AG129小鼠(n＝12)用于测试异源D2/D4-E-min和D2/D4-1/2-E-Min病毒与D2/D4-WTE(n＝12)和溶媒免疫的模拟对照小鼠(n＝9)相比而言的免疫原性和保护功效，以106FFU的剂量皮下递送。在研究的第0天和第21天对所有小鼠进行免疫，并在第2天收集血清以确定病毒血症，并在第35天收集血清用于中和抗体的滴定。在第35天，用腹膜内注射107PFU DENV4 703/4来攻击小鼠。对受攻击的小鼠进行称重并监测发病，以评估病毒攻击的影响。此外，在攻击后第2天麻醉每组的5只动物并通过眶后取血收集血液，并在第3天对剩余的动物进行，以通过qRT-PCR确定病毒血症水平。在攻击后第30天，研究结束，并从所有存活动物收集血清用于确定攻击后PRNT50值。所有动物组对所有毒株的第一次免疫都良好耐受，在5天的观察期内没有持续的体重减轻，但是，在D2/D4-WTE组中，一只小鼠必须在第二次免疫之前施安乐死并且额外的动物在第二次免疫后死亡。任何其它疫苗组中的动物都没有经历进行性体重减轻。在攻击后2天(DPC)，在接种D2/D4-WTE的4/12小鼠中检测到病毒血症。对于用其它两种病毒免疫的所有小鼠，病毒血症水平低于测定的检测限(500个基因组当量/mL)。DENV-4 703/4攻击在溶媒对照组中产生了具有普遍致死性的快速进行性感染。此外，用D2/D4-E-min免疫的三只动物经历了致死感染，而该组中的其它动物在研究期间保持健康。重要的是，在DENV-4 703/4攻击后，在任何D2/D4-1/2-E-min免疫动物中均未观察到由体重减轻确定的发病证据或致死。
实施例12
A129小鼠中同源DENV1-4疫苗候选物的免疫原性
我们已经测试了DENV1-4 WT以及DENV2-4的疫苗候选物在IFNα受体敲除小鼠中的免疫原性。所有WT病毒在这些小鼠中均具有高度免疫原性，中和抗体滴度>1024。DENV2-E-W/MIN在106和104FFU剂量下与DENV2 WT病毒具有同等的免疫原性。DENV3病毒的免疫原性随着剂量的减少和去优化的增加而减弱，但是，DENV3 E-W/MIN在104FFU剂量(～1024FRNT50)下仍然具有高度免疫原性。我们注意到与DENV2 16681骨架中的异源DENV4 WT(在A129小鼠中的免疫原性差)相比，DENV4 E-W/MIN和WT的免疫原性显著改善。
实施例13
AG129小鼠中的四价免疫接种和对DENV3攻击的功效
AG129小鼠是IFNα/β和IFNγ受体双敲除的纯合子，由于对感染的易感性增加而通常用于测试黄病毒疫苗候选物。我们使用AG129小鼠以通过以下测试我们的DENV疫苗的四价制剂：在第0天和第21天用106IFU单价D2/D3-E-min疫苗(N＝16；10只雄性和6只雌性)、含有四种单价DENV E-min病毒各106IFU的四价疫苗(N＝16；10只雄性和6只雌性)、或用溶媒(N＝13；8只雄性和5只雌性)对它们进行免疫接种。所有动物都良好地耐受了两种免疫，没有动物发展出临床体征，也没有明显的体重减轻(≥10％)。在攻击前收集血清以通过FRNT50测量中和抗体。所有用单价疫苗免疫的小鼠都发展出可检测的中和抗体滴度(范围20-160)。在用四价疫苗制剂免疫的小鼠中，滴度通常较低(范围<20-80)。在第35天，所有剩余的小鼠都由通过腹膜内途径递送的107IFU DENV3 CO360/94进行攻击。正如预期的那样，溶媒对照组的动物发展出快速进行性感染，在8/9(89％)的动物中致死，死亡的动物中的平均死亡天数(MDD)为4.1±0.4天。用单价DENV D2/D3-E-min或四价疫苗免疫在任一组的动物中提供了显著的保护，没有致死或发病(通过>10％的体重减轻来衡量)。在8/9的对照动物中检测到病毒RNA，攻击后第2天和第3天的滴度相当。
实施例14
同源疫苗的各个毒株和四价的体内LD50数据显示神经减毒。用10μL接种量的含有如所示剂量的合成wt DENV1-4病毒对一周龄的小鼠进行注射。对每只小鼠每天称重长达2周，并尽可能通过人道早期终点(没有体重增加、麻痹、后肢麻痹)确定死亡率。
以上在详细描述中描述了本发明的各种实施方式。尽管这些描述直接描述了以上实施方式，但应当理解，本领域技术人员可想到本文示出和描述的特定实施方式的修改和/或变化。也意图将落入本说明书范围内的任何此类修改或变化包括在其中。除非特别指出，否则本发明人的意图是，说明书和权利要求中的词语和短语被赋予对于适用领域的普通技术人员而言普通和通常的含义。
已经提出了申请人在提交申请时此时已知的本发明的多种实施方式的前述描述，并且其意在用于说明和描述的目的。本说明书不旨在是穷尽的，也不旨在将本发明限制为所公开的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。所描述的实施方式用于解释本发明的原理及其实际应用，并且使本领域的其他技术人员能够在各种实施方式中以适于预期的特定用途的各种修改来利用本发明。因此，意图是本发明不限于所公开的用于实施本发明的特定实施方式。
尽管已经示出并描述了本发明的特定实施方式，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，基于本文的教导，可在不脱离本发明及其更广泛的方面的情况下做出改变和修改，因此，所附权利要求将所有此类改变和修改都包含在它们的范围内，因为其在本发明的真实精神和范围内。本领域技术人员将理解的是，通常，本文中使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应被解释为“包含但不限于”，等)。
如本文中使用的术语“包含”用于提及对实施方式有用的组合物、方法及其相应的组成部分，但对包括未指定的要素(无论是否有用)是开放的。本领域技术人员将理解，通常，本文中使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该解释为“至少具有”，术语“包含”应被解释为“包含但不限于”，等)。尽管本文中使用开放式术语“包含”作为诸如包括、含有或具有的术语的同义术语来描述和要求保护本发明，但可替代地使用其它诸如“由…组成”或“基本上由…组成”的术语来描述本发明或其实施方式。
序列表
<110> 柯达金尼克斯有限公司（CODAGENIX INC.）
MUELLER, Steffen
COLEMAN, John Robert
STAUFT, Charles
WANG, Ying
<120> 减毒登革病毒
<130> 064955-000009WO00
<150> 62/866,477
<151> 2019-06-25
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10735
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 1
agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60
ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggc 120
tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180
ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240
tttcatagca ttcctaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300
gggttcattc aagaagagtg gagcgatcaa agtgctacgg ggtttcaaga aagaaatctc 360
aaacatgttg aatataatga atagaaggaa aagatctgtg accatgctcc ttatgctgat 420
gcctacagcc ttggcgttcc atttgactac acgaggggga gagccgcaca tgatagtcag 480
caagcaggaa agaggaaagt cactcttgtt taagacctca gcaggtgtca acatgtgcac 540
ccttatagcg atggatttgg gagagttatg tgaggacaca atgacttaca aatgccctcg 600
aatcactgaa actgaaccag atgacgttga ttgttggtgt aatgccacag acacatgggt 660
gacctatgga acatgttccc aaactggcga gcaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcact 720
ggccccacac gtgggacttg gtttggaaac aagaaccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780
cgcttggaaa cagatacaaa gagtggagac ttgggccctg agacacccag gattcacggt 840
gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggattatttt 900
cattttgtta atgctggtaa caccatccat ggccatgcga tgcgtgggaa taggcagcag 960
ggacttcgtg gaaggactgt caggagcaac ttgggtagat gtggtactgg aacatggaag 1020
ttgcgtcacc accatggcaa aagacaaacc aacattggac attgaactct tgaagacgga 1080
agtcacaaac cctgccgtcc tgcgcaaact gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140
caccgactca agatgtccaa cacaaggaga agccacacta gtggaagaac aagacgcgaa 1200
ctttgtgtgt cgacgaacgt ttgtggacag aggctggggc aatggctgtg gcctcttcgg 1260
aaaaggaagc ctaataacgt gtgcaaagtt caagtgtgtg acaaaactgg aaggaaagat 1320
agttcaatat gagaacttga aatattcagt aatagtcacc gttcacaccg gagaccagca 1380
tcaagtggga aatgaaagca cagaacatgg gacaactgca actataacac ctcaagctcc 1440
tacgacggaa atacagctga ccgactacgg agctcttaca ttggattgtt cacctagaac 1500
aggactagac tttaatgaaa tggtgttgtt gacaatgaaa gaaaaatcat ggctagtcca 1560
caaacaatgg tttttagacc taccactgcc ttggacctcg ggagcttcaa catcacaaga 1620
gacttggaac agacaagatt tgctggtgac atttaagaca gctcatgcaa agaagcagga 1680
agtagtcgta ctaggatcac aagaaggagc aatgcacact gcgttgaccg gagcgacaga 1740
aatccaaacg tctggaacga caacaatttt tgcaggacac ttgaaatgca gactaaagat 1800
ggacaaactg actctaaaag ggatgtcata tgtgatgtgc acaggctcat tcaagctaga 1860
gaaagaagtg gctgagaccc agcatggaac cgttctagtg cagattaaat acgaaggaac 1920
agatgcacca tgcaagatcc ctttttcgac ccaagatgaa aaaggagtaa cccagaatgg 1980
gagattgata acagctaacc ccatagttac tgacaaagaa aaaccagtca acattgaggc 2040
agaaccgccc tttggtgaga gttacatcgt aataggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100
aagctggttc aagaaaggaa gcagcatagg gaaaatgttt gaggcaactg ccagaggagc 2160
acgaaggatg gccatactgg gagacaccgc atgggacttt ggttctatag gaggagtgtt 2220
cacgtctgtt ggaaaattag tacaccagat ttttggaact gcatatggag ttttgttcag 2280
cggtgtttcc tggaccatga aaataggaat aggggttctg ctgacatggc tgggattaaa 2340
ctcaaggagc acgtcccttt cgatgacgtg cattgcagtt ggcctagtaa cactatacct 2400
aggagtcatg gttcaggcgg attcaggatg tgtaattaat tggaaaggta gagaactcaa 2460
gtgtggaagt ggcatttttg tcaccaatga agttcacact tggacagagc aatacaaatt 2520
tcaagctgac tcccctaaga gactatcagc agccatcggg aaggcatggg aggagggtgt 2580
gtgtggaatt cgatcagcaa ctcgtctcga gaacatcatg tggaagcaaa tatcaaatga 2640
actgaatcac atcttacttg aaaatgatat gaaattcaca gtggttgtag gagatgttgc 2700
tgggatcttg gctcaaggaa agaaaatgat taggccacaa cccatggaat acaaatactc 2760
gtggaaaagc tggggaaagg ctaaaatcat aggggcagat gtacagaaca ccaccttcat 2820
catcgatggc ccaaacaccc cagaatgccc tgatgaccaa agagcatgga acatttggga 2880
agttgaggac tatggatttg gaattttcac gacaaacata tggctgaaat tgcgtgattc 2940
ctacacccaa gtgtgtgacc accggctaat gtcagctgcc atcaaggaca gcaaggcagt 3000
tcacgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacctgga agctggcaag 3060
agcctcattc atagaagtta aaacatgtat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120
tggagttctg gaaagtgaaa tgataattcc aaagatctat ggaggaccaa tatctcagca 3180
caactacaga ccaggatatt ttacacaagc agcagggccg tggcacctag gcaagttgga 3240
actggatttt gatttgtgtg agggtaccac agttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3300
aggaccatct cttaggacca caacagtcac aggaaagata attcatgaat ggtgttgcag 3360
atcttgcacg ctaccaccct tacgtttcag aggagaagat gggtgctggt acggtatgga 3420
aatcagacca gtcaaggaaa aggaagaaaa tctagtcaaa tcaatggtct ctgcagggtc 3480
aggggaagtg gacagctttt cactaggact gctatgcata tcaataatga tcgaggaggt 3540
gatgagatcc agatggagta gaagaatgct gatgactgga acactggctg tgttcttcct 3600
tctcataatg ggacaattga catggaacga tctgatcaga ttatgcatca tggttggagc 3660
caacgcttcc gacaggatgg ggatgggaac gacgtaccta gccctgatgg ccacttttaa 3720
aatgagaccg atgttcgctg tagggctatt atttcgcaga ctaacatcca gagaagttct 3780
tcttctaaca attggattga gtctagtggc atctgtggag ttaccaaatt ccttggagga 3840
gctgggggat ggacttgcaa tgggcattat gattttaaaa ttattgactg actttcaatc 3900
acatcagctg tgggctacct tgctgtcctt gacatttatc aaaacaacgt tttccttgca 3960
ctacgcatgg aagacaatgg ctatggtact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020
gtccacgacc tcccaaaaaa caacatggct tccggtgcta ttgggatccc ttggatgcaa 4080
accactaacc atgtttctta tagcagaaaa caaaatctgg ggaaggagaa gttggcccct 4140
caatgaagga atcatggctg ttggaatagt cagcatccta ctaagttcac tcctcaaaaa 4200
tgatgtaccg ctagctgggc cactaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgttat 4260
atctggaagc tcagccgacc tatcattaga gaaagcggct gaggtctcct gggaagaaga 4320
agcagaacac tctggtgcct cacacaacat attagtggaa gtccaagatg atggaaccat 4380
gaagataaag gatgaagaga gagatgacac gctaaccatt ctccttaaag caactctgtt 4440
agcagtttca ggggtgtacc cattatcaat accagcgacc cttttcgtgt ggtacttttg 4500
gcagaaaaag aaacagagat ctggagtgtt atgggacaca cccagccctc cagaagtgga 4560
aagagcagtt cttgatgatg gtatctatag aattatgcag agaggactgt tgggcaggtc 4620
