CN114288249A - 一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物及其制备方法和应用，包括：以在接触胎盘组织间液高表达的酶的作用下靶向崩解的酶底物多肽‑PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，以胎盘重要的免疫调节细胞Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达标志物抗体修饰的药物载体作为内核，所述药物载体中负载超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物、治疗基因或其组合。本发明的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物可有效避免母体胎盘外其他器官和胎儿非特异性药物吸收，进而实现对胎盘内Treg细胞和Th17细胞特异性药物的递送和功能调控。
Description
技术领域
本发明涉及化学、生物医学工程领域，具体涉及一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物及其制备方法和应用。
背景技术
复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)指与同一配偶发生连续3次或3次以上的自然流产，是一种非常常见的妊娠并发症，发病率高达5％。RSA患者再次妊娠发生流产的风险较高，尤其是已连续发生3次流产者，其再发风险高达70％～80％，严重影响患者的身心健康。导致RSA的病因复杂，既往认为半数或以上的RSA患者的发病与妊娠期血栓前状态、女性生殖道解剖结构异常、内分泌功能异常、夫妻染色体异常、胚胎染色体或基因异常有关【BMC Med.2013Jun 26；11:154】。但是，以往受限于检查和分析手段，对RSA的病因及发病机制不明，所以，对其缺乏有效的治疗手段。
近年来通过新的生殖免疫学手段研究发现，绝大多数的RSA发病，均伴有母体/胎盘的自身免疫调控功能异常有关，该观点已经被专家广泛认可。妊娠是一个复杂且协调的过程，伴随诸多的母体/胎儿免疫调控机制，整个原理与同种异体间移植导致身体产生相应的生理反应相似。成功的妊娠中胎儿在蜕膜和胎盘滋养组织构成的母-胎界面，发生并维持母体的免疫耐受，直至胎儿娩出【Front Immunol.2019Oct 18；10:2317.】。在此过程中，孕妇CD3+T细胞的免疫调节反应被认为是妊娠期母胎耐受的重要组成部分。CD3+T细胞中最重要的免疫调节细胞包括Treg细胞和Th17细胞【Am J Reprod Immunol.2018Oct；80(4):e13018.】。
Th17细胞是促炎症的免疫细胞亚群，特异性分泌IL-17。Th17细胞源自于初始T细胞，是CD3+T细胞重要促炎症亚群之一，在IL-6、转化生长因子β(TGF-β)等的作用下活化并分泌相关细胞因子发挥作用。当Th17在胎盘中过度激活，超出正常生理水平时，对妊娠极为不利，会造成流产、早产、子痫前期等病理妊娠【Eur J Immunol.2010Jul；40(7):1830-5.】。Treg细胞是一种具有免疫抑制特性的T细胞亚群。Treg细胞可以通过表达IL-10、IL-35、TGF-β和FGL2等细胞因子，或者通过与效应靶细胞直接作用等途径发挥其抑制炎症作用。其在妊娠过程的自身免疫耐受维持过程中起关键性作用【Int Immunopharmacol.2011May；11(5):536-42.】。研究证实，在复发性流产的患者体内存在明显的Treg细胞浓度降低和功能抑制【Clin Chim Acta.2011Apr 11；412(9-10):702-8.】。
流产(尤其是复发性流产)的发生与免疫失衡引起的促炎细胞激活、促炎因子大量释放，以及抑制炎症的细胞抑制、抑炎因子释放不足有关。而这些因子的分泌释放有赖于Th17细胞和Treg细胞，它们之间通过相互作用来调节母-胎界面免疫耐受的平衡，进而维持妊娠的正常进行，一旦它们之间的平衡被打破，则导致自然流产等不良妊娠结局【J CellPhysiol.2018Sep；233(9):6561-6573.】。
研究表明，在正常妊娠孕妇体内Treg/Th17平衡应转向Treg优势，而包括RSA在内的生殖失败时则以Th17优势为主。Treg细胞及其相关细胞因子激活对妊娠结局有利，而Th17细胞及其相关细胞因子激活则不利于妊娠。RSA患者的CD3+T细胞中，Treg和Th17细胞相关转录因子Foxp3和RORγt分别表达下调和上调，导致Treg的细胞数量明显减少，而Th17细胞出现过度活化，Treg/Th17比例明显下调【Ginekol Pol.2019；90(2):109-113.】。
在既往的研究中，开发了很多可以调控Treg细胞和Th17细胞功能的小分子或基因治疗药物。如前所述，Th17细胞的激活依赖IL-6相关通路的激活，转录因子RORγt的上调导致Treg细胞比例的降低和Th17细胞比例的升高。Hydrocortisone hemisuccinate是一种糖皮质激素，本身具有抑制炎症的有益功效，更为突出的是，它可以确切抑制IL-6的生物活性【Biol Pharm Bull.2001Jun；24(6):701-3；Int J Immunopharmacol.1987；9(4):469-73.】。另外，我们可以使用siRNA技术，实现对转录因子RORγt表达的确切抑制。我们的前期研究已经证实，对CD3+T细胞联合应用Hydrocortisone hemisuccinate和RORγt-siRNA，可以产生协同作用，显著升高Treg/Th17比例，产生优于单药应用的抑制炎症的免疫调节效果。所以，如果能够在体内将Hydrocortisone hemisuccinate和RORγt-siRNA递送进入胎盘中的CD3+T细胞，将会有效抑制胎盘炎症，使得可能流产的胎盘和胎儿得到挽救【SciRep.2019Sep 11；9(1):13087.】。
