CN115068503A - 具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，纳米颗粒核；外膜，其包裹所述纳米颗粒核；所述外膜来源于CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的细胞膜，和所述外膜的膜蛋白与Treg细胞上的膜蛋白定位一致。

Description

具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其由细胞膜包裹，以能够用于激活免疫或治疗用途。

背景技术

慢性牙周炎是一种全球流行的疾病，可能导致牙齿脱落并导致全身性并发症，并伴有许多严重的健康问题。在慢性牙周炎的过程中，共生的口腔微生物群失调是牙周炎的始动因素，而宿主的过度激活的免疫反应则导致了慢性炎症和牙周组织连带破坏。慢性牙周炎的常规非手术治疗方法主要是去除微生物群及牙菌斑以及抗生素的辅助使用。然而，目前这些方法对于牙周微环境中失调的免疫反应和已经存在的慢性炎症的缓解作用非常有限。因此，通过控制过度的免疫活化来解决炎症并减缓牙周炎进展的方法是非常具有前景的，但是目前研究少有报道。

牙周膜中免疫稳态的维持依赖于相互制约且精确调节的免疫反应，其中调节性T(Treg)细胞(一种主要的免疫抑制性T细胞亚群)的用于对于保证适当程度的免疫炎症反应同时保证组织破坏最小化是必不可少的。人体免疫系统的免疫稳态的维持依赖于免疫激活反应和免疫抑制反应的相互协调，调节性T细胞(Treg细胞)则作为一种主要免疫抑制T细胞细胞亚型对免疫激活反应进行拮抗。目前已有大量研究表明Treg细胞的比例在慢性牙周炎患者的病灶中显著上调。Treg细胞的免疫抑制特性主要是通过分泌调节细胞因子以及依靠细胞膜表面的免疫抑制性配体蛋白与靶细胞的直接相互作用来发挥的。已经进行了一些尝试来增加牙周损伤中Treg细胞的数量和功能，一种负载有 CCL22的微粒将Tregs招募到牙周炎病灶中并显著减少了鼠和犬牙周炎模型中的炎症细胞浸润以及牙槽骨吸收。然而，基于纳米颗粒的免疫抑制纳米制剂虽然能够一定程度上改善其副作用，但由于药物半衰期短，通常仍需要频繁和长期的给药仍不足以绕过药物治疗的固有缺点。

近年来，基于细胞的Treg治疗已经引起了人们的广泛关注，其用于治疗自身免疫性疾病(如I型糖尿病)和同种异体免疫排斥相关的疾病(如移植物抗宿主病(GvHD))。然而，Treg活细胞的过继转移治疗策略虽然已进入临床研究，但是仍然面临Treg细胞中Foxp3转录因子表达的不稳定性而导致的表型不稳定的问题，这有可能会使免疫抑制性Treg表型转变为促炎的T细胞，因此反而加剧疾病。对于牙周炎等炎性疾病，采用基于药物来诱导Treg在局部趋化或增殖的方法也可能面临以下问题：趋化剂的使用可能会同时募集促炎激活的T淋巴细胞到病灶，此外，在复杂的微环境下，富含促炎细胞因子的情况下，募集的Treg细胞可能会失去免疫抑制表型。因此，申请人描述开发了人工纳米级Treg细胞，该纳米细胞通过其表面的膜蛋白来发挥多种免疫调节功能，从而解决局部牙周炎症和组织损伤。

发明内容

本发明了涉及了Treg细胞膜包裹的纳米颗粒，模仿Treg细胞介导的内源性免疫调节。

本发明一方面涉及具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，纳米颗粒核；外膜，其包裹所述纳米颗粒核；所述外膜来源于CD4⁺CD25⁺Foxp3 ⁺的Treg细胞的细胞膜，和所述外膜的膜蛋白与Treg细胞上的膜蛋白定位一致。