ccaagtaggg gtaggagttt tccaagaaaa cgtgttccac acaatgtggc atgtcaccag 4680
gggagctgta ctcatgtatc aagggaagag attggaaccg agctgggcca gtgtcaaaaa 4740
agacctgatc tcatatggag gaggttggag gcttcaagga tcctggaaca caggagaaga 4800
agtgcaggtg attgctgttg aaccagggaa aaaccccaaa aatgtacaaa cagcgccggg 4860
cacctttaag acccctgaag gtgaagttgg agccattgcc ctagacttta aacctggcac 4920
atctggatct cccatcgtga acagagaagg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980
agtgacaaca agtggaacct acgtcagtgc catagctcaa gccaaagcat cacaagaagg 5040
gcccctacca gagattgaag acgaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100
acatccagga tcggggaaaa caagaagata tcttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160
aaggaagctg cgcacactaa tcctggctcc cacaagggtt gtcgcttccg aaatggcaga 5220
ggcgctcaag ggaatgccaa taaggtacca aacaacagca gtgaagagtg aacatacagg 5280
aaaagagata gttgacctca tgtgtcacgc cactttcacc atgcgcctcc tgtctcccgt 5340
aagagttccc aattacaaca tgatcatcat ggatgaagca catttcaccg atccatccag 5400
tatagcggcc agagggtaca tctcaacccg agtgggcatg ggtgaagcag ctgcaatctt 5460
catgacagcc actcccccag gatcagtgga ggcctttcca cagagcaacg cagttatcca 5520
agatgaggaa agagacattc ctgagagatc atggaactca ggctatgagt ggatcactga 5580
cttcccaggt aaaacagttt ggtttgttcc aagcattaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640
ctgcttaaga aagaatggga aacgggtgat tcaattgagc aggaaaacct ttgatacaga 5700
gtaccaaaaa acaaaaaaca acgactggga ctacgtcgtc acaacagaca tctccgaaat 5760
gggagcaaat ttccgagccg acagggtgat agacccaaga cggtgtctga aaccggtaat 5820
actaaaagat ggtccagagc gtgtcatttt agcaggacca atgccagtga ctgtggccag 5880
tgccgctcag aggagaggaa gaattggaag gaaccacaat aaggaaggtg atcagtacat 5940
ctacatggga cagcctttaa acaacgatga agatcacgct cactggacag aagcaaaaat 6000
gctccttgat aatataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccagagag 6060
agaaaagagt gcagcaatag acggggaata cagactgcgg ggtgaagcaa ggaaaacgtt 6120
tgtggagctc atgagaagag gagatctacc tgtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180
aggcttccag tactctgaca gaagatggtg ctttgacggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240
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ccgctggctg gatgccagaa catactcaga cccactagcc ctgcgcgagt ttaaagagtt 6360
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acacttgacg caaagggccc agaatgccct ggacaacctg gttatgttgc acaactccga 6480
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gatgctccta gctttgatag ctgtgttaac tggtggagtg acactgttct tcctatcagg 6600
aaggggccta gggaaaacat ctatcggcct actctgcgta atggcttcaa gcgtactgct 6660
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tgccgcaatg ctggacgtag acttacatcc agcttcagcc tggaccctct atgcagtggc 6960
cacaacaatt atcactccca tgatgaggca cacaatcgaa aacacaacgg caaacatttc 7020
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ggcgacctat ggatggaacc tagtaaagct gcactctggg aaagacgtat tttttatacc 7980
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ggtaagggta cagagaccag caaaaaatgg aaccgtgatg gatgtcatat ccagacgtga 9360
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tatgaaggat gggagggaaa tagtggtgcc atgccgcaac caagatgaac ttgtgggtag 9780
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ccatgcccat caccaatgga tgacaacaga agacatgctg tcagtgtgga atagggtttg 10020
gatagaggaa aacccatgga tggaggacaa aacccacata tccagttggg gagatgttcc 10080
atatttagga aaaagggaag accaatggtg tggatccctg ataggcttaa cagcaagggc 10140
cacctgggcc accaacatac aagtggccat aaaccaagtg agaagactaa ttgggaatga 10200
gaattatcta gattacatga catcaatgaa gagattcaag aacgagagtg atcccgaagg 10260
ggcactctgg tgagtcaaca catttacaaa ataaaggaaa ataagaaatc aaacaaggca 10320
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gctccatcgt ggggatgtaa aaacctggga ggctgcaacc catggaagct gtacgcatgg 10500
ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccgaaaca taacgcagca gcggggccca 10560
acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcat 10620
aacaataaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680
attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735
<210> 2
<211> 10735
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 2
agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60
ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggc 120
tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180
ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240
tttcatagca ttcctaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300
gggttcattc aagaagagtg gagcgatcaa agtgctacgg ggtttcaaga aagaaatctc 360
aaacatgttg aatataatga atagaaggaa aagatctgtg accatgctcc ttatgctgat 420
gcctacagcc ttggcgttcc atttgactac acgaggggga gagccgcaca tgatagtcag 480
caagcaggaa agaggaaagt cactcttgtt taagacctca gcaggtgtca acatgtgcac 540
ccttatagcg atggatttgg gagagttatg tgaggacaca atgacttaca aatgccctcg 600
aatcactgaa actgaaccag atgacgttga ttgttggtgt aatgccacag acacatgggt 660
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cgcttggaaa cagatacaaa gagtggagac ttgggccctg agacacccag gattcacggt 840
gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggattatttt 900
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atgcgttacg actatggcta aagacaaacc tacactagac atagagttac tgaaaaccga 1080
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tacagactct aggtgtccta cacaaggcga agcgacattg gtcgaagaac aggacgctaa 1200
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ggacaaactg acacttaaag gaatgtcata cgttatgtgt acgggatcct ttaagctcga 1860
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cggagtgtca tggactatga agatagggat aggagtgcta ttgacatggc tcggactgaa 2340
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tcaagctgac tcccctaaga gactatcagc agccatcggg aaggcatggg aggagggtgt 2580
gtgtggaatt cgatcagcaa ctcgtctcga gaacatcatg tggaagcaaa tatcaaatga 2640
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aatcagacca gtcaaggaaa aggaagaaaa tctagtcaaa tcaatggtct ctgcagggtc 3480
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gatgagatcc agatggagta gaagaatgct gatgactgga acactggctg tgttcttcct 3600
tctcataatg ggacaattga catggaacga tctgatcaga ttatgcatca tggttggagc 3660
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gtccacgacc tcccaaaaaa caacatggct tccggtgcta ttgggatccc ttggatgcaa 4080
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gccgaaccac cattcggaga ctcatacata ataatcggag tcgaacccgg acaattgaaa 2100
ctgaattggt ttaaaaaagg gtcatcaatc ggacaaatgt tcgaaacaac tatgagaggc 2160
gctaagcgta tggctatact cggagacaca gcatgggact tcggatcctt agggggagtg 2220
tttacgtcaa tcggtaaggc actacaccag gtattcggag cgatatacgg agccgcattt 2280
agcggagtgt cgtggacaat gaagatactg atcggagtga taatcacatg gatcggaatg 2340
aatagtaggt ctacaagtct atccgttagc ttagtgttag tcggagtcgt tacactgtat 2400
ctaggcgcta tggtgcaagc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa taaagaactg 2460
aaatgtggca gcgggatctt catcacagat aacgtacaca catggacaga acaatataag 2520
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atttgtggaa tccgctcagt aacaagattg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640
gaattgaatc atattctatc agaaaatgag gtaaagttga ccattatgac aggagacatt 2700
agaggaatca tgcaggcagg aaaacgatcc ttgcggcccc agcccactga gctgaagtac 2760
tcatggaaaa catggggaaa ggcgaaaatg ctctccacag agtctcacaa tcagaccttt 2820
cttattgatg gccctgaaac agcagaatgc cccaacacaa acagagcctg gaactcgctg 2880
gaagttgaag actatggttt tggagttttc accaccaata tatggctgaa attgagagaa 2940
aaacaggatg tattttgtga ctcaaaactc atgtcagcgg ccattaaaga caacagagcc 3000
gttcatgctg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatggag 3060
aaagcctcct tcattgaagt taaaagctgc cactggccaa agtcacacac cctttggagc 3120
aatggagtat tagaaagtga gatgataatc ccaaaaaatt ttgccgggcc agtgtcacaa 3180
cacaactaca gaccaggcta ccatacacaa acagcaggac cttggcatct aggtaagctt 3240
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caggcagaaa tatcaggaag cagcccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggcagc 4380
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atgtactggg tatctaatgc caccgggaac atagtgtcat cagtgaacat gatttcaagg 8280
atgttgatta acagattcac aatgaaacac aagaaagcca cttacgagcc agatgttgac 8340
ctaggaagtg gaacccgcaa cattggaatt gaaagtgaga taccaaatct agacataata 8400
ggaaagagaa tagagaaaat aaaacaagag catgaaacat catggcacta tgatcaagac 8460
cacccataca aaacgtgggc ttaccatggc agctatgaaa caaaacaaac tggatcagca 8520
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gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccttttggac aacagcgcgt tttcaaagag 8640
aaagtagaca cgagaaccca agaaccgaag gaaggcacaa agaaactgat gaaaattacg 8700
gcagagtggc tttggaaaga actaggaaag aaaaagacac ctaggatgtg taccagagaa 8760
gaattcacaa gaaaagtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820
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caaagaggca gtgggcaagt cggcacctat ggccttaata ccttcaccaa tatggaagcc 9420
