CN114292308A - 手性胆甾类荧光探针及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明利用具有荧光性质的胆甾类化合物作为荧光探针，采用差紫外光光度滴定法、荧光滴定法、Job法对酚酸、含氮碱基等分子识别配合能力及机制进行考察，同时建立了胆甾类荧光探针对食品中性分子的快速检测方法，为食品化学成分分析提供快速、简便的分析手段。

Description

手性胆甾类荧光探针及其用途

技术领域

本发明涉及手性胆甾类荧光探针。

背景技术

中性分子普遍存在于自然界中，例如有机酸广泛存在于食物中，具有软化血管、帮助消化吸收的作用，其中亚油酸是一种存在于多种食用油中的营养物质，但当人体摄入过量的亚油酸时会引起消化功能紊乱^[1]；酚酸具有抗氧化抑菌作用，其中的香草酸是去甲肾上腺素在外周神经系统代谢之后的物质，该物质升高往往提示神经母细胞瘤或者是肾母细胞瘤的存在^[2]；含氮碱基是组成遗传密码的基本单元，但人体内的嘌呤含量过多便会导致尿酸大量堆积，进而对肾脏造成巨大的危害，甚至引起痛风^[3]。采用传统方法检测这些中性分子时，不仅操作繁琐能耗大，而且难度高，因而需要开发专一性识别能力较强的主体化合物。

分子钳人工受体的合成与识别性能是近几年急需拓展的方向和领域。胆甾因具有刚性的凹面结构和固有的不对称性，是构筑人工受体结构的理想单元^[4]；可以根据实际需要对胆甾骨架中指向凹面中心的羟基进行不同的化学修饰，构筑成各种类型的分子钳人工受体^[5]；提供一个与客体分子恰好互补的微环境，从而通过氢键、π-π堆积和范德华力等非共价键作用力达到与底物的识别配合作用^[6]。再通过结构修饰对胆甾类化合物连接上具有荧光性质的基团，从而合成胆甾类荧光探针；其荧光性质可随环境的改变而灵敏变化^[7]。当识别受体与客体作用后，会引起物质荧光波长或强度发生改变，通过观察荧光信号的改变完成对分析物的检测^[8]。近年来，分子钳荧光探针的发展十分迅速，在新药设计、生物传感器以及分子器件等领域展示出了它独特的光彩^[6]。

利用胆甾类化合物对酚酸、含氮碱基进行检测，不仅能够提高检测的时效性，还能够更好地达到绿色检测的目的。

发明内容

本发明拟利用具有荧光性质的胆甾类化合物作为荧光探针，采用差紫外光光度滴定法、荧光滴定法、Job法对酚酸(包括有机酸、多酚类物质)、含氮碱基等中性分子识别配合能力及机制进行考察，同时建立了胆甾类荧光探针对食品中性分子的快速检测方法，以期为食品化学成分分析提供快速、简便的分析手段。

本发明提供了一种手性胆甾类荧光探针，其结构式如下：

本发明还提供了对食品或药品中酚酸的检测方法，它包括如下内容：

(1)待测样品，使用甲醇-有机酸混合溶液提取，提取物回收醇后，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，除去溶剂后，甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；

(2)采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定。

其中，所述紫外分光光度滴定法具体包括：

取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为1×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10^-3mol·L^-1的客体溶液；取2.5mL配制好的主体分子钳溶液于比色皿中，另一比色皿中加入2.5mL二甲基亚砜液作参比，测定所配制主体溶液的吸光度值；然后往主体分子钳溶液中不断加入一定量的客体溶液，与此同时二甲基亚砜溶液参比液中加入同浓度同体积的客体溶液，摇匀，最后测定各组溶液的吸光度值。

其中，所述荧光滴定法包括：

取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为1×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10^-3mol·L^-1的客体溶液；向比色皿样品池中加入2ml浓度为1×10^-4mol·L^-1主体分子钳溶液，激发狭缝宽度5.0nm，发射狭缝宽度5.0nm，激发波长λ为282nm，灵敏度为1，于200～750 nm范围内检测主体分子钳荧光强度；然后不断加入一定量客体溶液，摇匀，每隔三分钟测试各组主客体配合物荧光强度值。