具体地，所述纳米颗粒核包括具有生物相容性的或合成的材料，其选自聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸以及聚谷氨酸；优选的，所述纳米颗粒核包括聚 (乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。

具体地，所述仿生纳米颗粒的水合直径较纳米颗粒核增大，而表面电位较纳米颗粒核减小并与所述Treg细胞膜衍生的囊泡相似。

具体地，所述仿生纳米颗粒由纳米颗粒核和外膜反复挤出得到；所述外膜和纳米颗粒核的比例为1:1。

具体地，所述仿生纳米颗粒至少包括Treg细胞膜的特征性膜蛋白 CTLA-4、LAG-3、CD39、CD73和CD27；优选地，所述仿生纳米颗粒能够结合巨噬细胞、DC和T细胞，从而抑制巨噬细胞分化，抑制DC细胞成熟和 T细胞的增殖和活化。

所述仿生纳米颗粒通过与破骨细胞上的共刺激分子CD80/86发生的配体- 受体相互作用，以抑制TRAP⁺破骨细胞的生成。

所述仿生纳米颗粒能够通过与膜共刺激分子相互作用抑制DC细胞成熟和免疫刺激功能。

所述仿生纳米颗粒能够干扰CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子的产生；优选地，所述仿生纳米颗粒抑制Ki67⁺、TNF-α⁺、IFN-γ⁺T细胞。所述仿生纳米粒子抑制CD4⁺TNF-α⁺T细胞、CD4⁺IFN-γ⁺T细胞、分泌型CD4⁺IL-17a⁺细胞以及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的生成。

本发明另一方面涉及一种多重免疫调节的方法，其包括施用上述的仿生纳米颗粒；优选地是用于牙周微环境的免疫调节，以减轻炎症或牙周组织损伤。

本方还涉及一种药物组合物，其用于治疗牙周炎及炎症引起的牙周组织损伤，其包括上述的仿生纳米颗粒，和/或药学上可接受的载体和/或赋形剂。

附图说明

图1是本发明设计的TNPs的制备和特征。图1a为人造纳米颗粒Treg细胞的示意图，其设计用于抑制牙龈中的过度免疫反应以改善牙周炎并减轻慢性牙周炎中牙槽骨的吸收；图1b为NP和用乙酸铀酰染色的TNP的代表性TEM图像，比例尺：200nm。图1c和1d为通过DLS测量的TNPs的水合尺寸(c)和ζ电势(d)的结果。图1e为通过蛋白质印迹测定法检测的Treg裂解物、Treg膜囊泡和TNP的特征性膜蛋白标志物的表达。图1f为用PE标记的抗小鼠CTLA-4抗体染色的Treg细胞和TNPs的荧光强度。数据表示为平均值±s.d。统计学意义通过两尾t检验进行分析。NS：无显著性。

图2是TNP抑制巨噬细胞向破骨细胞分化的作用；图2a为与TNP或NP 孵育后，细胞的典型共聚焦图像。蓝色，绿色和红色分别代表细胞核，细胞膜和纳米颗粒。比例尺：10μm。图2b为通过流式细胞仪分析定量分析与巨噬细胞结合的纳米颗粒(n＝3，未配对的两尾t检验)。图2c为用TNP或NP 处理的巨噬细胞的代表性的TRAP染色图像，比例尺：200μm。图2d为与 TNP或NP孵育后，TRAP阳性多核破骨细胞的定量分析(n＝4，采用Tukey 测试的单向方差分析)。图2e，f为通过流式细胞术分析与纳米颗粒和巨噬细胞在不存在(e)或存在CD80/86阻断抗体(f)的情况下共孵育24小时后孵育后巨噬细胞的凋亡率(n＝4，单向ANOVA Tukey测试)。图2g为与TNPs 或NPs孵育3天的巨噬-破骨细胞中IDO和β-Actin蛋白表达的代表性蛋白质印迹图像。图2h-j，通过qPCR分析(n＝4，单向ANOVA和Tukey测试)，经TNP或NP处理3天的巨噬-破骨细胞中IDO(h)，NFATc-1(i)和RANKL (j)的相对mRNA表达水平。所有数据均表示为平均值±s.d。**p<0.01， ***p<0.001。NS：无显著性。