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atccaagaaa acccgtggat ggaagataaa actccagtgg aatcatggga agaagtccca 10080
tacttgggaa aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggctaac aagcagggct 10140
acctgggcaa agaacatcca aacagcaata aatcaagtca gatcccttat aggcaatgag 10200
gaatacacag actacatgcc atccatgaag agatttagaa gggaagagga agaggcaggt 10260
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gtgtaaaaaa cctgggaggc cacaaaccat ggaagctgta cgcatggcgt agtggactag 10500
cggttagagg agacccctcc cttacaaatc gcagcaaaca acgggggccc aaggtgagat 10560
gaagctgtaa tctcactgga aggactagag gttagaggag acccccccaa aacaaaaaac 10620
agcatattga cgctgggaaa gaccagagat cctgctgtct cctcagcatc attccaggca 10680
cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10725
<210> 5
<211> 10708
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 5
agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgact cggaagcttg cttaacgtag 60
tgctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga agaagacggg 120
aaaaccgtct atcaatatgc tgaaacgcgt gagaaaccgt gtgtcaactg gatcacagtt 180
ggcgaagaga ttctcaaaag gactgctgaa cggccaggga ccaatgaaat tggttatggc 240
gttcatagct ttcctcagat ttctagccat tccaccaaca gcaggagtct tggctagatg 300
gggaaccttc aagaagtcgg gggccattaa ggtcctgaaa ggctttaaga aggagatctc 360
aaacatgctg agcataatca acaaacggaa aaagacatcg ctctgtctca tgatgatatt 420
gccagcagca cttgctttcc acttgacttc acgagatgga gagccgcgca tgattgtggg 480
gaagaatgaa agaggaaaat ccctactttt taagacagcc tctggaatta acatgtgcac 540
actcatagcc atggacttgg gagagatgtg tgatgacacg gtcacttaca aatgccccca 600
tattaccgaa gtggaacctg aagacattga ctgctggtgc aacctcacat caacatgggt 660
gacttatgga acgtgcaatc aagccggaga gcatagacgc gataagagat cagtggcgtt 720
agctccccat gtcggcatgg gactggatac acgcacccaa acttggatgt cggctgaagg 780
agcttggagg caagtcgaga aggtagagac atgggccctt aggcacccag ggttcaccat 840
actagcccta tttcttgccc attacatagg cacttccttg acccagaagg tggttatttt 900
tatactgcta atgctggtca ccccatccat gacaatgaga tgtgtgggag taggaaacag 960
agattttgtg gaaggactat caggagctac gtgggttgac gtggtgctcg agcacggggg 1020
gtgtgtgacc accatggcta agaacaagcc cacgttggat atagagcttc agaagaccga 1080
ggccacccaa ctggcgaccc taaggaagct atgcattgag gggaaaatca ccaacataac 1140
aactgactca agatgtccta cccaagggga agcggttttg cctgaggagc aggaccaaaa 1200
ctacgtgtgt aagcatacat acgtagacag aggctggggg aacggatgtg gtttgtttgg 1260
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ggacttcaat gaaatgatct tgctaacaat gaagaacaaa gcatggatgg tacatagaca 1560
atggtttttt gacctacctc taccatggac atcaggagct acaacggaaa caccaacctg 1620
gaacaggaag gagcttcttg tgacatttaa aaacgcacat gcgaagaaac aagaagtagt 1680
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aaactcagga ggcacaagca tttttgcggg gcacttaaaa tgtagactta agatggacaa 1800
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cgacatgggc tattggatag aaagtcaaaa gaatggaagt tggaagctag aaaaagcatc 3060
cctcatagag gtgaaaacct gcacatggcc aaaatcacat accctttgga gtaatggtgt 3120
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cttcaactat tgtgaaggaa caacagttgt catcacagaa aactgtggga caagaggccc 3300
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acccatcagt gagaaagaag aaaacatggt aaagtcttta gtctcagcgg gaagtggaga 3480
ggtggacaac ttcacaatgg gtgtcttgtg tttggcaatc ctctttgaag aggtgatgag 3540
aggaaaattt gggaagaaac acatgattgc gggggttttc ttcacgtttg tactccttct 3600
ctcagggcaa ataacatgga gagatatggc gcacacacta ataatgattg ggtccaatgc 3660
atctgacagg atgggaatgg gcgtcaccta cctagcttta attgcaacat ttaaaatcca 3720
gccatttttg gctttgggat ttttcctaag aaaactgaca tccagagaaa atttattgtt 3780
aggagttggg ctggctatgg caacaacgtt acaactgcca gaggacattg aacaaatggc 3840
aaatggaatc gctctggggc tcatggctct caaactgata acacaatttg aaacatacca 3900
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ctggagaaca gccaccctga ttttggctgg agtttcactt ttaccagtgt gccagtcttc 4020
gagtatgagg aaaacagact ggcttccaat gacagtggca gctatgggag ttccacctct 4080
accacttttt atttttagct taaaagacac actcaaaagg agaagctggc cactgaatga 4140
aggggtgatg gctgttgggc ttgtgagcat tctggccagt tctctcctta gaaatgatgt 4200
acccatggct ggaccattag tggccggggg cttgctgata gcgtgctacg tcataactgg 4260
cacgtcagca gacctcaccg tagaaaaagc agcagatgta acatgggagg aagaggctga 4320
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aaaagatgat gagactgaga atatcttaac agtgcttttg aaaacagcat tactaatagt 4440
gtcaggaatc tttccatact ccatacccgc aacattgttg gtctggcata cttggcaaaa 4500
gcaaacccaa agatccggcg ttctatggga tgtacccagc cctccagaga cacagaaagc 4560
agaactggaa gaaggggtct ataggatcaa acagcaagga atttttggga aaacccaagt 4620
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agaaagggac ataccagaac gctcatggaa ttcaggcaat gaatggataa ccgacttcgc 5580
tgggaaaacg gtgtggtttg tccccagcat taaagccgga aatgacatag caaattgcct 5640
gcggaaaaac gggaaaaagg tcattcaact tagtaggaag acttttgaca cagaatatca 5700
gaaaaccaaa ctgaatgatt gggactttgt ggtgacgact gacatttcag aaatgggggc 5760
caatttcaaa gcagatagag tgatcgaccc aagaagatgt ctcaaaccag tgatcctgac 5820
agatggacca gagcgggtga tcctggctgg accaatgcca gtcaccgcag cgagtgctgc 5880
gcaaaggaga gggagagttg gcaggaaccc acaaaaagaa aatgaccagt acatattcac 5940
gggccagcct ctcaacaatg atgaagacca tgctcactgg acagaagcaa aaatgctgct 6000
ggacaacatt aacacaccag aagggatcat accagctctc tttgagccag aaagggagaa 6060
gtcagccgcc atagacggtg agtatcgcct gaaaggtgag tccaggaaga ctttcgtgga 6120
actcatgagg aggggtgacc ttccagtctg gttagcccat aaagtagcat cagaagggat 6180
caaatataca gatagaaaat ggtgctttga tggacaacgt aataatcaaa ttttagaaga 6240
gaacatggat gtggaaatct ggacaaagga aggagaaaag aaaaaattga gacctaggtg 6300
gcttgatgct cgcacctatt cagatccctt agcactcaag gaattcaagg actttgcggc 6360
tggcaggaag tcaatagccc ttgatcttgt gacagaaata ggaagagtgc cttcacacct 6420
agctcataga acgagaaacg ctctggacaa tctggtgatg ctgcatacgt cagaacatgg 6480
cggtaaggcc tacaggcatg cggtggagga actaccagag acaatggaaa cactcctact 6540
cttgggactc atgatcttgt tgacaggtgg agcaatgctt ttcttaatat caggtaaagg 6600
gattggaaag acttcaatag gactcatttg tgtaattgct tccagcggca tgttgtggat 6660
ggccgaaatc ccactccaat ggatcgcgtc ggccatagtc ctggagtttt ttatgatggt 6720
gttgcttata ccagaaccag agaagcagag aaccccccaa gacaaccaac tcgcatatgt 6780
cgtgataggc atacttacac tggcagcaat aatagcagcc aatgaaatgg gattgttgga 6840
aactacaaag agagatttag gaatgtctaa ggagccaggt gttgtttctc caaccagcta 6900
tttagatgtg gacttgcacc cagcatcagc ctggacattg tacgctgtgg ccactacagt 6960
aataacacca atgttaagac ataccataga gaattccaca gcaaatgtgt ccttggcagc 7020
tatagccaac caggcagtgg tcctgatggg tttggacaaa ggatggccaa tatcaaaaat 7080
ggacttagga gtacccctgc tggcattggg ttgctattca caagtgaacc cactgactct 7140
aacagcggca gtactcttgc tgatcacaca ttatgccatt ataggtccag gattgcaggc 7200
aaaagccacc cgtgaagctc agaaaaggac agctgctgga ataatgaaga atccaacagt 7260
ggatgggata atgacaatag acctagatcc tgtaatatat gattcaaaat ttgaaaagca 7320
actgggacag gttatgctcc tggttttgtg tgcagttcaa cttttgttaa tgagaacatc 7380
atgggccttg tgtgaagctt taaccctagc tacaggacca ataacaacac tctgggaagg 7440
atcacctggg aagttttgga acaccacgat agctgtttcc atggcgaaca tttttagagg 7500
gagctattta gcaggagctg ggcttgcttt ctctattatg aaatcagttg gaacagggaa 7560
aagaggaaca ggctcacagg gtgaaacttt gggagaaaaa tggaaaaaga agttaaatca 7620
attatcccgg aaagagtttg acctttacaa gaaatctgga atcactgagg tggatagaac 7680
agaagccaaa gaagggttga aaagaggaga aataacacat catgccgtgt ccagaggtag 7740
tgcaaaactt caatggtttg tggagagaaa catggtcatt cccgaaggaa gagttataga 7800
cttgggctgt ggaagaggag gctggtcata ttactgtgca ggactgaaaa aagtcacaga 7860
agtgcgagga tacacaaaag gcggtccagg acacgaagaa ccagtaccta tgtccacata 7920
tggatggaac atagttaagt taatgagtgg aaaggatgtg ttttatcttc cacctgaaaa 7980
gtgtgacacc ctgttgtgcg acattggaga atcttcacca agcccaacag tggaagaaag 8040
cagaactata agagttttga agatggttga accatggcta aagaacaacc aattttgtat 8100
taaagtattg aacccttaca tgccaactgt gattgagcac ctagaaagac tacaaaggaa 8160
acatggagga atgcttgtga gaaatccact ttcacgaaac tccacgcacg aaatgtactg 8220
gatatccaat ggcacaggta acattgtcgc ttcagtcaac atggtatcta gactgctact 8280
gaacaggttc acgatgacac acagaagacc caccattgag aaagatgtgg atttaggagc 8340
aggaactcga catgttaatg cggaaccaga aacacccaac atggatgtca ttggggaaag 8400
aataaaaagg atcaaggagg agcataattc aacatggcac tacgatgacg aaaaccccta 8460
caaaacgtgg gcttaccatg gatcttatga agtcaaagcc acaggctcag cctcctccat 8520
gataaatgga gtcgtgaaac tcctcactaa accatgggat gtggtgccca tggtgacaca 8580
gatggcaatg acagatacaa ctccatttgg ccagcagaga gtctttaaag agaaagtgga 8640
caccaggaca cccaggtcca tgccaggaac aagaagggtt atggggatca cagcggagtg 8700
gctctggaga accctgggaa ggaataaaaa acccaggtta tgcacaaggg aagagtttac 8760
aaaaaaggtc agaactaacg cagccatggg agctgttttc acagaggaga accaatggga 8820
cagcgcgaaa gctgctgttg aggatgagga tttttggaaa cttgtggaca gagaacgtga 8880