申请人前期在全世界较早开展了深入的对全身T细胞进行纳米药物递送的研究，对该领域的实际困难具有清晰的认识。就申请人掌握的技术，对体内的CD3+T细胞进行药物递送已经在早期的研究中实现，研究结果已受到同行认可【ACS Nano.2012Dec 21；6(12):10646-57.】。但是，众所周知，CD3+T细胞随血液遍布全身，在体内不同位置发挥不同的免疫调节功能，一旦受到系统性杀伤，将会导致类似“免疫力降低”、“艾滋病”、“自身免疫病”的症状。所以，如何才能将CD3+T细胞功能调控药物，在避免影响胎盘外CD3+细胞的前提下，选择性递送于胎盘中的CD3+T细胞及其亚群Treg细胞和Th17细胞中，对其进行确切的，仅限于胎盘局部的功能调控，是该领域的关键科学问题。
开发Treg/Th17细胞比例和免疫细胞功能调控药物存在母体和胎儿两方面的病理生理学障碍。孕妇的药物使用和新药开发需要考虑对药物在母体和胎儿本身两方面的分布，以及产生两方面的毒性问题。绝大多数的药物可以通过胎盘，分布进入胎儿侧，影响胎儿发育。所以，包括急救药品在内的孕妇用药均存在极多的禁忌。孕妇用药按照致畸性质分为5类，除极少数毒性最小的药物归入a、b类外，其余多数c、d、e类药物对胎儿具有明显损害。孕妇怀孕期间体内代谢负担重，免疫变化复杂。所以，即使药物在非怀孕期间没有明显的毒性，其也有可能对孕妇产生明显的副作用。因此，目前在体外实验中可能对Treg细胞和Th17细胞有效的药物，无法在保证母体胎盘外器官和胎儿安全的条件下，实现调控Treg细胞和Th17细胞功能，可能会导致全身免疫细胞的功能失调和严重的免疫并发症。
既往体外实验研究筛选的可能具有Treg细胞和Th17细胞功能调控作用的小分子药物或基因治疗药物，通过注射或口服，进入孕妇循环后，首先会在胎盘外的孕妇全身细胞起效，产生副作用；同时药物进入胎盘后，由于向胎儿侧的血供丰富，导致药物迅速穿过胎盘屏障，对胎儿造成损害。所以，这些药物均无法实现临床应用。因此目前临床上，对前述复发性流产、胎盘种植等胎盘免疫相关疾病，仍然没有确切的药物干预手段。医生只能针对胎盘功能失调疾病引发的症状，进行被动的对症治疗，甚至引产终止妊娠。而不能通过Treg细胞和Th17细胞等免疫细胞的精准功能调节，实现真正的胎盘功能恢复。因此，如何避免对母体和胎儿的毒性，实现胎盘选择性的Treg细胞和Th17细胞功能调控药物的有效递送，是解决胎盘Treg细胞和Th17细胞功能失调所致复发性流产的关键。
目前的高分子纳米载体药物，在多种疾病中可能实现对病变目的细胞的特异性药物递送。由于这些载体无法解决可能对母体和胎儿非特异性分布造成毒副作用的问题，所以Treg细胞和Th17细胞特异性递送载体开发存在很大的困难。目前研究者尝试过的可能促进Treg细胞和Th17细胞特异性纳米药物递送的手段有2种，一种是通过加大纳米药物粒径，使其不能通过胎膜屏障，滞留于胎盘产生药物递送效果；另一种是针对Treg细胞和Th17细胞膜标志物，进行抗体修饰纳米载体的特异性递送。
加大纳米药物粒径，促进胎盘内药物分布的原理在于，实验研究发现，＜300nm的纳米药物无法滞留于胎盘，容易通过胎盘进入胎儿。所以研究者尝试合成粒径＞300nm的纳米药物，使其滞留于胎盘，产生对胎盘Treg细胞和Th17细胞在内的多种细胞的功能调控。但是，过大的药物粒径(＞100nm)不利于药物的体内分布。此类＞300nm的纳米药物在母体循环中多数被网状内皮系统捕获，在全身各处产生副作用；即使仍有少量能够到达胎盘中，实现仅针对胎盘内Treg细胞和Th17细胞特异性分布的比例也较低。所以，需要采用其他方式实现纳米药物在胎盘中的滞留和对胎盘内Treg细胞和Th17细胞的选择性靶向。
纳米药物可采用纳米药物链接抗体，靶向识别目的细胞的细胞膜标志，实现对目的细胞的特异性递送。Treg细胞和Th17细胞具有一些确定的，区别于胎盘组织中与其他胎盘基质细胞的表面标志(如cluster of differentiation 3，简称CD3)，可供与胎盘中其他细胞进行区别。但是，全身多器官组织表达量分析发现，这种表面标志在胎盘外其他部位的所有CD3+T淋巴细胞，以及部分体细胞也有显著表达。如果在纳米药物载体表面连接CD3的抗体，直接体内应用，将造成对体内其他CD3+T细胞，以及其他表达标志物CD3的细胞的副作用。因此，只有在血液循环中进入胎盘前，屏蔽纳米载体的Treg细胞和Th17细胞识别抗体，才可以避免其分布于胎盘外细胞影响全身免疫，保证其仅分布于胎盘内的Treg细胞和Th17细胞。
综上所述，目前缺乏可有效避免母体和胎儿非特异性药物吸收，进而实现对胎盘内Treg细胞和Th17细胞特异性药物递送和功能调控的纳米载体系统。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其利用胎盘微环境靶向，减少药物进入胎盘前在母体全身免疫细胞和器官组织分布，利用Treg细胞和Th17细胞膜标志物靶向，减少药物通过胎盘后向胎儿免疫系统和器官组织分布，可有效避免母体胎盘外其他器官和胎儿非特异性药物吸收，进而实现对胎盘内Treg细胞和Th17细胞特异性的药物选择性递送和精准功能调控。