图3为TNP抑制DC的成熟。图3a为与TNP或NP在4℃温育1小时后， DC的代表性TEM图像。橙色箭头指示DC周围的纳米颗粒。比例尺：500nm。图3b为TNP或NP与DC结合的流式细胞仪分析(n＝3，未配对的双尾t检验)。图3c为与TNP或NP孵育48小时后，DC上的CD70，CD80和CD86 的流式细胞分析结果。图3d为共聚焦成像在4℃共孵育1小时后，DC和TNP 上CD80和CD86的免疫荧光(上图)。黄色表示TNP(红色)与CD80或CD86 (均为绿色)共定位。框内区域的放大图(底部图)中用白色虚线圆圈标记了细胞内部的典型共定位斑块。比例尺：5μm。图3e-g，用TNP或NP培养后，DC上的CD70(e)，CD80(f)和CD86(g)的MFI定量(n＝3，采用 Tukey测试的单向方差分析)。所有数据均表示为平均值±s.d。*p<0.05，** p<0.01。NS：无显著性。

图4为TNP抑制T细胞的增殖和活化。图4a与TNP或NP孵育的CD3⁺ T细胞的典型共聚焦图像。蓝色，绿色和红色代表细胞核，FITC偶联的抗CD3 抗体和纳米颗粒；比例尺：2μm。图4b为在4℃共孵育1小时后，与TNP 或NP结合的T细胞的代表性流式细胞分析图。图4-e为在存在CD3，CD28 和IL-2的情况下与TNP或NP孵育96小时后，通过流式细胞术分析确定CD4 ⁺Ki67⁺(c)，CD4⁺TNF-α⁺(d)和CD4⁺IFN-γ⁺T(e)细胞的比例。图4f-h，在CD3，CD28和IL-2的诱导下用TNP或NP培养96小时后，通过流式细胞仪分析评估CD8⁺Ki67⁺(f)，CD8⁺TNF-α⁺(g)和CD8⁺IFN-γ⁺(h)T 细胞在总CD8⁺T细胞中所占的百分比。所有数据均表示为平均值±s.d。使用单向方差分析和Tukey检验评估显着性。*p<0.05，**p<0.01。NS：无显著性。

图5为在晚期牙周炎的小鼠模型中，TNP减轻牙龈的炎症反应并减少牙槽骨吸收。图5a为对由上颌第一磨牙颈部的结扎30天来诱导晚期牙周炎的小鼠模型及TNP治疗的实验设计，给予PBS的小鼠用作对照。图5b-5e为，通过流式细胞术分析TNPs处理15天的小鼠牙龈的CD4⁺T细胞中CD4⁺TNF- α⁺(b)，CD4⁺IFN-γ⁺(c)，CD4⁺IL-17a⁺(d)和CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺(e) T细胞的百分比；图5f为在TNP处理16天后从小鼠收获的上颌磨牙区域的代表性3D micro-CT图像(从颊侧)；比例尺：1毫米。上方的红色虚线和下方的红色虚线分别表示CEJ和ABC。图5g为用TNP处理的小鼠的组织切片的代表性TRAP染色图像。比例尺：10μm。图5h为TNP处理后，来自结扎牙周围的上颌骨的组织切片的典型H&E染色图像。比例尺：10μm；G，B 和T分别指牙龈、牙槽骨和牙齿。图5i为来自小鼠结扎区域周围组织的代表性TNF-α免疫组织化学染色切片；比例尺：5μm。图5j为由M1和M2确定的平均ABC-CEJ距离。图5k为上述组织切片中TRAP阳性细胞的数目。图 5l为组织切片中TNF-α阳性细胞的定量分析。误差棒代表±s.d。(n＝6)。使用单向方差分析和Tukey检验评估显着性。*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001，****p<0.001。NS：无显著性。