actccacaaa ctgggcaagt gtggaagctg tgtttacaac atgatgggta agagagagaa 8940
gaaacttgga gagtttggca aagcaaaagg cagtagagct atatggtaca tgtggttggg 9000
agccaggtac cttgagttcg aagcccttgg attcttaaat gaagaccact ggttctcgcg 9060
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ggacatttcc aagatacccg gaggagctat gtatgctgat gacacagctg gttgggacac 9180
aagaataaca gaagatgacc tgcacaatga ggaaaagatc acacagcaaa tggaccctga 9240
acacaggcag ttagcgaacg ctatatttaa gctcacatac caaaacaaag tggtcaaagt 9300
tcaacgaccg actccaacag gcacggtaat ggatatcata tctaggaaag accaaagagg 9360
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cagacaaatg gaaggagaag gtgtgctgtc aaaggcagac ctcgagaacc ctcatctgcc 9480
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cataagtggg gatgactgcg tggtgaaacc aatcgatgac aggttcgcta atgccctgct 9600
cgctctgaac gacatgggaa aggttcggaa agacatacct caatggcagc catcaaaggg 9660
atggcatgat tggcaacagg ttcctttctg ctcccaccac tttcatgaat tgatcatgaa 9720
agatggaaga aagttggtgg ttccctgcag accccaggac gaactaatag gaagggcaag 9780
aatctctcaa ggagcgggat ggagccttag agaaaccgca tgtctgggga aagcctacgc 9840
tcaaatgtgg agtctcatgt attttcacag aagagacctc agactagcat ccaacgccat 9900
atgttcagca gtaccagtcc actgggtccc cacaagtaga acgacatggt ctattcacgc 9960
tcaccatcag tggatgacca cagaagacat gcttactgtc tggaacagag tgtggatcga 10020
ggacaatcca tggatggaag acaaaactcc agtcacaacc tgggaaaatg ttccatatct 10080
agggaagaga gaagaccaat ggtgcggatc acttattggt ctcacttcca gagcaacctg 10140
ggcccagaac atacccacag caattcaaca ggttagaagc cttataggca atgaagagtt 10200
tctggactac atgccttcaa tgaagagatt taggaaggag gaggagtcgg agggagccat 10260
ttggtaaaac gtaggaagtg aaaaagaggt taactgtcag gccatattaa gccacagtac 10320
ggaagaagct gtgctgcctg tgagccccgt ccaaggacgt taaaagaaga agtcaggccc 10380
caaagccacg gtttgagcaa accgtgctgc ctgtagctcc gtcgtgggga cgtaaaacct 10440
gggaggctgc aaactgtgga agctgtacgc acggtgtagc agactagcgg ttagaggaga 10500
cccctcccat gacacaacgc agcagcgggg cccgagcact gagggaagct gtacctcctt 10560
gcaaaggact agaggttaga ggagaccccc cgcaaataaa aacagcatat tgacgctggg 10620
agagaccaga gatcctgctg tctcctcagc atcattccag gcacagaacg ccagaaaatg 10680
gaatggtgct gttgaatcaa caggttct 10708
<210> 6
<211> 10708
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 6
agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgact cggaagcttg cttaacgtag 60
tgctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga agaagacggg 120
aaaaccgtct atcaatatgc tgaaacgcgt gagaaaccgt gtgtcaactg gatcacagtt 180
ggcgaagaga ttctcaaaag gactgctgaa cggccaggga ccaatgaaat tggttatggc 240
gttcatagct ttcctcagat ttctagccat tccaccaaca gcaggagtct tggctagatg 300
gggaaccttc aagaagtcgg gggccattaa ggtcctgaaa ggctttaaga aggagatctc 360
aaacatgctg agcataatca acaaacggaa aaagacatcg ctctgtctca tgatgatatt 420
gccagcagca cttgctttcc acttgacttc acgagatgga gagccgcgca tgattgtggg 480
gaagaatgaa agaggaaaat ccctactttt taagacagcc tctggaatta acatgtgcac 540
actcatagcc atggacttgg gagagatgtg tgatgacacg gtcacttaca aatgccccca 600
tattaccgaa gtggaacctg aagacattga ctgctggtgc aacctcacat caacatgggt 660
gacttatgga acgtgcaatc aagccggaga gcatagacgc gataagagat cagtggcgtt 720
agctccccat gtcggcatgg gactggatac acgcacccaa acttggatgt cggctgaagg 780
agcttggagg caagtcgaga aggtagagac atgggccctt aggcacccag ggttcaccat 840
actagcccta tttcttgccc attacatagg cacttccttg acccagaagg tggttatttt 900
tatactgcta atgctggtca ccccatccat gacaatgaga tgcgtgggcg tagggaatag 960
agactttgta gagggattga gcggagcgac atgggtcgac gtcgtactcg aacacggggg 1020
gtgcgtgacg actatggcta agaataagcc tacactcgat atcgaactgc aaaaaaccga 1080
agcgacacaa ttggcgacat tgcgcaaact atgtatcgaa ggtaagatta cgaacattac 1140
aaccgatagt agatgcccta cacaaggcga agccgttcta cctgaggagc aagaccaaaa 1200
ctacgtatgt aagcatacat acgttgatag ggggtggggg aacggatgcg gattgttcgg 1260
taaggggtca ttggtcacat gcgctaagtt ccaatgctta gagcctatcg agggtaaggt 1320
ggtacaatac gaaaacctta agtataccgt gataattaca gttcataccg gagaccaaca 1380
ccaagtggga aacgagacac agggagtgac agccgaaatt acgcctcagg ctagtacaac 1440
cgaagcgata ctacccgaat acggaacatt ggggttggag tgttcaccta gaaccggatt 1500
ggactttaac gaaatgatac tgttgactat gaaaaacaag gcatggatgg tgcataggca 1560
atggtttttt gacctaccat tgccttggac tagcggagcg acaaccgaaa cacctacatg 1620
gaatagaaaa gagctcctag tgacatttaa aaacgctcac gctaagaagc aggaagtggt 1680
cgttttaggg tcacaggagg gagctatgca taccgcacta accggagcga ctgagataca 1740
gaatagcgga gggacatcaa tcttcgccgg acaccttaag tgtagattga aaatggacaa 1800
acttgagctt aaggggatgt catacgctat gtgtacgaac acattcgtgc tgaaaaaaga 1860
ggtaagcgaa acgcaacacg gaacgatact gattaaggtt gagtataagg gcgaagacgt 1920
cccatgtaag ataccttttt cgacagagga cggacagggt aaggcccata acggaagact 1980
gattaccgct aacccagtgg tgaccaaaaa agaggaacca gtcaatatcg aagccgaacc 2040
tccattcgga gagtcaaaca tagtgatagg gataggcgat aacgcactta agattaactg 2100
gtacaaaaaa gggtcatcaa tcggtaagat gtttgaggca accgctaggg gggctagacg 2160
gatggccata ctcggagaca ccgcatggga cttcggatcc gtgggggggg tacttaactc 2220
actcggtaag atggtgcacc aaattttcgg atccgcatat accgctctat ttagcggagt 2280
gtcatgggtg atgaaaatcg gaatcggagt tctattgaca tggatcggat tgaactctaa 2340
gaatacatct atgtcatttt catgtatcgc aatcggaatt attacgctat atctcggagc 2400
cgtagtgcaa gccgacatgg ggtgtgttat aaactggaaa ggcaaagaac tcaagtgtgg 2460
aagtggaatc ttcgtcacca acgaggtcca tacctggaca gagcaataca aattccaagc 2520
agactcccca aaaagattgg cgacagccat tgcaggcgct tgggagaatg gagtgtgcgg 2580
aattaggtca acaaccagaa tggagaatct cctgtggaag caaatagcca atgaactgaa 2640
ctacatattg tgggaaaaca atatcaaatt aacggttgtt gtgggcgata taattggggt 2700
cttagagcaa gggaaaagaa cactaacacc acaacccatg gagctaaaat actcatggaa 2760
aacgtgggga aaggcaaaaa tagtgacagc tgaaacacaa aattcttctt tcataataga 2820
tggaccaaac acaccggagt gtccaagtgc ctcaagagca tggaatgtgt gggaggtgga 2880
agattacggg ttcggagtct tcacaaccaa catatggctg aaactccgag aggtgtatac 2940
ccaactatgt gaccataggt taatgtcggc agccgtcaag gatgaaaggg ccgtacatgc 3000
cgacatgggc tattggatag aaagtcaaaa gaatggaagt tggaagctag aaaaagcatc 3060
cctcatagag gtgaaaacct gcacatggcc aaaatcacat accctttgga gtaatggtgt 3120
gttagagagt gacatgatca ttccaaaaag tctagctggt cctatctcgc aacacaacta 3180
caggcccggg taccacaccc agacggcggg accttggcat ttaggaaaat tagagctgga 3240
cttcaactat tgtgaaggaa caacagttgt catcacagaa aactgtggga caagaggccc 3300
atcattgaga acaacaacag tgtcagggaa gttaatacac gaatggtgct gccgctcgtg 3360
cacacttcct cccctgcgat acatgggaga agacggttgc tggtatggca tggaaatcag 3420
acccatcagt gagaaagaag aaaacatggt aaagtcttta gtctcagcgg gaagtggaga 3480
ggtggacaac ttcacaatgg gtgtcttgtg tttggcaatc ctctttgaag aggtgatgag 3540
aggaaaattt gggaagaaac acatgattgc gggggttttc ttcacgtttg tactccttct 3600
ctcagggcaa ataacatgga gagatatggc gcacacacta ataatgattg ggtccaatgc 3660
atctgacagg atgggaatgg gcgtcaccta cctagcttta attgcaacat ttaaaatcca 3720
gccatttttg gctttgggat ttttcctaag aaaactgaca tccagagaaa atttattgtt 3780
aggagttggg ctggctatgg caacaacgtt acaactgcca gaggacattg aacaaatggc 3840
aaatggaatc gctctggggc tcatggctct caaactgata acacaatttg aaacatacca 3900
actatggaca gcattaatct ccttaacgtg ttcaaataca atttttacgt tgactgttgc 3960
ctggagaaca gccaccctga ttttggctgg agtttcactt ttaccagtgt gccagtcttc 4020
gagtatgagg aaaacagact ggcttccaat gacagtggca gctatgggag ttccacctct 4080
accacttttt atttttagct taaaagacac actcaaaagg agaagctggc cactgaatga 4140
aggggtgatg gctgttgggc ttgtgagcat tctggccagt tctctcctta gaaatgatgt 4200
acccatggct ggaccattag tggccggggg cttgctgata gcgtgctacg tcataactgg 4260
cacgtcagca gacctcaccg tagaaaaagc agcagatgta acatgggagg aagaggctga 4320
gcaaacagga gtgtcccaca acttaatgat cacagttgat gatgatggaa caatgagaat 4380
aaaagatgat gagactgaga atatcttaac agtgcttttg aaaacagcat tactaatagt 4440
gtcaggaatc tttccatact ccatacccgc aacattgttg gtctggcata cttggcaaaa 4500
gcaaacccaa agatccggcg ttctatggga tgtacccagc cctccagaga cacagaaagc 4560
agaactggaa gaaggggtct ataggatcaa acagcaagga atttttggga aaacccaagt 4620
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gatttcatac ggaggaggat ggagattgag cgcacaatgg caaaaggggg aggaggtgca 4800
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tccaaactat aacttgataa taatggatga agcccatttc acagacccag ccagtatagc 5400
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gggccagcct ctcaacaatg atgaagacca tgctcactgg acagaagcaa aaatgctgct 6000
ggacaacatt aacacaccag aagggatcat accagctctc tttgagccag aaagggagaa 6060
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gaacatggat gtggaaatct ggacaaagga aggagaaaag aaaaaattga gacctaggtg 6300
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agctcataga acgagaaacg ctctggacaa tctggtgatg ctgcatacgt cagaacatgg 6480
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ggccgaaatc ccactccaat ggatcgcgtc ggccatagtc ctggagtttt ttatgatggt 6720
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acatggagga atgcttgtga gaaatccact ttcacgaaac tccacgcacg aaatgtactg 8220