本发明的另一目的在于提供上述调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，包括：以在接触胎盘组织间液高表达的酶的作用下靶向崩解的酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，以胎盘Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达的标志物抗体修饰的药物载体作为内核，所述药物载体中负载超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物、治疗基因或其组合；所述胎盘组织间液高表达的酶为基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、溶菌酶、激肽酶、组胺酶或催产素酶中的一种或几种；所述药物载体为聚乙二醇修饰的聚阳离子载体与疏水性可降解聚酯形成的共聚物；所述胎盘Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达的标志物抗体为CD3抗体的Fab段。
孕妇胎盘中富含多种胎盘及其组织微环境高表达的酶，本发明所述胎盘组织间液高表达的的酶为基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、溶菌酶、激肽酶、组胺酶、催产素酶或其他基质金属蛋白酶中的一种或几种，其中基质金属蛋白酶2(matrixmetalloprotein，MMP2)在胎盘组织液中表达量极高，正常人体血液和组织液中几乎不表达，因此，优选基质金属蛋白酶2。
基质金属蛋白酶2底物多肽可以选择Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Meth-Lys(Dnp)-NH2，分子量：1656.86Da。
本发明的药物载体为聚乙二醇修饰的聚阳离子载体与疏水性可降解聚酯形成的共聚物，所述共聚物为聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯PEG-PEI-PCL、聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚乳酸PEG-PEI-PLA或聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸PEG-PEI-PLGA中的一种或几种，优选聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯PEG-PEI-PCL。
本发明所述的共聚物可通过现有技术合成，如先将PEG通过化学反应与聚阳离子载体形成共聚物，然后利用聚阳离子的活性基团与活化后的聚酯段反应形成共聚物。
本发明所述的共聚物也可通过市购得到。
本发明药物载体中负载超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物、治疗基因或其组合。
所述小分子药物为Hydrocortisone hemisuccinate，所述治疗基因为抑制RORγt(Nuclear Receptor RAR-related orphan receptor gammat)基因表达的siRNA。
在本研究中设计在Treg细胞和Th17细胞中，通过抑制IL-6及其通路活性、抑制RORγt的表达，实现关键转录因子活性的调控，产生对免疫调节功能的协同作用，有效地促进Treg细胞和Th17细胞的比例变化和免疫功能调节，促进复发性流产病变胎盘免疫耐受状态的恢复，减轻胎盘炎症，改善预后。
本发明所述调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的平均粒径为80nm-300nm，优选为100nm-205nm，粒径太大不利于体内循环，粒径太小制备难度增大而且不利于负载药物和基因。
本发明还提供了上述调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物和/或基因负载到共聚物，得到复合纳米粒子；
S2、将胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体链接到复合纳米粒子；
S3、将胎盘及其组织微环境高表达的酶的底物多肽链接PEG，得到多肽-PEG；
S4、将多肽-PEG和脂质体混合形成多肽-PEG修饰的脂质双分子膜脂质双分子膜；
S5、将多肽-PEG修饰的脂质双分子膜与复合纳米粒子组装成调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物。
优选的，步骤S1中，共聚物和超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子的质量比为5-15:1。
本发明通过酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，保证了纳米传输体系在进入胎盘酶环境前，在无酶的血液中的分布稳定，减少药物泄露，减少或避免胎盘外其他细胞吞噬。从而保证了母体胎盘外免疫系统和其他组织器官的安全性；MMP2酶敏感外壳在胎盘母体侧含酶的微环境中崩解，释放药物，可以保证药物在母体胎盘中的高效释放和分布；由于酶敏感外壳的引入，无需通过采用大粒径纳米载体结构即可保证对胎盘的分布效率，有效降低纳米载体粒径，保证了药物在进入胎盘前，循环分布的稳定，且保证了网状内皮系统不会大量吞噬载体引起疗效降低和副作用增大。
本发明采用胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体修饰的药物载体作为内核，药物由Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体或抗体片段修饰，可在释放后，确切锚定胎盘中的Treg细胞和Th17细胞膜，保证了在复杂的胎盘环境中，对Treg细胞和Th17细胞的特异性给药，同时避免胎盘中其他细胞服药，产生不必要的胎盘功能损伤；