图6为TNP可减轻早期牙周炎小鼠模型的牙周免疫反应和牙槽骨吸收。图6a为通过在上颌第一磨牙颈部结扎10天以诱导早期牙周炎的小鼠模型及TNP治疗的实验设计。图6b-6e，为通过流式细胞术检测的处理15天后的小鼠牙龈的总CD4⁺T细胞的CD4⁺IL-17a⁺(b)，CD4⁺TNF-α⁺(c)，CD4⁺IFN- γ⁺(d)和CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺(e)T细胞的百分数比。图6f为小鼠上颌磨牙区域的代表性H&E染色切片。比例尺：10μm。G，B和T分别指牙龈，牙槽骨和牙齿。图6g为治疗后小鼠从CEJ到ABC的距离，在M1和M2的6 个点测量。图6h和6i为定量分析相应组织切片中的TRAP(h)和TNF-α(i) 阳性细胞。误差棒代表±s.d.(n＝6)。使用单向方差分析和Tukey检验评估显着性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.001。

图7为在比格犬牙周炎模型中TNP改善炎症的并减缓牙槽骨吸收的作用。图7a为在牙颈部结扎8周来诱导比格犬慢性牙周炎的以及用TNP和牙周刮治及牙周袋冲洗的治疗方案，用PBS处理的比格犬用作对照。图7b-7e为在分别在第0周和第4周对不同治疗条件下犬的磨牙或前磨牙部位的临床牙周探诊参数的分析，包括PI(b)，mSBI(c)，PPD(d)和CAL(e)(每颗12颗牙齿、Kruskal-Wallis检验和带Tukey检验的单向方差分析)。图7f为分别在第0周和第4周对不同组的牙齿进行X先拍摄。上面的红色线段和下面的虚线分别标记CEJ和ABC水平。图7g为治疗4周后牙齿的的颊侧和舌侧的典型3D micro-CT图像。比例尺：3毫米。上方和下方的红色虚线分别表示CEJ 和ABC水平。图7h为经过不同处理后，犬结扎区域周围组织的H&E染色的代表性切片。比例尺：250μm。所有数据绘制为平均值±标准差。*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.001。NS：无显著性义。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明的技术方案、发明构思，而非对本发明所做的限制性说明。另外需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。其它未明确示出或未明确说明的部分均应理解为现有技术常规手段或方案，其结合本发明示出的技术特征可以实现本发明的技术效果。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施例中的具体的附加技术特征可以相互组合或替换。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

本发明使用了纳米颗粒，其包括纳米颗粒核和外膜；外膜包裹纳米颗粒核。

纳米颗粒核，其具有内核支撑外表面，包括具有生物相容性的或合成的，或者由生物相容性材料或合成材料制成，例如选自聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸以及聚谷氨酸；本发明的具体实施例中，纳米颗粒核包括聚(乳酸-乙醇酸) 共聚物(PLGA)。

外膜，包裹纳米颗粒核，其表面具有功能性分子，例如受体、配体等。所述外膜可以为天然膜或合成膜(具有生物相容性)，例如天然存在细胞膜等，来自癌细胞、血细胞(红细胞、白细胞等)、免疫细胞(例如巨噬细胞、DC 细胞、T细胞、B细胞等)或其他细胞(上皮细胞、内皮细胞等)。本发明的具体实施方案中，外膜为来自于调节性T细胞(Treg)的细胞膜，具体为成熟的调节性T细胞,表面CD4,CD25和Foxp3阳性(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)。

本发明所使用的细胞膜，可以通过本文描述和本领域中已知的方法获得，例如本申请的实施例中采用低渗裂解缓冲液。本发明涉及的纳米颗粒，通过本文描述和本领域已知的方法获得，例如通过连续挤出的方式，即通过挤出机通过聚碳酸酯膜连续挤出。