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aggaactcga catgttaatg cggaaccaga aacacccaac atggatgtca ttggggaaag 8400
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gagccggagc tccgtgtaaa gtgccaatcg aaattagaga cgttaacaaa gagaaagtgg 1980
tcggaagagt gatatctagt acacccctag ccgaaaatac gaattccgtt acgaatatcg 2040
aactcgaacc cccctttgga gactcataca tagtgatagg agtgggtaat tccgcactca 2100
cgttgcactg gttcagaaag ggatcatcaa tcgggaagat gttcgaatca acatataggg 2160
gagcgaaaag aatggctata ttgggcgaaa ccgcatggga cttcggatca gtcggaggac 2220
tgtttacgag tctgggtaag gccgtacatc aggtattcgg atcagtgtat acaacaatgt 2280
ttggcggagt gtcatggatg atacggatac tgatagggtt tctagtgttg tggatcggaa 2340
cgaactcacg taatacgtct atggctatga catgtattgc cgtagggggg attacactgt 2400
ttctgggatt tacagtgcaa gcagacatgg gttgtgtggt gtcatggagt gggagagaat 2460
tgaagtgtgg aagcggaatt tttgtggttg acaacgtgca cacttggaca gaacagtaca 2520
aattccaacc agagtcccca gcgagactag cgtctgcaat attaaatgcc cacaaagatg 2580
gggtctgtgg aattagatca accacgaggc tggaaaatgt tatgtggaag caaataacca 2640
atgagctaaa ctatgttctc tgggaaggag gacatgatct cactgtagtg gctggggatg 2700
tgaaaggggt gttgaccaag ggcaagagag cactcacacc cccagcgagt gatctgaaat 2760
attcatggaa gacatggggg aaagcaaaaa tcttcacccc tgaagcaaga aacagcacat 2820
ttttaataga cggaccagac acctctgaat gccccaatga acgaagggca tggaattctt 2880
ttgaggtgga agactatgga tttggcatgt tcacgaccaa catatggatg aaattccgag 2940
aaggaagttc agaagtgtgt gaccacaggt taatgtcagc tgcaattaaa gaccagaaag 3000
ctgtgcatgc tgacatgggt tattggatag agagctcaaa aaaccagacc tggcagatag 3060
agagagcatc tcttattgaa gtgaaaacat gtctgtggcc caagacccat acactgtgga 3120
gcaatggagt gctggaaagc cagatgctta ttccaaaatc atatgcaggc cctttttcac 3180
agcacaatta ccgccagggc tatgctacgc aaaccgtggg tccatggcac ttaggcaaac 3240
tagagataga ctttggagaa tgccccggaa caacagtcac aattcaggag aattgtgacc 3300
atagaggccc atctttgagg accaccactg catctggaaa actagtcacg caatggtgtt 3360
gccgctcctg cacgatgccc cccttaaggt tcttaggaga agatgggtgc tggtatggga 3420
tggagattag gcccttgagt gaaaaagaag agaacatggt caaatcacag gtgacggccg 3480
gacagggcac atcggaaact ttttcaatgg gtctgttgtg cctgaccttg tttgtggaag 3540
aatgcttgag gagaagagtc accaggaaac acatgatatt agctgtggta atcactcttt 3600
gtgctatcat cctggggggc ctcacatgga tggacttgct acgagccctc atcatgttgg 3660
gggacactat gtctggtaga ataggaggac agacccacct agccatcatg gcagtgttca 3720
agatgtcacc gggatacgtg ctgggtgtgt ttttaaggaa actcacttca agagagacag 3780
cactaatggt aataggaatg gccatgacaa caacactttc aattccacat gacctcatgg 3840
aactcattga tggaatatca ctaggactaa ttttgctaaa aatagtaaca cagtttgaca 3900
acacccaagt gggaacctta gctctttcct tgactttcat aagatcaaca atgtcattgg 3960
tcatggcttg gaggaccatt atggctgtgt tgtttgtggt cacactcatt cctttgtgca 4020
ggacaagctg tcttcaaaaa cagtctcatt gggtagaaat aacagcactc atcctaggag 4080
cccaagctct gccagtgtac ctaatgactc ttatgaaagg agcctcaaga agatcttggc 4140
ctcttaacga aggcataatg gctgtgggtt tggttagtct cttaggaagc gctcttttaa 4200
agaatgatgt ccctttagct ggcccaatgg tggcaggagg cttacttctg gcggcttacg 4260
taatgagtgg cagctcagca gatctgtcac tagagaaggc cgctaatgtg cagtgggatg 4320
aaatggcaga cataacaggc tcaagtccaa tcatagaagt gaagcaagat gaggatggct 4380
ctttctccat acgggacgtc gaggaaacca atatgataac ccttttggtg aaactggcac 4440
tgataacggt gtcaggtctc taccccttgg caattccaat cacaatgacc ttatggtaca 4500
tgtggcaagt gaaaacacaa agatcaggag ccctgtggga cgtcccttca cccgccgcca 4560
ctcaaaaagc cgcactgtct gaaggagtgt acaggatcat gcaaagaggg ttattcggga 4620
aaactcaggt tggagtaggg atacacatgg aaggtgtatt tcacacaatg tggcatgtta 4680
caagaggatc ggtgatctgc cacgagactg ggagattgga gccatcttgg gctgatgtca 4740
ggaatgacat gatatcatac ggtgggggat ggaggcttgg agataaatgg gacaaagaag 4800
aagacgttca ggtcctcgct atagaaccag ggaaaaatcc caaacatgtc caaacgaaac 4860
ctggcctttt caagacccta actggagaaa ttggagcagt aacattagat ttcaaacccg 4920
gaacgtctgg ttctcccatt atcaacagga aaggaaaagt catcggactc tatggaaatg 4980
gagtggtcac caaatcaggt gattacgtca gtgccataac acaagccgaa agaattggag 5040
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aggccctacg tggactgcca atccgttacc aaaccccagc tgtaaaatca gaacacacag 5280
gaagagagat tgtagacctc atgtgccatg caaccttcac aacaagactt ttgtcatcaa 5340
ccagagttcc aaactacaac cttatagtaa tggatgaagc acatttcacc gatccttcca 5400
gtgtcgcggc tagaggatac atttcgacca gggtggaaat gggagaggca gcagccatct 5460
tcatgaccgc aacccctccc ggagcgacag atccctttcc ccagagcaac agcccaatag 5520
aagacatcga gagagagatt ccggaaaggt catggaacac agggttcgac tggataacag 5580
actaccaagg gaaaactgtg tggtttgttc ccagcataaa agctggaaat gacattgcaa 5640
attgtttgag aaagtcggga aagaaagtta tccagttgag taggaaaacc tttgatacag 5700
aatatccaaa aacgaaactc acggactggg actttgtggt cactacagac atatctgaaa 5760
tgggggctaa ctttagagct gggagagtga tagaccctag aagatgcctc aagccagtta 5820
tcctaacaga tgggccagag agagtcatct tagcaggtcc tattccagtg actccagcaa 5880
gcgctgctca gagaagaggg cgaataggaa ggaacccagc acaagaagac gaccaatacg 5940
ttttctccgg agacccacta aaaaatgatg aagaccatgc ccactggaca gaagcaaaga 6000
tgctgcttga caatatctac accccagaag ggatcattcc aacattgttt ggtccggaaa 6060
gggaaaaaac ccaagctatt gatggagagt ttcgcctcag aggggaacaa aggaagactt 6120
ttgtggaatt aatgaggaga ggagaccttc cggtgtggct gagttataag gtagcttctg 6180
ctggcatttc ttacaaagat cgggaatggt gctttactgg ggaaagaaat aaccaaattt 6240
tagaagaaaa catggaggtt gaaatttgga ctagagaggg agaaaagaaa aaactgaggc 6300
caaaatggtt agatgcacgt gtatacgctg accccatggc tttgaaggat ttcaaggagt 6360
ttgccagtgg aaggaagagt ataactctcg acatcctaac agagatcgcc agtttgccaa 6420
cttacctttc ctctagggcc aagctcgccc ttgacaacat agttatgctc cacacaacag 6480
aaagaggagg gagggcctat caacatgccc tgaacgaact tccggagtca ctggaaacac 6540
tcatgcttgt agccttacta ggagctatga cagcaggtat cttcctgttt ttcatgcaag 6600
ggaaaggaat agggaaattg tcaatgggtt tgataaccat tgcggtggct agtggcttgc 6660
tctgggtagc agaaattcaa ccccagtgga tagcggcctc aatcatactg gagttttttc 6720
tcatggtact gttgatacca gaaccagaaa aacaaaggac cccacaagac aatcaattga 6780
tctacgtcat attgaccatt ctcaccatta ttggtctaat agcagccaac gagatggggc 6840
tgatagaaaa aacaaaaacg gattttgggt tttaccaggt aaaaacagaa accaccatcc 6900
tcgatgtgga cctgagacca gcttcagcat ggacgctcta tgcggtagcc accacaattc 6960
tgactcccat gctgagacac accatagaaa atacgtcggc caacctatct ttagcagcca 7020
tcgccaacca ggcagccgtc ctaatggggc ttggaaaagg atggccactc cacagaatgg 7080
acctcggtgt gccgctgtta gcaatgggat gctattctca agtgaaccca acaaccttga 7140
cagcatcctt agtcatgctt ttagtccatt atgcaataat aggcccagga ttgcaggcaa 7200
aagccacaag agaggcccag aaaaggacag ctgctggaat catgaaaaat cccacagtgg 7260
acgggataac agtgatagat ctagaaccaa tatcctatga cccaaaattt gaaaagcaat 7320
tagggcaggt catgttactc gtcttgtgtg ctggacaact actcttgatg agaacaacat 7380
gggctttctg tgaagttttg actttggcca caggaccaat cttgaccttg tgggagggca 7440
acccgggaag gttttggaac acgaccatag ccgtatctac cgccaacatt ttcaggggaa 7500
gttatttggc aggagctgga ctggcttttt cactcataaa gaatgcacaa acccccagga 7560
ggggaactgg gaccacagga gagacactgg gagagaagtg gaagagacag ctaaactcat 7620
tagacaggaa agagtttgaa gagtataaaa gaagtggaat actagaagtg gacaggactg 7680
aagccaagtc cgccctgaaa gatgggtcta aaatcaagca tgcagtatct agagggtcca 7740
gtaagatcag atggattgtt gagagaggga tggtaaagcc aaaggggaaa gttgtagatc 7800
ttggctgtgg gagaggagga tggtcttatt acatggcgac actcaagaac gtgactgaag 7860
tgaaagggta tacaaaagga ggtccaggac atgaagaacc gattcccatg gctacttatg 7920
gctggaattt ggtcaaactc cattcagggg ttgacgtgtt ctacaaaccc acagagcaag 7980
tggacaccct gctctgtgat attggggagt catcttctaa tccaacaata gaggaaggaa 8040
gaacattaag agttttgaag atggtggagc catggctctc ttcaaaacct gaattctgca 8100
tcaaagtcct caacccctac atgccaacag tcatagagga gctggagaaa ctgcagagaa 8160
aacacggtgg gaaccttgtc agatgcccgc tgtccaggaa ctccacccat gagatgtatt 8220
gggtgtcagg agcgtcggga aatattgtga gctctgtgaa cacaacatca aagatgttgt 8280
tgaacaggtt cacaacaagg cataggaaac ccacttatga gaaggacgta gatcttgggg 8340
caggaacgag aagtgtctct actgaaacag aaaaaccaga catgacaatc attgggagaa 8400
ggcttcagcg attgcaagag gagcacaaag aaacatggca ttatgatcag gaaaacccat 8460
acagaacctg ggcgtatcat ggaagctatg aagctccttc gacaggctct gcatcctcca 8520
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agttagccat gacagataca accccttttg ggcaacaaag agtgttcaaa gagaaggtgg 8640
ataccagaac gccgcaacca aaaccaggca cacgaatggt tatgaccacg acagccaatt 8700
ggctatgggc cctccttgga aagaagaaaa atcccagact gtgtacaagg gaagagttca 8760
tctcaaaagt tagatcaaac gcagccatag gcgcagtctt tcaggaagaa caaggatgga 8820
catcagccag tgaagctgtg aatgacagcc ggttttggga actggttgac aaagaaaggg 8880
cccttcacca ggaagggaaa tgtgaatcgt gtgtctataa catgatggga aaacgtgaga 8940
aaaagttagg agagtttggc agagccaagg gaagccgagc aatctggtac atgtggctgg 9000
gagcgcggtt tctggaattt gaagccctgg gttttttgaa tgaagatcac tggtttggca 9060
gagaaaattc atggagtgga gtggaagggg aaggtctgca cagattggga tacatcctgg 9120