其中，所述Job法包括：

取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为5×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10^-3mol·L^-1的客体溶液；取 20个10mL样品瓶，分别加入4mL DMSO溶液，然后分别编号A1-A10，和B1-B10，在A1-A10号样品瓶中分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL配制好的5×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液，然后在B1-B10号样品瓶中也分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL配制好的5×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液，最后在B1-B10样品瓶中加入1000、900、 800、700、600、500、400、300、200、100μL配制好的浓度为5×10^-3mol·L^-1的客体DMSO溶液，摇匀，分别测试20个样品的紫外吸收曲线，计算A和B组对应编号样品在282nm处吸光度的变化。

与其它两种方法中的客体浓度都相等。

其中，所述酚酸选自咖啡酸、4-香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸或迷迭香酸中的一种或多种。

本发明还提供了对食品或药品中其他酚酸的检测方法，它包括如下内容：

(1)取待测样品，用碱-乙醇溶液进行皂化反应，加水至完全溶解后，再用酸调节pH至2-3，石油醚萃取，石油醚层用碱调制中性，无水硫酸钠吸水，回收石油醚，即得供试品溶液；

(2)采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定。

其中，所述酚酸选自苹果酸、熊果酸、没食子酸、亚油酸、硬脂酸、原儿茶酸。

本发明还提供了对食品或药品中含氮碱基的检测方法，它包括如下内容：

(1)取待测样品，甲醇提取，减压浓缩除去甲醇后，定容，得到供试品溶液；

(2)采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定。

其中，所述含氮碱基为腺嘌呤。

本发明研究发现，上述公开的化合物与该类分子钳有较好的配合作用，有助于对该类化合物的识别，但对其他酚酸、含氮碱基类化合物识别配合作用较低，因此也说明本发明具备一定的特异性。

附图说明

图1化合物7g分子结构

图2化合物7g中加入丁香酸UV图谱

图3化合物7g中加入香草酸UV图谱

图4化合物7g与香草酸形成1：1型配合物Job点图

图5化合物7g加入香草酸后的荧光光谱

图6 25℃时，化合物7g与香草酸形成配合物的1/△F对1/[Q]作图

图7化合物7g与香草酸形成配合物的标准曲线图

图8化合物7g中加入苹果酸UV图谱

图9化合物7g中加入熊果酸UV图谱

图10化合物7g中加入没食子酸UV图谱

图11化合物7g中加入亚油酸UV图谱

图12分子钳7g与亚油酸形成1：1型配合物Job点图

图13化合物7g加入亚油酸后的荧光光谱

图14 25℃时，化合物7g与亚油酸形成配合物的1/△F对1/[Q]作图

图15分子钳7g与亚油酸形成配合物的标准曲线图

图16化合物7g中加入腺嘌呤UV图谱

图17化合物7g中加入胞嘧啶UV图谱

图18分子钳7g与腺嘌呤形成1：1型配合物Job点图

图19化合物7g在加入腺嘌呤后的荧光光谱

图20 25℃时，分子钳7g与腺嘌呤形成配合物的1/ΔF对1/[Q]作图

图21分子钳7g与腺嘌呤形成配合物的标准曲线图

具体实施方式

实验部分

1.1材料与仪器

UV-2600型紫外-可见分光光度计、RF-6000型荧光光度计(岛津仪器设备有限公司)；Tissuelyser-96多样品组织研磨仪(上海净信)；R-1001VN旋转蒸发仪 (郑州长城科工贸有限公司)；Scientz-1000C多功能恒温超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；5430R低温高速离心机(湖南赫西仪器有限公司)。

所用化学试剂均为分析纯或化学纯，主体分子钳7g为本课题组合成。

1.2胆甾类荧光探针识别性能研究方法

1.2.1紫外分光光度滴定法

用二甲基亚砜溶液配制浓度为1×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液及初始浓度为5×10^-3mol·L^-1的客体溶液，首先量取2.5mL配制好的主体分子钳溶液于其中一个比色皿中，另一比色皿中加入2.5mL二甲基亚砜液作参比，测定所配制主体溶液的吸光度值。然后往主体分子钳溶液中不断加入一定量的客体分子，与此同时二甲基亚砜溶液参比液中加入同浓度同体积的客体溶液，摇匀，最后测定各组配合物溶液的吸光度值^[10]。一个主体中加入客体数至少8次，得到至少 8条以上的光谱线^[11]。