本发明的具体实施方案中，申请人提取调节性T细胞(Treg)的细胞膜，并将其包裹纳米颗粒核；本实施方案形成的仿生纳米颗粒的水合直径较(原) 纳米颗粒核增大，例如增大约17nm等，同时表面电位(负电位)较纳米颗粒核减小并且其电位与Treg细胞膜衍生的囊泡相似，即说明此仿生纳米颗粒具有较完整的Treg细胞膜，并且保留Treg细胞膜的部分功能的可能。在后续的验证实验中，仿生纳米颗粒包括Treg细胞膜的特征性膜蛋白，例如CD4、CD25、Foxp3、CTLA-4、LAG-3、CD39、CD73和CD27；同时地，所形成的仿生纳米颗粒具有调节性T细胞的部分功能，主要是免疫调控功能，例如影响巨噬细胞分化、抑制DC细胞成熟和T细胞增殖和活化等。相应地的实验说明，仿生纳米颗粒可以结合破骨细胞的CD80/86以影响巨噬细胞的分化，仿生纳米可以结合DC细胞(细胞接触依赖性)以抑制DC细胞成熟；同理地，仿生纳米颗粒也能够结合T细胞的配体或受体抑制T细胞的成熟，具体为Ki67 ⁺、TNF-α⁺、IFN-γ⁺T细胞。

TNP具有活细胞表面固有功能蛋白，对靶细胞起多方面的抑制作用，以抑制过度活跃的免疫反应(图1a)。首先，TNP通过直接接触巨噬细胞并激活下游通路来有效促进破骨细胞凋亡从而抑制巨噬细胞的破骨分化。此外，TNP 用于与树突状细胞(DC)表面上的共刺激信号相互作用，以抑制DC的成熟。此外，TNP对T细胞的增殖和细胞因子分泌具有调节作用。在牙周炎的早期和晚期小鼠模型中均施用TNP可以始终证实TNP在缓解免疫炎症反应和减少牙槽骨吸收方面的有益作用。值得注意的是，TNP在牙周炎的临床前犬模型中进一步显示出抗炎和组织保护作用。当前的研究突出了基于纳米颗粒的仿生调节对牙周免疫调节的影响，并证明了在慢性牙周炎中的潜在治疗价值。

本发明进一步提供了本发明的方法用于多重免疫调节，以改善免疫性疾病、或涉及免疫机制的病症等。在某些实施方案中，本发明的方法用于治疗或改善牙周炎；具体实施例中，利用牙周炎鼠类牙周炎模型和犬类牙周炎模型炎症TNP具有免疫调节功能，以得到治疗作用。

实施例中采用的实验方法为生物化学、分子生物学或医学检测等技术领域常规的技术方案，例如本申请中需要采用的流式细胞仪技术、qPCR分析、透射电镜、Micro-CT分析、组织学分析。