aggagataga caagaaggat ggagacctaa tgtatgctga tgacacagca ggttgggaca 9180
caagaatcac tgaggatgac cttcaaaatg aggaactgat cacggaacag atggctcccc 9240
accacaagat cctagccaaa gccattttca aactaaccta tcaaaacaaa gtggtgaaag 9300
tcctcagacc cacaccgaga ggagcggtga tggatatcat atccaggaaa gaccaaagag 9360
gtagtggaca agttggaaca tatggtttga acacattcac caacatggaa gttcaactca 9420
tccgccaaat ggaagctgaa ggagtcatca cacaagatga catgcagaac ccaaaagggt 9480
tgaaagaaag agttgagaaa tggctgagag agtgtggtgt cgacaggtta aagaggatgg 9540
caatcagtgg agacgattgc gtggtgaagc ccctagatga gaggtttggc acttccctcc 9600
tcttcttgaa cgacatggga aaggtgagga aagacattcc gcagtgggaa ccatctaagg 9660
gatggaaaaa ctggcaagag gttccttttt gctcccatca ctttcacaag atctttatga 9720
aggatggccg ctcactagtt gttccatgta gaaaccagga tgaactgata gggagagcca 9780
gaatctcgca gggggctgga tggagcttaa gagaaacagc ctgcctgggc aaagcttacg 9840
cccagatgtg gtcgcttatg tacttccaca gaagggatct gcgtttagcc tccatggcca 9900
tatgctcagc agttccaacg gaatggtttc caacaagcag aacaacatgg tcaatccatg 9960
ctcatcacca atggatgacc actgaagaca tgctcaaagt gtggaacaga gtgtggatag 10020
aagacaaccc caatatgatt gacaagactc cagtccattc gtgggaagat ataccttacc 10080
tagggaaaag agaggatttg tggtgtggat ccctgattgg actttcttct agagccacct 10140
gggcgaagaa cattcacacg gccataactc aggtcaggaa cttgatcgga aaagaggaat 10200
acgtggatta catgccagta atgaaaagat acagtgctcc ttcagagagt gaaggagttc 10260
tgtaattacc aacaacaaac accaaaggct attgaagtca ggccacttgt gccacggttt 10320
gagcaaaccg tgctgcctgt agctccgcca ataatgggag gcgtaataat ccctagggag 10380
gccatgcgcc acggaagctg tacgcgtggc atattggact agcggttaga ggagacccct 10440
cccatcactg acaaaacgca gcaaaagggg gcccgaagcc aggaggaagc tgtactcctg 10500
gtggaaggac tagaggttag aggagacccc cccaacacaa aaacagcata ttgacgctgg 10560
gaaagaccag agatcctgct gtctctacaa catcaatcca ggcacagagc gccgcaagat 10620
ggattggtgt tgttgatcca acaggttct 10649
<210> 9
<211> 10735
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 9
agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60
ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggc 120
tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180
ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240
tttcatagca ttcctaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300
gggttcattc aagaagagtg gagcgatcaa agtgctacgg ggtttcaaga aagaaatctc 360
aaacatgttg aatataatga atagaaggaa aagatctgtg accatgctcc ttatgctgat 420
gcctacagcc ttggcgttcc atttgactac acgaggggga gagccgcaca tgatagtcag 480
caagcaggaa agaggaaagt cactcttgtt taagacctca gcaggtgtca acatgtgcac 540
ccttatagcg atggatttgg gagagttatg tgaggacaca atgacttaca aatgccctcg 600
aatcactgaa actgaaccag atgacgttga ttgttggtgt aatgccacag acacatgggt 660
gacctatgga acatgttccc aaactggcga gcaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcact 720
ggccccacac gtgggacttg gtttggaaac aagaaccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780
cgcttggaaa cagatacaaa gagtggagac ttgggccctg agacacccag gattcacggt 840
gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggattatttt 900
cattttgtta atgctggtaa caccatccat ggccatgcga tgcgtgggaa taggcagcag 960
ggacttcgtg gaaggactgt caggagcaac ttgggtagat gtggtactgg aacatggaag 1020
ttgcgtcacc accatggcaa aagacaaacc aacattggac attgaactct tgaagacgga 1080
agtcacaaac cctgccgtcc tgcgcaaact gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140
caccgactca agatgtccaa cacaaggaga agccacacta gtggaagaac aagacgcgaa 1200
ctttgtgtgt cgacgaacgt ttgtggacag aggctggggc aatggctgtg gcctcttcgg 1260
aaaaggaagc ctaataacgt gtgcaaagtt caagtgtgtg acaaaactgg aaggaaagat 1320
agttcaatat gagaacttga aatattcagt aatagtcacc gttcacaccg gagaccagca 1380
tcaagtggga aatgaaagca cagaacatgg gacaactgca actataacac ctcaagctcc 1440
tacgacggaa atacagctga ccgactacgg agctcttaca ttggattgtt cacctagaac 1500
aggactagac tttaatgaaa tggtgttgtt gacaatgaaa gaaaaatcat ggctagtcca 1560
caaacaatgg tttttagacc taccactgcc ttggacctcg ggagcttcaa catcacaaga 1620
gacttggaac agacaagatt tgctggtgac atttaagaca gctcatgcaa agaagcagga 1680
agtagtagtg ttagggtcac aagagggagc aatgcatacc gcactaaccg gagcaaccga 1740
aatacagact agcggaacta caacgatttt tgccggtcac ctgaaatgta gactgaagat 1800
ggacaaactg acacttaaag gaatgtcata cgttatgtgt acgggatcct ttaagctcga 1860
aaaagaggtt gccgaaacgc aacacggaac agtgctagtg caaattaaat atgagggaac 1920
cgacgcacca tgtaagatac cgtttagtac gcaagacgaa aagggcgtta cgcaaaacgg 1980
aagactgatt accgctaacc ctatcgttac agacaaagag aaacccgtta acatagaggc 2040
cgaaccacct tttggcgaat catatatagt gataggcgca ggcgaaaaag cactaaagct 2100
gtcatggttc aaaaaaggat ctagcatagg gaagatgttc gaagcaaccg ctaggggagc 2160
tagacgaatg gcaatactgg gagataccgc atgggacttc ggatcgatag ggggagtgtt 2220
tactagcgta ggtaagttgg tgcatcagat attcggaacc gcatacggag tgttgtttag 2280
cggagtgtca tggactatga agatagggat aggagtgcta ttgacatggc tcggactgaa 2340
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aggcgtaatg gtgcaagcag attcaggatg tgtaattaat tggaaaggta gagaactcaa 2460
gtgtggaagt ggcatttttg tcaccaatga agttcacact tggacagagc aatacaaatt 2520
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gtgtggaatt cgatcagcaa ctcgtctcga gaacatcatg tggaagcaaa tatcaaatga 2640
actgaatcac atcttacttg aaaatgatat gaaattcaca gtggttgtag gagatgttgc 2700
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tcacgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacctgga agctggcaag 3060
agcctcattc atagaagtta aaacatgtat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120
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caactacaga ccaggatatt ttacacaagc agcagggccg tggcacctag gcaagttgga 3240
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aggaccatct cttaggacca caacagtcac aggaaagata attcatgaat ggtgttgcag 3360
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aatcagacca gtcaaggaaa aggaagaaaa tctagtcaaa tcaatggtct ctgcagggtc 3480
aggggaagtg gacagctttt cactaggact gctatgcata tcaataatga tcgaggaggt 3540
gatgagatcc agatggagta gaagaatgct gatgactgga acactggctg tgttcttcct 3600
tctcataatg ggacaattga catggaacga tctgatcaga ttatgcatca tggttggagc 3660
caacgcttcc gacaggatgg ggatgggaac gacgtaccta gccctgatgg ccacttttaa 3720
aatgagaccg atgttcgctg tagggctatt atttcgcaga ctaacatcca gagaagttct 3780
tcttctaaca attggattga gtctagtggc atctgtggag ttaccaaatt ccttggagga 3840
gctgggggat ggacttgcaa tgggcattat gattttaaaa ttattgactg actttcaatc 3900
acatcagctg tgggctacct tgctgtcctt gacatttatc aaaacaacgt tttccttgca 3960
ctacgcatgg aagacaatgg ctatggtact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020
gtccacgacc tcccaaaaaa caacatggct tccggtgcta ttgggatccc ttggatgcaa 4080
accactaacc atgtttctta tagcagaaaa caaaatctgg ggaaggagaa gttggcccct 4140
caatgaagga atcatggctg ttggaatagt cagcatccta ctaagttcac tcctcaaaaa 4200
tgatgtaccg ctagctgggc cactaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgttat 4260
atctggaagc tcagccgacc tatcattaga gaaagcggct gaggtctcct gggaagaaga 4320
agcagaacac tctggtgcct cacacaacat attagtggaa gtccaagatg atggaaccat 4380
gaagataaag gatgaagaga gagatgacac gctaaccatt ctccttaaag caactctgtt 4440
agcagtttca ggggtgtacc cattatcaat accagcgacc cttttcgtgt ggtacttttg 4500
gcagaaaaag aaacagagat ctggagtgtt atgggacaca cccagccctc cagaagtgga 4560
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ccaagtaggg gtaggagttt tccaagaaaa cgtgttccac acaatgtggc atgtcaccag 4680
gggagctgta ctcatgtatc aagggaagag attggaaccg agctgggcca gtgtcaaaaa 4740
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aaaagagata gttgacctca tgtgtcacgc cactttcacc atgcgcctcc tgtctcccgt 5340
aagagttccc aattacaaca tgatcatcat ggatgaagca catttcaccg atccatccag 5400
tatagcggcc agagggtaca tctcaacccg agtgggcatg ggtgaagcag ctgcaatctt 5460
catgacagcc actcccccag gatcagtgga ggcctttcca cagagcaacg cagttatcca 5520
agatgaggaa agagacattc ctgagagatc atggaactca ggctatgagt ggatcactga 5580
cttcccaggt aaaacagttt ggtttgttcc aagcattaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640
ctgcttaaga aagaatggga aacgggtgat tcaattgagc aggaaaacct ttgatacaga 5700
gtaccaaaaa acaaaaaaca acgactggga ctacgtcgtc acaacagaca tctccgaaat 5760
gggagcaaat ttccgagccg acagggtgat agacccaaga cggtgtctga aaccggtaat 5820
actaaaagat ggtccagagc gtgtcatttt agcaggacca atgccagtga ctgtggccag 5880
tgccgctcag aggagaggaa gaattggaag gaaccacaat aaggaaggtg atcagtacat 5940
ctacatggga cagcctttaa acaacgatga agatcacgct cactggacag aagcaaaaat 6000
gctccttgat aatataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccagagag 6060
agaaaagagt gcagcaatag acggggaata cagactgcgg ggtgaagcaa ggaaaacgtt 6120
tgtggagctc atgagaagag gagatctacc tgtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180
aggcttccag tactctgaca gaagatggtg ctttgacggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240
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ccgctggctg gatgccagaa catactcaga cccactagcc ctgcgcgagt ttaaagagtt 6360