1.2.2荧光滴定法

首先向比色皿样品池中加入2mL浓度为1×10^-4mol·L^-1主体分子钳溶液，激发狭缝宽度5.0nm，发射狭缝宽度5.0nm，激发波长λ为282nm，灵敏度为1，于200～750nm范围内检测主体分子钳荧光强度。然后不断加入一定量客体溶液，摇匀，每隔三分钟测试各组主客体配合物荧光强度值^[12]。

1.2.3 Job法

取20个10mL样品瓶，分别加入4mL DMSO溶液，然后分别编号A1-A10，和B1-B10，在A1-A10号样品瓶中分别加入100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000μL配制好的5×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液，然后在B1-B10 号样品瓶中也分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL 配制好的5×10^-4mol·L^-1的主体分子钳溶液，最后在B1-B10样品瓶中加入1000、 900、800、700、600、500、400、300、200、100μL配制好的客体DMSO溶液，摇匀，分别测试20个样品的紫外吸收曲线，计算A和B组对应编号样品在282nm 处吸光度的变化^[13.14]。

1.3胆甾类荧光探针在检测食品中性分子的应用研究

1.3.1香兰荚豆中香草酸提取液的制备

称取香兰荚豆3g，研磨至粉末，加入30ml的甲醇-0.5％冰醋酸溶液(75:25)，超声波提取1h，冷却过滤，滤液于65℃条件下蒸干至无醇味，然后用乙酸乙酯萃取五次，甲醇溶解定容77℃条件下水浴蒸干的合并萃取液至2ml，4000r/min离心10min，取上清液进行测定[15]。

1.3.2小米糠油中亚油酸提取液的制备

称取小米糠油10g，用5倍体积5％NaOH乙醇溶液溶于锥形瓶中，在90℃加热条件下搅拌反应2h，待皂化液冷却后用蒸馏水稀释至完全溶解，并用1 mol/L盐酸调至溶液pH 2-3，石油醚萃取分离。用1mol/L NaOH溶液将石油醚层溶液调至中性，用少量无水硫酸钠去除水分，回收石油醚，得到混合脂肪酸^[16]。

1.3.3猪肝中腺嘌呤提取液的制备

称取10g新鲜猪肝，研磨至浆糊状，加入100ml 20％甲醇溶液，置于微波萃取仪中，50℃恒温条件下提取60min，减压浓缩浸膏状，用少量蒸馏水溶解定容于100ml容量瓶中，作为待测样液^[17]。

1.3.4实际样品中香草酸、亚油酸、腺嘌呤的快速检测

(1)胆甾类荧光探针7g对香草酸、亚油酸、腺嘌呤检出限的确定

在主体分子钳浓度为1.0×10^-4mol/L的溶液中逐渐滴加客体分子，当客体溶液浓度在2×10^-6～2×10^-5mol/L范围内时，以配合物形成过程中客体浓度对紫外可见吸光度值作图，得标准曲线方程，再根据检出限公式LOD＝3σ/k(σ为标准差，k为拟合直线斜率，下文中皆是)，计算胆甾类荧光探针7g对香草酸、亚油酸、腺嘌呤的检出限。

(2)根据上述所得标准曲线方程分别计算香兰荚豆中的香草酸、小米糠油中的亚油酸、猪肝中的腺嘌呤含量。

本发明记载的三种方法在对酚酸、含氮碱基的测定中均有应用，证明了三种检测方法的可行性，紫外滴定和荧光滴定方法可以二选一，主要判定主客体间是否产生识别作用，Job法主要进一步验证主客体间的配位比；在后续食品样品中香草酸、亚油酸、腺嘌呤的检测应用中为避免内容重复赘余，故只用一种方法进行含量检测。