Treg细胞的分离和扩增

通过MACS系统(Miltenyi Biotec)从雌性C57BL/6小鼠的脾细胞中纯化出小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞。简而言之，首先对小鼠脾细胞进行生物素抗体混合物和抗生物素微珠间接标记非CD4⁺T细胞，然后用CD25-PE标记 CD25⁺细胞，然后进行磁分离。然后，在用抗PE微珠标记CD25⁺细胞后，通过正磁选择富集CD4⁺CD25⁺细胞。通过流式细胞术分析，富集的Treg细胞显示出至少92％的纯度。然后，将2.5×10⁵纯化的Treg细胞接种到每孔24 孔板中(Costar)，并用抗CD3/抗CD28包被的微珠(Miltenyi Biotec)以1： 3的细胞对珠刺激在Dulbecco改良的Eagle培养基(Hyclone)中补充10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)，1％青霉素/链霉素(Invitrogen)，50μMβ-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，IL-2(200U/ml，R&D Systems)培养9天，每两天更换一次培养基。然后用新小珠以1：1的比例对细胞进行再刺激。在第14天，使用MACSiMAG Separator(Miltenyi Biotec)从细胞中除去珠子，并通过流式细胞术分析获得的细胞的表型，并使用CD4-FITC(Biolegend)， CD25-PE(Biolegend)和细胞内染色进行细胞表面染色使用Foxp3-APC (Biolegend)和Foxp3染色缓冲液组(eBioscience)。关于犬Treg细胞的收集，首先通过Ficoll/Paque(GE Healthcare)的密度梯度离心从比格犬的新鲜外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。所得的PBMC用FITC偶联的抗CD4(eBioscience)和APC标记的抗CD25抗体(eBioscience)染色，并通过BD FACSAria III细胞分选仪(BD Biosciences)通过流式细胞仪分选，纯度至少为98％。使用CD4-FITC(eBioscience)，CD25-APC(eBioscience)和Foxp3-PE (eBioscience)的流式细胞术分析类似地进行分选细胞的表型测定。

细胞膜收集

Treg细胞的细胞膜被收集，如前所述。简而言之，将获得的Treg细胞悬浮在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific)，30mM Tris/HCl，75mM蔗糖，0.2mM EDTA(上述来自Sigma Aldrich的成分)的低渗裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。然后将细胞悬液仔细研磨，并用带有紧密配合的研棒的Dounce匀浆器匀浆(30遍)，然后在4℃下以800g 离心5分钟以弃去大碎片。随后将上清液在4℃下以3200g离心5分钟以收集上清液。同时，将获得的沉淀重悬于低渗裂解缓冲液中，并再次进行3 次匀浆和离心过程，直到通过光学显微镜观察确定细胞彻底裂解为止。最后，将合并的上清液在4℃下以21 000g离心35分钟。细胞膜富集成沉淀并用 PBS洗涤两次。使用BCA试剂盒(Beyotime)检测膜蛋白浓度。大约1.5亿个小鼠Treg细胞或1.1亿只犬Treg细胞能够产生1mg膜材料(蛋白质重量)。将鼠和犬的Treg细胞膜悬浮在蛋白质浓度为4mg/ml的含0.2mM EDTA的 PBS中，并保存在-80℃以便进一步使用。

纳米粒子的制备

PLGA纳米粒子是根据已知的方法合成的；简而言之，在搅拌下将1ml PLGA(50∶50)的丙酮(10mg/ml)溶液滴加到3ml水中。然后将溶液旋转蒸发直至丙酮完全蒸发。对于荧光成像分析，在PLGA纳米颗粒合成之前，将2μl DiD的乙醇溶液(1mg/ml，Thermo FisherScientific)添加到PLGA丙酮溶液中。至于制备TNP的细胞膜涂层，将收获的Treg细胞质膜与PLGA核以1：1的膜蛋白/PLGA纳米颗粒比例混合。使用微型挤出机(Avanti)通过聚碳酸酯膜(400nm和200nm)将混合物连续挤出11次。将合成后的纳米颗粒重悬于PBS中，以进行进一步的实验。

纳米颗粒的表征

将所得的TNP用乙酸铀酰(1wt％)染色，并用TEM(HT7700，HITACHI) 成像以观察纳米颗粒的形态。用DLS(Zetasizer，Malvern)评估TNP的流体动力学大小和表面Zeta电位，以进一步验证细胞膜在聚合物核上的成功包覆。为了确定TNP上是否存在特定的表面标记，用Western blot检测了Treg裂解液，Treg囊泡和TNP的样品。在对各种样品进行SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移的聚二氟乙烯(PVDF)膜与抗CTLA-4(Abcam)，LAG3(CST)，CD39 (CST)，CD73(CST)和CD27(Abcam)，然后与相应的二抗孵育。为了验证表面蛋白在TNP上的向外取向，将Treg细胞和具有相同膜蛋白的TNP 在4℃下用PE标记的CTLA-4抗体(Biolegend)染色30分钟，洗涤并通过流式细胞仪检测。