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gatgctccta gctttgatag ctgtgttaac tggtggagtg acactgttct tcctatcagg 6600
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agtcacagaa gtgaaggggt atacaaaagg aggacctgga catgaggaac caatcccaat 7920
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aatgttgcta aatcgattca caatggctca caggaaacca acatatgaaa gagacgtgga 8340
cctaggcgcc ggaacaagac atgtggcagt ggaaccagag gtagccaacc tagatatcat 8400
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caatccatat aaaacatggg cctatcatgg atcatatgag gtcaagccat caggatcagc 8520
ctcatccatg gtcaatggcg tggtgaaact gctcaccaaa ccatgggatg tcatccctat 8580
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agccaagtgg ttatggggtt ttctttctag aaacaagaaa ccaagaattt gcacaagaga 8760
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gagagagaaa aagctaggag agttcggaaa ggcaaaagga agtcgtgcaa tatggtacat 9000
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ggtaagggta cagagaccag caaaaaatgg aaccgtgatg gatgtcatat ccagacgtga 9360
ccagagagga agtggtcagg tcggaactta tggcttaaac actttcacca acatggaagc 9420
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ccatgcccat caccaatgga tgacaacaga agacatgctg tcagtgtgga atagggtttg 10020
gatagaggaa aacccatgga tggaggacaa aacccacata tccagttggg gagatgttcc 10080
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cacctgggcc accaacatac aagtggccat aaaccaagtg agaagactaa ttgggaatga 10200
gaattatcta gattacatga catcaatgaa gagattcaag aacgagagtg atcccgaagg 10260
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taaggacgta aaatgaagtc aggccgaaag ccacggcttg agcaaaccgt gctgcctgta 10440
gctccatcgt ggggatgtaa aaacctggga ggctgcaacc catggaagct gtacgcatgg 10500
ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccgaaaca taacgcagca gcggggccca 10560
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aacaataaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680
attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735
<210> 10
<211> 10724
<212> DNA
<213> 登革病毒（Dengue virus）
<400> 10
agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaacgta 60
gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg aaaaaaggcg 120
agaagtacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcaac tgtgcaacag 180
ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg caaggacgcg gaccattaaa actgttcatg 240
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tggggaacga tcaaaaaatc aaaagctatc aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360
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attccaacag cgatggcgtt ccatttaacc acacgcaatg gagaaccaca catgatcgtt 480
ggtaggcagg agaaagggaa aagtcttctg ttcaaaacag aggatggtgt taacatgtgt 540
actctcatgg ccatagacct tggtgaattg tgtgaagata caatcacgta caagtgtcct 600
ctcctcagac aaaatgaacc agaagacata gattgttggt gcaactctac gtccacatgg 660
gtaacttatg ggacatgtac caccacagga gaacacagaa gagaaaaaag atcagtggcg 720
ctcgttccac atgtaggtat gggactggag acacgaactg aaacatggat gtcatcagaa 780
ggggcctgga aacatgttca gagaattgaa acctggatct tgagacatcc aggttttacc 840
ataatggcag caatcctggc atacaccata ggaacgacac atttccaaag ggccttgatt 900
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agttgtgtga cgacgatggc aaaaaacaaa ccaacattgg attttgaact gataaaaaca 1080
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tcgtgcagcc agaaaatttg gaatacacca tcgtgataac acctcactca ggagaggagc 1380
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cgggcctcga cttcaatgag atggtactgc tgcagatgga agacaaagct tggctggtgc 1560
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caaattggat acagaaagag acattggtca ctttcaaaaa tccccacgcg aagaaacagg 1680
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ctaagcgtat ggctatactc ggagacacag catgggactt cggatcctta gggggagtgt 2220
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gaggaatcat gcaggcagga aaacgatcct tgcggcccca gcccactgag ctgaagtact 2760
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aagttgaaga ctatggtttt ggagttttca ccaccaatat atggctgaaa ttgagagaaa 2940
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cattgattac tgggaacatg tcttttagag acctgggaag agtgatggtt atggtgggcg 3660
ctaccatgac ggatgacata ggtatgggag tgacttatct tgccctacta gcagctttta 3720
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gagaagtcaa aggcctaaca aaaggaggac caggacatga agaacccatc cccatgtcaa 7920
catatgggtg gaatctagtg cgtctgcaaa gtggagttga cgttttcttc accccgccag 7980
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ccgaagtcga tagcggagac ggaaatcata tgttcgccgg acatctgaaa tgcaaagtga 1800
gaatggagaa attgcggatt aagggaatgt catacactat gtgttccggt aagttttcga 1860
ttgacaaaga gatggccgaa acgcaacacg gaacaacagt cgttaaggtt aagtacgaag 1920
gagccggagc tccgtgtaaa gtgccaatcg aaattagaga cgttaacaaa gagaaagtgg 1980
tcggaagagt gatatctagt acacccctag ccgaaaatac gaattccgtt acgaatatcg 2040
aactcgaacc cccctttgga gactcataca tagtgatagg agtgggtaat tccgcactca 2100
cgttgcactg gttcagaaag ggatcatcaa tcgggaagat gttcgaatca acatataggg 2160
gagcgaaaag aatggctata ttgggcgaaa ccgcatggga cttcggatca gtcggaggac 2220
tgtttacgag tctgggtaag gccgtacatc aggtattcgg atcagtgtat acaacaatgt 2280
ttggcggagt gtcatggatg atacggatac tgatagggtt tctagtgttg tggatcggaa 2340
cgaactcacg taatacgtct atggctatga catgtattgc cgtagggggg attacactgt 2400
ttctgggatt tacagtgcaa gcagacatgg gttgtgtggt gtcatggagt gggagagaat 2460
tgaagtgtgg aagcggaatt tttgtggttg acaacgtgca cacttggaca gaacagtaca 2520
aattccaacc agagtcccca gcgagactag cgtctgcaat attaaatgcc cacaaagatg 2580
gggtctgtgg aattagatca accacgaggc tggaaaatgt tatgtggaag caaataacca 2640
atgagctaaa ctatgttctc tgggaaggag gacatgatct cactgtagtg gctggggatg 2700
tgaaaggggt gttgaccaag ggcaagagag cactcacacc cccagcgagt gatctgaaat 2760
attcatggaa gacatggggg aaagcaaaaa tcttcacccc tgaagcaaga aacagcacat 2820
ttttaataga cggaccagac acctctgaat gccccaatga acgaagggca tggaattctt 2880
ttgaggtgga agactatgga tttggcatgt tcacgaccaa catatggatg aaattccgag 2940
aaggaagttc agaagtgtgt gaccacaggt taatgtcagc tgcaattaaa gaccagaaag 3000
ctgtgcatgc tgacatgggt tattggatag agagctcaaa aaaccagacc tggcagatag 3060
agagagcatc tcttattgaa gtgaaaacat gtctgtggcc caagacccat acactgtgga 3120
gcaatggagt gctggaaagc cagatgctta ttccaaaatc atatgcaggc cctttttcac 3180
agcacaatta ccgccagggc tatgctacgc aaaccgtggg tccatggcac ttaggcaaac 3240
tagagataga ctttggagaa tgccccggaa caacagtcac aattcaggag aattgtgacc 3300
atagaggccc atctttgagg accaccactg catctggaaa actagtcacg caatggtgtt 3360
gccgctcctg cacgatgccc cccttaaggt tcttaggaga agatgggtgc tggtatggga 3420
tggagattag gcccttgagt gaaaaagaag agaacatggt caaatcacag gtgacggccg 3480
gacagggcac atcggaaact ttttcaatgg gtctgttgtg cctgaccttg tttgtggaag 3540
aatgcttgag gagaagagtc accaggaaac acatgatatt agctgtggta atcactcttt 3600
gtgctatcat cctggggggc ctcacatgga tggacttgct acgagccctc atcatgttgg 3660
gggacactat gtctggtaga ataggaggac agacccacct agccatcatg gcagtgttca 3720
agatgtcacc gggatacgtg ctgggtgtgt ttttaaggaa actcacttca agagagacag 3780
cactaatggt aataggaatg gccatgacaa caacactttc aattccacat gacctcatgg 3840
aactcattga tggaatatca ctaggactaa ttttgctaaa aatagtaaca cagtttgaca 3900
acacccaagt gggaacctta gctctttcct tgactttcat aagatcaaca atgtcattgg 3960
tcatggcttg gaggaccatt atggctgtgt tgtttgtggt cacactcatt cctttgtgca 4020
ggacaagctg tcttcaaaaa cagtctcatt gggtagaaat aacagcactc atcctaggag 4080
cccaagctct gccagtgtac ctaatgactc ttatgaaagg agcctcaaga agatcttggc 4140
ctcttaacga aggcataatg gctgtgggtt tggttagtct cttaggaagc gctcttttaa 4200
agaatgatgt ccctttagct ggcccaatgg tggcaggagg cttacttctg gcggcttacg 4260
taatgagtgg cagctcagca gatctgtcac tagagaaggc cgctaatgtg cagtgggatg 4320
aaatggcaga cataacaggc tcaagtccaa tcatagaagt gaagcaagat gaggatggct 4380
ctttctccat acgggacgtc gaggaaacca atatgataac ccttttggtg aaactggcac 4440
tgataacggt gtcaggtctc taccccttgg caattccaat cacaatgacc ttatggtaca 4500
tgtggcaagt gaaaacacaa agatcaggag ccctgtggga cgtcccttca cccgccgcca 4560
ctcaaaaagc cgcactgtct gaaggagtgt acaggatcat gcaaagaggg ttattcggga 4620
aaactcaggt tggagtaggg atacacatgg aaggtgtatt tcacacaatg tggcatgtta 4680
caagaggatc ggtgatctgc cacgagactg ggagattgga gccatcttgg gctgatgtca 4740
ggaatgacat gatatcatac ggtgggggat ggaggcttgg agataaatgg gacaaagaag 4800
aagacgttca ggtcctcgct atagaaccag ggaaaaatcc caaacatgtc caaacgaaac 4860
ctggcctttt caagacccta actggagaaa ttggagcagt aacattagat ttcaaacccg 4920
gaacgtctgg ttctcccatt atcaacagga aaggaaaagt catcggactc tatggaaatg 4980
gagtggtcac caaatcaggt gattacgtca gtgccataac acaagccgaa agaattggag 5040
agccagatta tgaagtggat gaggacattt ttcgaaagaa aagactaact ataatggact 5100
tacaccccgg agccggaaag acaaaaagaa ttcttccatc aatagtgaga gaagccttaa 5160
aaaggaggct gcgaactttg attttggctc ccacgagagt ggtggcggcc gagatggaag 5220
aggccctacg tggactgcca atccgttacc aaaccccagc tgtaaaatca gaacacacag 5280