1结果与讨论

2.1胆甾类荧光探针对酚酸的识别作用研究

2.1.1紫外分光光度滴定法结果与分析

以咖啡酸、4-香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸、迷迭香酸为客体，来考察主体分子钳人工受体7g对上述中性分子的识别性能。用DMSO作溶剂，保持所考察的主体分子钳的浓度不发生改变，逐渐改变加入的客体酚酸分子的溶液浓度，此时紫外光谱图中主体特征吸光度显现出规律性下降趋势。对所考察的客体酚酸，在客体起始浓度[G]0远远大于主体起始浓度[H]0时，根据线性拟合 (Benesi-Hildebrand方程)，在1×10^-5～3×10^-4mol/L范围内，以1/[G]0对1/ΔA 作图，显现出良好的线性关系(R1＝0.9933；R2＝0.9965)，由此可以证明主客体之间的识别配合作用，通过线性研究表明1：1型超分子配合物^[18]。实验中较为典型的紫外吸收光谱图(见图2、图3)以及相应的线性关系。根据直线的截距和斜率计算出配合物的结合常数(Ka)和自由能变化(-ΔG0)(见表1)。

表1在25℃时，在二甲基亚砜溶液中分子钳7g对丁香酸、香草酸形成配合物的结合常数Ka/(L/mol)和自由能变化值ΔG0/(J/mol)

2.1.2配位比的确定

Job法试验结果如图4所示，由图可知，当[7g]/([7g]+香草酸)在0.5时，所得到的紫外可见吸光度值其吸光度差值最大。由此可验证，主体分子钳子7g 与香草酸中的一个分子识别形成了1：1型主客体超分子配合物。

2.1.3荧光滴定法结果与分析

为进一步考察主体7g对香草酸的识别配合作用及结合推动力，采用荧光光谱法对香草酸进行探究。其荧光图谱如图5所示，当荧光体中加入猝灭剂后，此时体系的荧光强度随着猝灭剂加入量的增加而降低。根据Lineweaver-Burk双倒数曲线方程，以1/(F₀-F)对1/[Q]作图(图6)，呈现出良好的线性关系且在香草酸高浓度时没有偏离线性。由此可以证明主客体之间形成了静态淬灭，可能是主体 7g与香草酸由氢键、疏水作用和静电作用等弱的作用力结合生成。根据直线斜率和截距可得出结合常数值为913mol/L，此结果与紫外分光光度滴定法计算所得 Ka值接近。

综上所述，通过主体分子钳7g对客体酚酸分子的识别研究，表明在所选取的酚酸分子中只有丁香酸和香草酸表现出了识别能力，经过荧光滴定及Job法进一步验证，表明主体分子与香草酸之间形成1:1型静态淬灭超分子配合物；主体分子钳7g对客体酚酸结合常数Ka为丁香酸>香草酸。

2.1.4胆甾类荧光探针对香兰荚豆中香草酸的检测结果

以配合物形成过程中香草酸浓度对紫外可见吸光度值作图，得图7，经拟合得到其在228nm处的标准曲线方程为y＝-0.0022x+0.524，相关系数为0.995，根据公式LOD＝3σ/k，计算出主体分子钳7g对香草酸的检出限为1.6μmol/L。香兰荚豆中香草酸的含量为0.148mg/g，此结果与超声提取香草兰豆荚中香兰素的工艺研究一文中的检出采用超声提取-高相液相色谱分析所测结果(0.108mg/g)相近。表明可通过主体分子钳7g与香草酸结合形成的超分子配合物研究规律总结，建立快速有效的香草酸检测新手段。

2.2胆甾类荧光探针对其他酚酸的选择性识别

2.2.1配合物的形成及其化学计量

以苹果酸、熊果酸、没食子酸、亚油酸、硬脂酸、原儿茶酸为客体分子，考察分子钳受体7g对酚酸的选择性识别性能。以DMSO作溶剂，固定主体分子钳的浓度，加入不同浓度的客体。随着苹果酸、熊果酸、没食子酸、亚油酸、硬脂酸、原儿茶酸的不断加入，主体特征吸收处的吸光度呈规律性下降。说明分子钳受体7g对与苹果酸、熊果酸、没食子酸和亚油酸产生了识别配合作用。

对所考察的客体酚酸在[G]₀》[H]₀时，以1/[G]₀对1/ΔA作图，得到良好的线性关系，表明主客体间形成1:1型超分子配合物。典型的紫外吸收变化及相应的线性关系见图8、图9、图10、图11，根据直线的截距和斜率计算出配合物的结合常数(Ka)和自由能变化(ΔG₀)(表2)