绝大多数进入胎盘的药物通过抗体靶向，确切锚定于Treg细胞和Th17细胞，保证了药物极少渗漏通过胎盘屏障，进入胎儿侧，保证了胎儿的安全；药物被锚定于Treg细胞和Th17细胞膜后，促进治疗药物和治疗基因内吞入Treg细胞和Th17细胞，实现关键通路活性和转录因子活性调控，保证了确切的Treg细胞和Th17细胞比例和免疫功能调节。
本发明还提供了上述调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物在制备调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能失调疾病药物中的应用，所述调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能失调疾病为复发性流产。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)在本研究中设计在Treg细胞和Th17细胞中通过抑制RORγt的表达，可通过对关键转录因子的调控，产生对Hydrocortisone hemisuccinate的IL-6相关免疫调节通路活性调控功能的协同作用，更加有效地促进Treg细胞和Th17细胞的比例变化和免疫活性，促进复发性流产病变胎盘免疫耐受状态的恢复，减轻症状，改善预后；
(2)本发明以可以在接触胎盘组织间液高表达的特定酶的作用下靶向崩解的酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳；以胎盘Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达的标志物抗体修饰的药物载体作为内核；合成双层结构的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物。这种双层结构能保证纳米药物在孕妇血液循环中，脂质体外壳结构稳定，保持稳定循环，不容易被网状内皮系统在内的其他组织和细胞捕获，不容易影响胎盘外CD3+细胞功能，降低在孕妇体内影响胎盘之外的其他组织分布和释放，降低毒副作用；
(3)在传输体系随血液循环进入胎盘后，其外壳中的酶底物被胎盘组织中高表达的对应的酶分解，保护性脂质双分子外壳在胎盘中迅速崩解，释放出可锚定Treg细胞和Th17细胞膜表面标志的、抗体修饰的纳米药物。该纳米药物避免被母体其他组织细胞吸收，特异性锚定于胎盘中的Treg细胞和Th17细胞膜，进而被Treg细胞和Th17细胞特异性内吞，产生功能调控作用，保证对Treg细胞和Th17细胞疾病进行确切的治疗；
(4)通过确切的“抗原-抗体反应”，使脂质双分子外壳崩解后药物滞留于富含Treg细胞和Th17细胞的胎盘，减少药物渗漏通过胎盘屏障，减少对胎儿的毒副作用；也避免影响胎盘中滋养细胞、血管内皮细胞、其他免疫细胞和其他基质细胞功能。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明的原料来源如下：
Fe含量测定方法：
用原子吸收分光光度计法测纳米药物体系中的Fe含量，用于衡量纳米药物的剂量。取一定量制备好的药物溶液(例如步骤三中溶液取1mL)冻干称重，再将其溶解到1molL-1的HCl溶液中，放置24小时使SPIO中Fe充分离子化，用原子吸收分光光度计检测Fe原子在248.3nm处的吸光度，代入用Fe标准溶液做出的标准曲线中算出Fe的浓度，再反算出冻干前药物溶液中的Fe含量。
粒径测试方法：
用Zeta-Plus电位粒径仪(Brooken Haven)测试样品的粒径，入射激光波长λ＝532nm，入射角θ＝90°，温度为25℃；取三次测量值的平均值。
实施例1：
S1、聚乙酰亚胺接枝聚乙二醇(PEG-PEI)的合成
采用两步法合成聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇(PEG-PEI)，先用羰基二咪唑将单甲基醚聚二醇的端羟基活化，再与聚乙烯亚胺的氨基反应生成PEG-PEI。具体操作如下：称取单甲基醚乙二醇(8.0g，Mn＝2kDa)于反应瓶中，80℃真空干燥6h，在氩气氛围下加入THF(60mL)将其溶解。称取羰基二咪唑(CDI，6.4g)与另一反应瓶中，再将溶有mPEG-OH的THF用恒压滴液漏斗缓慢滴加到CDI瓶中，室温下搅拌反应过夜。加入蒸馏水(0.648mL)使过量的CDI失活，继续搅拌30min。将溶液沉淀到大量的冷乙醚中，过滤后真空干燥得白色粉末状固体mPEG-CDI；
称取PEI(4.4g，MW＝1.8kDa)加入到两口瓶(50mL)中，加入三氯甲烷(20mL)使其溶解加入PEG-CDI(3.2g)，室温下搅拌反应24h，将溶液装到透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，用三氯甲烷中透析24h，将透析袋中溶液减压浓缩，然后沉淀在大量冷乙醚中，过滤干燥得白色粉末装产物mPEG-PEI；
S2、聚乙酰亚胺接枝聚乙二醇接枝聚己内酯(PEG-PEI-PCL)的合成
首先合成PCL-OH，15g干燥的十二醇加入两口瓶中，70℃下真空干燥8h，加2mlSn(Oct)2继续干燥0.5h，然后加入400mL干燥的的ε-己内酯，在105℃搅拌反应24h；冷却后加入100mL乙醇溶解未反应的ε-己内酯，过滤，粗产品溶于250mL四氢呋喃，沉淀在大量无水乙醚中，过滤后干燥得白色粉末状产物，产率96％；