gaagagagat tgtagacctc atgtgccatg caaccttcac aacaagactt ttgtcatcaa 5340
ccagagttcc aaactacaac cttatagtaa tggatgaagc acatttcacc gatccttcca 5400
gtgtcgcggc tagaggatac atttcgacca gggtggaaat gggagaggca gcagccatct 5460
tcatgaccgc aacccctccc ggagcgacag atccctttcc ccagagcaac agcccaatag 5520
aagacatcga gagagagatt ccggaaaggt catggaacac agggttcgac tggataacag 5580
actaccaagg gaaaactgtg tggtttgttc ccagcataaa agctggaaat gacattgcaa 5640
attgtttgag aaagtcggga aagaaagtta tccagttgag taggaaaacc tttgatacag 5700
aatatccaaa aacgaaactc acggactggg actttgtggt cactacagac atatctgaaa 5760
tgggggctaa ctttagagct gggagagtga tagaccctag aagatgcctc aagccagtta 5820
tcctaacaga tgggccagag agagtcatct tagcaggtcc tattccagtg actccagcaa 5880
gcgctgctca gagaagaggg cgaataggaa ggaacccagc acaagaagac gaccaatacg 5940
ttttctccgg agacccacta aaaaatgatg aagaccatgc ccactggaca gaagcaaaga 6000
tgctgcttga caatatctac accccagaag ggatcattcc aacattgttt ggtccggaaa 6060
gggaaaaaac ccaagctatt gatggagagt ttcgcctcag aggggaacaa aggaagactt 6120
ttgtggaatt aatgaggaga ggagaccttc cggtgtggct gagttataag gtagcttctg 6180
ctggcatttc ttacaaagat cgggaatggt gctttactgg ggaaagaaat aaccaaattt 6240
tagaagaaaa catggaggtt gaaatttgga ctagagaggg agaaaagaaa aaactgaggc 6300
caaaatggtt agatgcacgt gtatacgctg accccatggc tttgaaggat ttcaaggagt 6360
ttgccagtgg aaggaagagt ataactctcg acatcctaac agagatcgcc agtttgccaa 6420
cttacctttc ctctagggcc aagctcgccc ttgacaacat agttatgctc cacacaacag 6480
aaagaggagg gagggcctat caacatgccc tgaacgaact tccggagtca ctggaaacac 6540
tcatgcttgt agccttacta ggagctatga cagcaggtat cttcctgttt ttcatgcaag 6600
ggaaaggaat agggaaattg tcaatgggtt tgataaccat tgcggtggct agtggcttgc 6660
tctgggtagc agaaattcaa ccccagtgga tagcggcctc aatcatactg gagttttttc 6720
tcatggtact gttgatacca gaaccagaaa aacaaaggac cccacaagac aatcaattga 6780
tctacgtcat attgaccatt ctcaccatta ttggtctaat agcagccaac gagatggggc 6840
tgatagaaaa aacaaaaacg gattttgggt tttaccaggt aaaaacagaa accaccatcc 6900
tcgatgtgga cctgagacca gcttcagcat ggacgctcta tgcggtagcc accacaattc 6960
tgactcccat gctgagacac accatagaaa atacgtcggc caacctatct ttagcagcca 7020
tcgccaacca ggcagccgtc ctaatggggc ttggaaaagg atggccactc cacagaatgg 7080
acctcggtgt gccgctgtta gcaatgggat gctattctca agtgaaccca acaaccttga 7140
cagcatcctt agtcatgctt ttagtccatt atgcaataat aggcccagga ttgcaggcaa 7200
aagccacaag agaggcccag aaaaggacag ctgctggaat catgaaaaat cccacagtgg 7260
acgggataac agtgatagat ctagaaccaa tatcctatga cccaaaattt gaaaagcaat 7320
tagggcaggt catgttactc gtcttgtgtg ctggacaact actcttgatg agaacaacat 7380
gggctttctg tgaagttttg actttggcca caggaccaat cttgaccttg tgggagggca 7440
acccgggaag gttttggaac acgaccatag ccgtatctac cgccaacatt ttcaggggaa 7500
gttatttggc aggagctgga ctggcttttt cactcataaa gaatgcacaa acccccagga 7560
ggggaactgg gaccacagga gagacactgg gagagaagtg gaagagacag ctaaactcat 7620
tagacaggaa agagtttgaa gagtataaaa gaagtggaat actagaagtg gacaggactg 7680
aagccaagtc cgccctgaaa gatgggtcta aaatcaagca tgcagtatct agagggtcca 7740
gtaagatcag atggattgtt gagagaggga tggtaaagcc aaaggggaaa gttgtagatc 7800
ttggctgtgg gagaggagga tggtcttatt acatggcgac actcaagaac gtgactgaag 7860
tgaaagggta tacaaaagga ggtccaggac atgaagaacc gattcccatg gctacttatg 7920
gctggaattt ggtcaaactc cattcagggg ttgacgtgtt ctacaaaccc acagagcaag 7980
tggacaccct gctctgtgat attggggagt catcttctaa tccaacaata gaggaaggaa 8040
gaacattaag agttttgaag atggtggagc catggctctc ttcaaaacct gaattctgca 8100
tcaaagtcct caacccctac atgccaacag tcatagagga gctggagaaa ctgcagagaa 8160
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tgaacaggtt cacaacaagg cataggaaac ccacttatga gaaggacgta gatcttgggg 8340
caggaacgag aagtgtctct actgaaacag aaaaaccaga catgacaatc attgggagaa 8400
ggcttcagcg attgcaagag gagcacaaag aaacatggca ttatgatcag gaaaacccat 8460
acagaacctg ggcgtatcat ggaagctatg aagctccttc gacaggctct gcatcctcca 8520
tggtgaacgg ggtggtgaaa ctgctaacaa aaccctggga tgtgattcca atggtgactc 8580
agttagccat gacagataca accccttttg ggcaacaaag agtgttcaaa gagaaggtgg 8640
ataccagaac gccgcaacca aaaccaggca cacgaatggt tatgaccacg acagccaatt 8700
ggctatgggc cctccttgga aagaagaaaa atcccagact gtgtacaagg gaagagttca 8760
tctcaaaagt tagatcaaac gcagccatag gcgcagtctt tcaggaagaa caaggatgga 8820
catcagccag tgaagctgtg aatgacagcc ggttttggga actggttgac aaagaaaggg 8880
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gagaaaattc atggagtgga gtggaagggg aaggtctgca cagattggga tacatcctgg 9120
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caagaatcac tgaggatgac cttcaaaatg aggaactgat cacggaacag atggctcccc 9240
accacaagat cctagccaaa gccattttca aactaaccta tcaaaacaaa gtggtgaaag 9300
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caatcagtgg agacgattgc gtggtgaagc ccctagatga gaggtttggc acttccctcc 9600
tcttcttgaa cgacatggga aaggtgagga aagacattcc gcagtgggaa ccatctaagg 9660
gatggaaaaa ctggcaagag gttccttttt gctcccatca ctttcacaag atctttatga 9720
aggatggccg ctcactagtt gttccatgta gaaaccagga tgaactgata gggagagcca 9780
gaatctcgca gggggctgga tggagcttaa gagaaacagc ctgcctgggc aaagcttacg 9840
cccagatgtg gtcgcttatg tacttccaca gaagggatct gcgtttagcc tccatggcca 9900
tatgctcagc agttccaacg gaatggtttc caacaagcag aacaacatgg tcaatccatg 9960
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tgtaattacc aacaacaaac accaaaggct attgaagtca ggccacttgt gccacggttt 10320
gagcaaaccg tgctgcctgt agctccgcca ataatgggag gcgtaataat ccctagggag 10380
gccatgcgcc acggaagctg tacgcgtggc atattggact agcggttaga ggagacccct 10440
cccatcactg acaaaacgca gcaaaagggg gcccgaagcc aggaggaagc tgtactcctg 10500
gtggaaggac tagaggttag aggagacccc cccaacacaa aaacagcata ttgacgctgg 10560
gaaagaccag agatcctgct gtctctacaa catcaatcca ggcacagagc gccgcaagat 10620
ggattggtgt tgttgatcca acaggttct 10649
Claims (31)
1.一种修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含：
重新编码的prM蛋白，重新编码的包膜(E)蛋白，或两者，
其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，以及
其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
2.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，与其亲本登革病毒相比，所述prM蛋白或E蛋白或两者的表达降低。
3.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。
4.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。
5.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
6.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。
7.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。
8.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
9.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。
10.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自的密码子对偏好性降低至少0.05。
11.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。
12.如权利要求1所述的修饰的登革病毒，其中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒。
13.一种用于在受试者中诱导保护性免疫应答的登革疫苗组合物，所述登革疫苗组合物包含如权利要求1-12中任一项所述的修饰的登革病毒以及药学上可接受的赋形剂或载体。
14.一种在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予有效剂量组合物，所述组合物包含如权利要求1-12中任一项所述的修饰的登革病毒。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述免疫应答为保护性免疫应答，并且给予预防有效剂量或治疗有效剂量的权利要求所述的疫苗组合物。
16.如权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者给予至少一种佐剂。
17.如权利要求14所述的方法，其中，所述免疫应答针对异源登革病毒是交叉保护性的。
18.一种在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：
给予初次剂量的(i)通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的减毒登革病毒，或(ii)修饰的登革病毒，所述修饰的登革病毒包含重新编码的prM蛋白、重新编码的包膜(E)蛋白、或两者，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸，并且其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性，或具有置换为较不频繁的同义密码子的至少5个密码子，或与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸；以及
向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的(i)通过除密码子对去优化或密码子去优化或增加CpG或UpA二核苷酸以外的方法产生的所述减毒登革病毒，或(ii)所述修饰的登革病毒，其中，至少所述初次剂量或所述一个或多个加强剂量为所述修饰的登革病毒。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述一个或多个加强剂量中的第一个在所述初次剂量后约2周进行给予。
20.如权利要求18所述的方法，其中，与其亲本登革病毒相比，所述prM蛋白或E蛋白或两者的表达降低。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的prM蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。
23.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的prM蛋白与其亲本prM蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
24.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有降低的密码子对偏好性。
25.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的E蛋白具有置换为较不频繁使用的同义密码子的至少5个密码子。
26.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的E蛋白与其亲本E蛋白编码序列相比具有数量增加的CpG或UpA二核苷酸。
27.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自具有小于-0.05的密码子对偏好性。
28.如权利要求18所述的方法，其中，所述重新编码的prM或E蛋白编码序列各自的密码子对偏好性降低至少0.05。
29.如权利要求18所述的方法，其中，所述修饰的登革病毒选自1型、2型、3型、4型或它们的组合。
30.如权利要求18所述的方法，其中，所述修饰的登革病毒为修饰的四价登革病毒。
31.一种制备修饰的登革病毒基因组的方法，所述方法包括：
获得编码登革病毒包膜蛋白的核苷酸序列；
重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及
将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸置换到亲本登革病毒基因组中，以制备修饰的登革病毒基因组；由此，与所述亲本病毒相比，所述重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达降低。
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