表2在25℃时，在二甲基亚砜溶液中分子钳7g对苹果酸、熊果酸、没食子酸和亚油酸形成配合物的结合常数Ka/(mol/L)和自由能变化值ΔG0/(J/mol)

2.2.2 Job法试验结果

图12为亚油酸Job点图，由图可知，当[7g]/([7g]+亚油酸)在0.5时，所得到的紫外可见吸光度值发生转折。因此同样说明主体分子钳子7g与亚油酸中的一个分子识别，形成1：1型主客体超分子配合物。

2.2.3荧光滴定法结果与分析

为进一步考察主体7g对亚油酸的识别配合作用及结合推动力，采用荧光光谱法对亚油酸进行探究。其荧光图谱如图13所示，当主体溶液中不断加入亚油酸溶液后，此时体系的荧光强度随着客体加人量的增加而逐渐降低。以1/(F₀-F)对 1/[Q]作图(图14)，呈现出良好的线性关系且在亚油酸高浓度时没有偏离线性。由此可以证明主客体之间形成了静态淬灭。根据直线斜率和截距可得出结合常数值为3293.5mol/L，此结果与紫外分光光度滴定法计算所得Ka值接近。

综上所述：上述分子钳对所考察的客体苹果酸、熊果酸、没食子酸和亚油酸具有识别能力，选取结合常数最大亚油酸为重点对象进一步分析，结果表明主与亚油酸形成了1:1型静态淬灭超分子配合物。

2.2.4胆甾类荧光探针对小米糠油中亚油酸的检测结果

以配合物形成过程中亚油酸浓度对紫外可见吸光度值作图，得图15，经拟合得到其在228nm处的标准曲线方程为y＝0.0106x-35.665，相关系数为0.9932，其吸光度值为3.900，根据公式LOD＝3σ/k，计算出主体分子钳7g对亚油酸的检出限为1.2μmol/L。小米糠油中亚油酸的含量为70mg/g，此结果与小米糠油中亚油酸的提取工艺研究一文中的检出尿素包合-气象色谱分析所测结果(76.5mg/g) 相近。表明可通过主体分子钳7g与亚油酸结合形成的超分子配合物研究规律总结，可建立快速有效的亚油酸检测新手段。

2.3胆甾类荧光探针对含氮碱基的识别

2.3.1主客体之间配合物的形成以及其化学计量

采用紫外光谱滴定法，依此对腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶这五种含氮碱基进行检测，保持主体分子钳7g的浓度不变，将一定体积的客体加入到主体溶液中，随着客体浓度的增大，主客体配合物最大吸收处的吸光度呈规律性的下降，所测具有识别作用的含氮碱基为腺嘌呤和胞嘧啶，紫外吸收图谱见图16、图17。

在客体分子起始浓度[G]0远远大于主体分子起始浓度[H]0时，用1/△A对 1/[G]0作图，显现出良好的线性关系，主体分子钳7g与腺嘌呤、胞嘧啶形成配合物的1/△A对1/[G]0作图，可以看出主客体之间形成了1∶1型超分子配合物。

配合物的结合常数(Ka)和自由能变化(△G0)可由直线截距和斜率计算得出，见表3，直观的反应了主体7g对客体腺嘌呤和胞嘧啶具有不同的识别性能。

表3在25℃时，在二甲基亚砜溶液中分子钳7g对腺嘌呤和胞嘧啶形成配合物的结合常数 Ka/(mol/L)和自由能变化值ΔG0/(J/mol)

2.3.2 Job法试验结果

图18为腺嘌呤Job点图，由图可知，当[7g]/([7g]+腺嘌呤)在0.5时，所得到的紫外可见吸光度值发生转折^[15]。由此可验证，主体分子钳子7g与腺嘌呤中的一个分子识别，形成1：1型主客体超分子配合物。

2.3.3荧光滴定法结果与分析

为进一步考察主体7g对腺嘌呤的识别配合作用及结合推动力，采用荧光光谱法对进行探究。其荧光图谱如图19所示，当主体溶液中不断加入客体溶液后，此时体系的荧光强度随着客体加人量的增加而逐渐降低。以1/(F₀-F)对1/[Q]作图 (图20)，呈现出良好的线性关系且在亚油酸高浓度时没有偏离线性。由此可以证明主客体之间形成了静态淬灭。根据直线斜率和截距可得出结合常数值为 5440.63mol/L，此结果与紫外分光光度滴定法计算所得Ka值接近。