然后合成PCL-CDI，10g PCL-OH(Mn＝5000)加入两口瓶中，50℃下真空干燥8h，溶于50mL四氢呋喃后加入7.2g(10eq.)的羰基二咪唑(CDI)，氩气保护，室温反应24h，沉淀在大量无水乙醚中，过滤，室温真空干燥，得白色粉末状产物，产率90％；
最后将PCL-CDI与PEG-PEI反应制得PEG-PEI-PCL，1.6g PEG-PEI加入到50mL两口瓶中，加入30mL三氯甲烷使其溶解，然后缓慢滴入10mL含200mg PCL-CDI的三氯甲烷溶液，在室温下搅拌反应24h，用透析袋(MWCO＝5kDa)在1000mL三氯甲烷中透析24h，减压除去部分三氯甲烷，然后沉淀在无水乙醚中，过滤干燥得白色粉末产物，产率86％；
S3、聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯负载SPIO纳米粒子、药物(PEG-PEI-PCL-SPIO/drug)的制备
SPIO(超顺磁性四氧化三铁)按文献【S.H.Sun,H.Zeng,D.B.Robinson,S.Raoux,P.M.Rice,S.X.Wang,G.X Li.Monodisperse MFe2O4(M＝Fe,Co,Mn)Nanoparticles.J.Am.Chem.Soc.2004,126,273-279】报道的方法合成，乙酰丙酮铁Fe(acac)31.4126g(4mmol)，1,2-十六烷二醇5.16g(20mmol)，油酸3.8ml(12mmol)，油胺3.8ml(12mmol)，加入到200ml三口瓶中，然后在氮气保护下加入40ml二苄醚搅拌溶解，在沙浴中加热到200℃回流搅拌2h，然后加热到300℃回流1h，反应体系由暗红色慢慢的变成黑色；在空气中自然冷却，沉淀在150ml乙醇中，在10000rpm转速下离心5分钟，弃去上层清夜，下层沉淀溶解在分别加有4滴油酸和油胺的70ml正己烷中，然后再在10000rpm转速下离心10min去掉不溶解部分，溶液再沉淀在200ml乙醇中，再在10000rpm转速下离心10min，下层沉淀溶解在60ml正己烷中，通入氩气保护，置于4℃下保存备用；
将SPIO的正己烷溶液吹干称重收集5mg的SPIO纳米粒子于血清瓶(10mL)中，称取50mg PEG-PEI-PCL聚合物、Hydrocortisone hemisuccinate 5mg，用二甲基亚砜(3mL)将它们溶解混合均匀，把上述溶液在超声分散下逐滴加入20mL蒸馏水中，将反应液置于透析袋(MWCO＝3.5kDa)中透析24h除去二甲基亚砜，用12000r/mim的转速离心，收集沉淀，弃去上清液。再用水将沉淀溶解，超声分散，重复离心操作，最后将制备的PEG-PEI-PCL-SPIO/drug纳米粒子超声分散到水中，用孔径为220nm针头过滤器过滤率，加入纯净水，定容调整PEG-PEI-PCL-SPIO/drug纳米粒子浓度至Fe含量为0.145mg/mL，产物置于4℃下保存备用；
S4、抗体靶向的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯负载SPIO纳米粒子/药物(Fab-PEG-PEI-PCL-SPIO/drug)的制备
先采用现有文献中的方法裂解CD3抗体，获得CD3的Fab段，并提纯。然后将CD3-Fab链接到mal-PEG-COOH上，再用酰胺化反应将连有抗体的PEG与PEG-PEI-PCL-SPIO纳米粒子上的氨基反应制备出Fab-PEG-PEI-PCL-SPIO；
具体操作如下：称取10mg的CD3抗体，在0.5mg·ml-1的木瓜蛋白酶、10mmol·L-1的半胱氨酸、2mmol·L-1的EDTA，pH7.6的条件下酶解4h。酶解产物经ProteinA亲和色谱法分离，穿透峰经DEAE阴离子交换色谱法进一步纯化，透析除盐冻干后得到纯度较高的CD3的Fab片段；
称取1mg的CD3的Fab片段(Mn＝45kDa)，用EDTA溶液(500μL 0.5M)在4℃预处理15min。加入5ml的PBS溶液溶解，加入二硫苏糖醇1mg，25℃反应30min。用截留分子量为1k的离心超滤管离心去除二硫苏糖醇后，加入5ml的PBS溶液溶解，再加入mal-PEG-COOH(2mg，Mn＝4k)混和均匀，在4℃放置过夜。再用截留分子量为5k的离心超滤管离心去除过量的mal-PEG-COOH。用EDC和NHS各500μg活化Fab-PEG-COOH中的羧基15min，后加入步骤3制备好的PEG-PEI-PCL-SPIO/drug 16mL，4℃反应过夜，最后超滤离心除去过量的EDC、NHS的小分子杂质，12000r/min离心除去未连接上的抗体，收集固体溶液，超声分散到蒸馏水中，定容调整Fab-PEG-PEI-PCL-SPIO/drug纳米粒子浓度至Fe含量为0.145mg/mL备用；
S5、治疗基因复合纳米粒子的制备
带正电的PEG-PEI-SPIO(或Fab-PEG-PEI-SPIO)纳米粒子与带负电的RORγt-siRNA可以通过静电作用复合制成纳米复合物。具体操作如下：将400μg的RORγt-siRNA用PBS稀释至终体积1.5mL，振荡均匀。取步骤3制备好的PEG-PEI-SPIO 1.5mL，(或步骤4制备好的Fab-PEG-PEI-SPIO净重1.6mL)纳米粒子超声分散均匀，将RORγt-siRNA稀释溶液与PEG-PEI-SPIO(或Fab-PEG-PEI-SPIO)纳米粒子溶液混匀，将复合物体系定容至Fe含量为0.061mg/mL，吹打混匀并静置30分钟，制得均匀复合物；
S6、PEG-多肽的合成