由以上数据可以得到以下结论：手性胆甾类荧光探针对实验选取的的客体腺嘌呤和胞嘧啶具有识别配合能力，所选取的主体分子钳对所考察的含氮碱基的识别结合常数为：腺嘌呤＞胞嘧啶，对腺嘌呤通过Job法和荧光滴定对主客体识别能力进一步测定，表明腺嘌呤与主体分子钳形成了1∶1型静态淬灭超分子配合物。

2.3.4胆甾类荧光探针对猪肝中腺嘌呤检测结果

以配合物形成过程中亚油酸浓度对紫外可见吸光度值作图，得图21，经拟合得到其在228nm处的标准曲线方程为y＝-0.0024x+0.6034，相关系数为0.9911，其吸光度值为1.767，根据公式LOD＝3σ/k，计算出主体分子钳7g对亚油酸的检出限为1.4μmol/L。猪肝中腺嘌呤含量为81mg/100g，此结果与，此结果与食品中嘌呤含量分布及其高效液相色谱检测研究进展一文中的超声提取-气象色谱分析所测结果(89.81mg/100g)相近。表明可通过主体分子7g与腺嘌呤结合形成的超分子配合物研究规律总结，可建立快速有效的腺嘌呤检测新手段。

所考察的胆甾类荧光探针钳7g对客体酚酸、含氮碱基有对映选择识别能力。利用紫外分光光度法进行识别配合作用研究时，当主客体大小、形状和几何互补关系较好时，形成超分子配合物的结合常数相应较大。氢键、π–π堆叠及范德华力的协同作用是主体对客体中性有机小分子产生识别作用的主要推动力。主客体间芳环引起π–π堆叠越有效，形成氢键数目越多其结合常数也越大，经研究发现，同一主体分子，由于识别的客体分子几何构形不同，所带基团不同，从而导致对同种类客体分子的识别模式也不相同。例如酚酸中，由于主体钳形的裂穴空腔太大与丁香酸的尺寸和形状不能很好匹配，导致无明显的识别作用，而7g分子的钳形裂穴可以与香草酸适当匹配，从而产生识别配合能力的差异；分子钳7g对酚酸识别效果为亚油酸>苹果酸>没食子酸>熊果酸；这个结果表明，受体与亚油酸形成更稳定的超分子配合物。主要原因是亚油酸与分子钳受体的大小、形状匹配比其他酚酸好，其主客体间可形成更多更强的氢键，因而识别作用较强。此外，由于主体与其他酚酸之间形状不能很好匹配形成面对面(face to face)或边对面(edge to face)的包结，因而π-πstacking作用对识别的贡献很小。分子钳7g对熊果酸识别作用较差，原因可能是手臂芳环取代基体积较大，在一定程度上阻碍了熊果酸进入分子裂缝的空腔，从而影响了主客体之间的包结配合；对所考察的含氮碱基的识别结合能力为：腺嘌呤＞胞嘧啶，分子钳手臂与胆甾骨架形成一个较为开阔的裂穴，因腺嘌呤和胞嘧啶因其大小、形状与7g能较好匹配，进入这个相对并不拥挤的空腔时较为容易，所以包结配合作用较强。但分子钳7g与胞嘧啶形成氢键的距离可能都较大，作用较弱.导致其结合常数低于腺嘌呤。

在荧光滴定实验中，对于具有强荧光的化合物和荧光试剂，分子的共轭体系必须具有刚性平面结构^[19]。刚性平面结构增加了π电子体系的相互作用和共轭，使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小，降低了碰撞去活化的可能性。在对香草酸、亚油酸、腺嘌呤进行荧光滴定研究时，随着淬灭剂含量的增加，荧光强度逐渐减弱，可能是由于淬灭剂的加入破坏了π电子体系的相互作用和共轭，改变了平面刚性结构，从而使得超分子配合物共轭π键体系减小，π电子不易被激发，宏观表现为荧光强度减小。同时产生荧光淬灭现象还与取代基效应有关。香草酸中存在-C＝O、-COOH、-CHO、-COR；亚油酸存在-COOH；腺嘌呤中存在-N＝N。这些吸电子取代基，取代后荧光体的荧光强度一般会减弱甚至猝灭。这是由于虽然这类基团中也都含有n电子，但其n电子的电子云不与芳环上π电子云共平面，不能构成n→π共轭，不能扩大电子共轭程度，这类化合物的 n→π*跃迁属于禁阻跃迁，其摩尔吸收系数小，导致荧光减弱。

2结论

本论文通过构建的特定的手性胆甾类荧光探针采用差紫外光光度滴定法、 Job法荧光滴定法给对酚酸、含氮碱基等中性分子识别配合能力及机制进行研究，经检测所考察的中性分子与主体分子钳子具有良好的识别作用，主客体之间形成了1：1型静态淬灭超分子配合物。建立了主体分子钳7g快速检测酚酸、含氮碱基的方法，证实了此种新的检测方法可靠，有望在技术成熟后运用于食品中相关成分的检测。

参考文献

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Claims (9)

1.对食品或药品中酚酸的检测方法，其特征在于：它包括如下内容：

(1)待测样品，使用甲醇-有机酸混合溶液提取，提取物回收醇后，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，除去溶剂后，甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；

(2)使用化合物7g采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定，所述化合物7g结构式为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述紫外分光光度滴定法具体包括：

取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为1×10-4mol·L-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10-3mol·L-1的客体溶液；取2.5mL配制好的主体分子钳溶液于比色皿中，另一比色皿中加入2.5mL二甲基亚砜液作参比，测定所配制主体溶液的吸光度值；然后往主体分子钳溶液中不断加入一定量的客体溶液，与此同时二甲基亚砜溶液参比液中加入同浓度同体积的客体溶液，摇匀，最后测定各组溶液的吸光度值。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述荧光滴定法包括：取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为1×10-4mol·L-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10-3mol·L-1的客体溶液；向比色皿样品池中加入2ml浓度为1×10-4mol·L-1主体分子钳溶液，激发狭缝宽度5.0nm，发射狭缝宽度5.0nm，激发波长λ为282nm，灵敏度为1，于200～750nm范围内检测主体分子钳荧光强度；然后不断加入一定量客体溶液，摇匀，每隔三分钟测试各组主客体配合物荧光强度值。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述Job法包括：

取化合物7g和二甲基亚砜，配制浓度为5×10-4mol·L-1的主体分子钳溶液；取供试品溶液和二甲基亚砜，配成初始浓度为5×10-3mol·L-1的客体溶液；取20个10mL样品瓶，分别加入4mL DMSO溶液，然后分别编号A1-A10，和B1-B10，在A1-A10号样品瓶中分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL配制好的5×10-4mol·L-1的主体分子钳溶液，然后在B1-B10号样品瓶中也分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL配制好的5×10-4mol·L-1的主体分子钳溶液，最后在B1-B10样品瓶中加入1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100μL配制好浓度为5×10^-3mol·L-¹客体DMSO溶液，摇匀，分别测试20个样品的紫外吸收曲线，计算A和B组对应编号样品在282nm处吸光度的变化。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述酚酸选自咖啡酸、4-香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸或迷迭香酸中的一种或多种。

6.对食品或药品中酚酸的检测方法，其特征在于：它包括如下内容：

(1)取待测样品，用碱-乙醇溶液进行皂化反应，加水至完全溶解后，再用酸调节pH至2-3，石油醚萃取，石油醚层用碱调制中性，无水硫酸钠吸水，回收石油醚，即得供试品溶液；

(2)使用化合物7g采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定，所述化合物7g结构式为：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述酚酸选自苹果酸、熊果酸、没食子酸、亚油酸、硬脂酸、原儿茶酸。

8.对食品或药品中含氮碱基的检测方法，其特征在于：它包括如下内容：

(1)取待测样品，甲醇提取，减压浓缩除去甲醇后，定容，得到供试品溶液；

(2)使用化合物7g采用紫外分光光度滴定法、荧光滴定法、Job法中的一种进行测定，所述化合物7g结构式为：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述含氮碱基为腺嘌呤。

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