将0.05mmol基质金属蛋白酶2敏感的多肽(Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Meth-Lys(Dnp)-NH2，分子量：1656.86Da)、5mmol的EDC和5mmol的DMAP溶于10mL乙腈水溶液(乙腈:水＝1:1)，N2保护下于冰水浴上，500rpm下磁力搅拌2h，以活化Peptide。2h后加入0.5mmol的PEG-NHS(分子量3000Da)，继续反应72h。反应结束后，将反应液置于透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，透析72h，冷冻干燥，得到产物PEG-多肽；
S7、PEG-多肽修饰的脂质体壳@治疗基因复合纳米粒子的制备
PEG-多肽和胆固醇(重量各20mg)溶于5mL的二氯甲烷中，用真空旋转真发器将二氯甲烷旋干，使PEG-多肽和胆固醇在圆底烧瓶壁上形成一层脂质体薄膜。缓慢的搅拌下将步骤5制备的治疗基因复合纳米粒子2mL以0.5mL/min的速度滴加到上述PEG-多肽和胆固醇形成的脂质体薄膜中。滴加完成后再继续搅拌30min，使脂质体和治疗基因复合纳米粒子充分组装，最后用强磁铁将载有治疗基因复合纳米粒子的脂质体和空脂质体分开。最后加入2mL生理盐水(0.9％NaCl)溶液将PEG-多肽修饰的脂质体壳@治疗基因复合纳米粒子溶解，孔径为220nm针头过滤器过滤率，定容至Fe含量为0.061mg/mL，4℃下保存，备用。
制备得到的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的具体结构示意图如图1所示。
实施例2-4，对比例1-6：
同实施例1相比，改变步骤S3中聚合物、药物和SPIO的投料量或省略步骤S3、S4、S5、S6、S7中某个步骤可以制备出实施例2-4或对比例1-6，具体见下表1：
表1：实施例和对比例
功能评价实验
1.核磁共振(MRI)实验，评价药物的胎盘特异性递送功能
模型建立：
将雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠2：1数量于发情期合笼交配，第二天雌鼠阴道分泌物涂片行帕帕尼科拉乌染色，光学显微镜下观察标本阴道精子阳性者诊断为妊娠，标记为妊娠第0天(D0)，建立小鼠复发性流产模型。雌性CBA/J小鼠与雄性BALB/C小鼠交配建立正常妊娠模型作为正常对照组。
MRI影像学检测药物的胎盘分布：
复发性流产模型动物于第11天，水合氯醛麻醉后，行MRIT2序列在药物注射前(0h)和注射后2小时(2h)时间点扫描，观察含有SPIO的纳米药物体内分布。尾静脉注射纳米药物的剂量为：(治疗剂量0.31mg/Kg铁当量药物，或等体积的生理盐水)；
使用Philips Intera 1.5T MRI扫描仪，及其动物专用线圈进行C57BL/6j小鼠子宫MRI成像。在MRIbTFE序列上观察C57BL/6j小鼠体内子宫和胚胎区域的信号强度演变，并采用T2map成像技术，测量随着药物中SPIO在体内子宫、胎盘、胚胎和其他器官分布引起的T2弛豫时间改变，计算0h时和2h时分别的驰豫率R2。计算药物注射后2h时R2的相对增加比率(RSI(Relative Signal Intensity)％＝R22h/R20h)，结果见表2。
表2胎盘特异性递送功能评价结果
| 组别 | 胎盘RSI(信号相对倍数) | 胚胎RSI(信号相对倍数) | 肝脏RSI(信号相对倍数) |
| 生理盐水正常组 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 实施例1 | 24.73 | 1.23 | 2.58 |
| 实施例2 | 23.38 | 2.50 | 1.58 |
| 实施例3 | 21.30 | 1.10 | 2.32 |
| 实施例4 | 25.77 | 1.78 | 2.94 |
| 对比例1 | 10.60 | 16.14 | 4.02 |
| 对比例2 | 5.55 | 10.75 | 5.66 |
| 对比例3 | 2.71 | 2.91 | 5.68 |
| 对比例4 | 2.48 | 2.37 | 7.32 |
| 对比例5 | 10.38 | 1.79 | 12.19 |
| 对比例6 | 7.10 | 1.76 | 18.48 |
由上述结果可知，对比例1中未链接胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体，多肽--PEG修饰的脂质双分子层在胎盘中崩解后，内容的药物无法锚定于Treg细胞和Th17细胞获得胎盘滞留，大量漏过胎盘屏障，检测到胎盘RSI较低；药物在胚胎聚集，导致胚胎RSI较高；药物无法锚定于Treg细胞和Th17细胞获得胎盘滞留，也导致部分药物脱离胎盘，全身分布，导致肝脏RSI较高。
对比例2不含有多肽-PEG修饰的脂质双分子膜做外壳，无法实现针对胎盘微环境的靶向释放；另外，CD3抗体靶向包括Treg细胞和Th17细胞在内的体内其他多种细胞膜表达CD3的细胞，胎盘靶向性不强；所以，检测到胎盘RSI较低，肝脏RSI较低；没有脂质膜的药物粒径较小，进入胎盘者，以较大比例通过胎盘屏障，检测到胚胎RSI较高。
对比例3和4不含CD3抗体，进入胎盘的药物无法靶向锚定于Treg细胞和Th17细胞，无法获得胎盘滞留，大量漏过胎盘屏障，检测到胎盘RSI较低；药物在胚胎聚集，导致胚胎RSI较高。同时，对比例3的脂质双分子膜外壳没有酶敏感多肽修饰，在胎盘的分布降低，也导致胎盘RSI较低，肝脏的RSI较高。对比例4没有脂质双分子膜外壳，相比对比例3，胎盘的RSI更低，肝脏的RSI更高。
对比例5的粒径过大，导致其体内循环分布效果极差，药物主要被肝脏的网状内皮系统大量吞噬，导致肝脏的RSI明显较高，胎盘RSI明显较低；但是其大粒径阻滞其漏过母胎屏障，所以胚胎RSI较低。对比例6的粒径远大于对比例5，循环更差，所以其肝脏RSI高于对比例5；其粒径更大，更不容易漏过母胎屏障，所以胎盘RSI低于对比例5。
实施例1-4中采用酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，以胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体修饰的药物载体作为内核，合成双层结构的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，粒径范围为80-205nm。其100nm左右的粒径，和外层的负电脂质双分子膜，便于避免被网状内皮系统大量吞噬，实现体内循环时间延长，实现体内的有效循环。其底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜外壳在体内其他组织器官的循环中稳定，到达特异性高表达MMP的胎盘微环境中，随着多肽的降解而崩解，实现在胎盘组织中药物特异性分布。药物外壳在胎盘微环境崩解后，显露含有CD3抗体片段的药物内核。CD3抗体片段在胎盘中可以锚定于细胞膜特异性高表达CD3的Treg细胞和Th17细胞，促进药物被Treg细胞和Th17细胞特异性内吞后，进行Treg细胞和Th17细胞功能调控，并减少在胎盘其他细胞中的分布，减少对胎盘功能的影响。CD3抗体使胎盘中的药物锚定于Treg细胞和Th17细胞，也有效减少了药物漏过母胎屏障，减少了药物到达胚胎。
2.建立复发性流产动物模型评价治疗效果
于D3、D6、D9、D12、D15注射药物(治疗剂量0.31mg/Kg铁当量药物，或等体积的生理盐水)，并于D17进行胚胎丢失率检测：
开腹观察小鼠子宫，判断胚胎存活和胎盘丢失情况。胚胎体积明显缩小至平均体积的50％以下，或胎儿胎盘单位有明显出血或坏死即判断为胚胎丢失。进而计算胚胎丢失率(embryo loss rate,ELR)＝丢失胚胎数/(丢失胚胎数+存活胚胎数)×100％。
表3复发性流产动物模型评价治疗效果
由上述结果可知，对比例1中未链接胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体，多肽-PEG修饰的脂质双分子层崩解后，内容的药物无法锚定于Treg细胞和Th17细胞获得胎盘滞留，大量漏过胎盘屏障，检测到治疗效果较差，丢失胚胎数较高，胚胎丢失率较高，存活胚胎数较低，预计产仔数较低；同时，药物在胚胎聚集，导致胚胎毒性，也导致存活胚胎数较低，预计产仔数较低。
对比例2不含有多肽-PEG修饰的脂质双分子膜做外壳，针对胎盘微环境的靶向释放无法实现；CD3抗体靶向包括Treg细胞和Th17细胞在内的体内表达CD3细胞，胎盘选择靶向性不强，检测到治疗效果较差，丢失胚胎数较高，胚胎丢失率较高，存活胚胎数较低，预计产仔数较低。同时，没有脂质膜的药物粒径较小，进入胎盘者，以较大比例通过胎盘屏障，也导致存活胚胎数较低，预计产仔数较低。
对比例3和4不含CD3抗体，进入胎盘的药物无法靶向锚定于Treg细胞和Th17细胞，无法获得胎盘滞留，导致大量漏过胎盘屏障，检测到治疗效果较差，丢失胚胎数较高，胚胎丢失率较高，存活胚胎数较低，预计产仔数较低。同时，对比例3的脂质双分子膜外壳没有酶敏感多肽修饰，在胎盘的分布降低，检测到治疗效果较差，丢失胚胎数较高，胚胎丢失率较高，存活胚胎数较低，预计产仔数较低。对比例4没有脂质双分子膜外壳，相比对比例3，治疗效果更差。
对比例5和6的粒径过大，导致其体内循环分布效果极差，药物主要被肝脏的网状内皮系统大量吞噬，导致胎盘药物分布不足，治疗效果较差，丢失胚胎数较高，胚胎丢失率较高，存活胚胎数较低，预计产仔数较低。对比例6的粒径远大于对比例5，循环分布更差，所以其治疗效果相比对比例5更差。
实施例1-4中采用酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，以胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体修饰的药物载体作为内核，合成双层结构的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，粒径范围为80-205nm。其100nm左右的粒径，和外层的负电脂质双分子膜，便于避免被网状内皮系统大量吞噬，实现体内循环时间延长，实现体内的有效循环。其底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜外壳在体内其他组织器官的循环中稳定，到达特异性高表达MMP的胎盘微环境中，随着多肽的降解而崩解，实现在胎盘组织中药物特异性分布。药物外壳在胎盘微环境崩解后，显露含有CD3抗体片段的药物内核。CD3抗体片段在胎盘中可以锚定于细胞膜特异性高表达CD3的Treg细胞和Th17细胞，促进药物被Treg细胞和Th17细胞特异性内吞后，实现Treg细胞和Th17细胞比例和免疫功能调控，并可减少在胎盘其他细胞中的分布，减少对胎盘其他细胞功能的影响。通过有效的选择性Treg细胞和Th17细胞比例和免疫功能调控，实现了较好的治疗效果。CD3抗体使胎盘中的药物锚定于Treg细胞和Th17细胞，也有效减少了药物漏过母胎屏障，减少了药物到达胚胎，对胎仔的毒性较小。
3.药物用于动物模型的毒性评价
正常对照组小鼠注射药物后72小时，尾静脉取血，检测肝功能指标谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)和肾功能指标血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，sCr)。检测仪器为日立7600型全自动生化分析仪，检测结果见表4。
表4毒性评价结果
由上述结果可知，本发明制备得到的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，未见对母体和胎儿发生明显的毒副作用。
Claims (9)
1.一种调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其特征在于，包括：
以在接触胎盘组织间液高表达的酶的作用下靶向崩解的酶底物多肽-PEG修饰的脂质双分子膜作为外壳，以胎盘Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达的标志物抗体修饰的药物载体作为内核，所述药物载体中负载超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物、治疗基因或其组合；
所述胎盘组织间液高表达的酶为基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、溶菌酶、激肽酶、组胺酶或催产素酶中的一种或几种；所述药物载体为聚乙二醇修饰的聚阳离子载体与疏水性可降解聚酯形成的共聚物；所述胎盘Treg细胞和Th17细胞表面特异性高表达的标志物抗体为CD3抗体的Fab段。
2.根据权利要求1所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其特征在于，所述胎盘组织间液高表达的酶为基质金属蛋白酶2。
3.根据权利要求1所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其特征在于，所述共聚物为聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯PEG-PEI-PCL、聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚乳酸PEG-PEI-PLA或聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚乳酸-羟基乙酸PEG-PEI-PLGA中的一种或几种，优选聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚己内酯PEG-PEI-PCL。
4.根据权利要求1所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其特征在于，所述调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的平均粒径为80nm-300nm，优选为100nm-205nm。
5.根据权利要求1所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物，其特征在于，所述小分子药物为Hydrocortisone hemisuccinate；所述治疗基因为抑制RORγt基因表达的siRNA。
6.权利要求1-5任一项所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子、调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能的小分子药物和/或基因负载到共聚物，得到复合纳米粒子；
S2、将胎盘Treg细胞和Th17细胞表面标志物抗体链接到复合纳米粒子，得到抗体复合纳米粒子；
S3、将胎盘及其组织微环境高表达的酶的底物多肽链接PEG，得到多肽-PEG；
S4、将多肽-PEG和脂质体混合形成多肽-PEG修饰的脂质双分子膜；
S5、将多肽-PEG修饰的脂质双分子膜与抗体复合纳米粒子组装成调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物。
7.权利要求6所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，共聚物和超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子的质量比为5-15:1。
8.权利要求1-5任一项所述的调控病灶微环境Treg/Th17细胞比例的纳米免疫调控药物在制备调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能失调疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调控胎盘Treg细胞和Th17细胞功能失调疾病为复发性流产。
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| CN115068503A (zh) * | 2021-03-16 | 2022-09-20 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒及其制备与应用 |
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| CN109568268A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 胎盘靶向递送系统及其制备方法和应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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