TNP的粘附测定

首先在室温(RT)下，用聚-L-赖氨酸(1mg/ml，Sigma-Aldrich)将室载玻片(ThermoFisher Scientific)包被15分钟，然后洗涤两次。然后将破骨细胞(每孔2×10⁶)和脾细胞(每孔4×10⁶)接种到培养皿上，并与0.2mg/ml DiD 标记的TNP和NP(通过荧光强度定量的TNP浓度相等)孵育。4℃下1小时。然后，用PBS清洗玻片3次，并在4℃下用4％多聚甲醛(PFA)固定20 分钟。PBS洗涤后，用于各种细胞培养的后续步骤如下：将破骨细胞共培养物用Hoechst 33342和Neuro-DiO染色，同时将脾细胞共培养物与3％BSA (Sigma-Aldrich)孵育30分钟以阻断非特异性结合然后用FITC标记的CD3 (Biolegend)和Hoechst 33342染色，然后用PBS洗涤并在共聚焦显微镜下观察(Leica TSC SP8)。为了进一步分析TNP对破骨细胞、DC细胞和T细胞的靶向粘附能力，将TNP和NP与这些细胞类似地在48孔板中于4℃孵育1 小时。然后将破骨细胞培养物用CD11b-FITC(Biolegend)染色，DC培养物用CD11c-FITC(Biolegend)染色，脾细胞培养物用CD3-FITC(Biolegend) 染色。随后通过流式细胞术分析这些细胞培养物的结合的TNP和NP的中等荧光强度。

体外破骨细胞生成

破骨细胞相关的分析，骨髓细胞，通过冲洗C57BL/6小鼠的胫骨的骨髓和股骨来分离，并用培养基(含有α-MEM 10％FBS和1％青霉素/链霉素)，培养并在板接种过夜，接着收集非贴壁骨髓单核细胞(BMM)。洗涤后，将 BMM在补充有30ng/ml MCSF(Reprotech)，用于巨噬细胞(preosteoclasts) 进一步的纯化和扩增培养。对于体外破骨细胞分化分析中，preosteoclasts在添加了M-CSF的培养基中平底96孔板(1×10⁴每孔)接种(30ng/ml，Peprotech 公司)和RANKL(50纳克/毫升，Peprotech公司)。这些细胞同时与TNP处理(0.2mg/ml)和NP，同时未处理组作为阳性对照。五天后，TRAP使用白细胞酸性磷酸酶试剂盒(Lianke Biotech公司)染色对上述样品进行评估破骨细胞分化，其中多核TRAP阳性(紫色)细胞被鉴定为破骨细胞和那些紫色染色的细胞与一个或两个细胞核被鉴定为巨噬细胞(preosteoclasts)。每孔 TRAP阳性破骨细胞的数量进一步量化。此外，巨噬细胞(preosteoclasts)在 24孔板(1×10⁶每孔)接种，并用TNP和NP在MCSF的存在下处理(30 纳克/毫升)和RANKL(50毫微克/毫升)3天以相对检测IDO的表达，并通过qPCR检测破骨细胞相关的基因。对于免疫印迹，以TNP和3天的NP处理类似的破骨细胞培养物裂解，收集蛋白质，随后通过SDS-PAGE电泳，PVDF 膜转印，温育与针对IDO单克隆抗体(CST)和相应的二次抗体。β肌动蛋白作为内部对照。蛋白条带通过在Odyssey红外成像系统(LI-COR)曝光检测。

巨噬细胞的凋亡测定

将巨噬细胞接种在24孔板中(每孔5×10⁵)，并在MCSF(30ng/ml)和 RANKL(50ng/ml)存在下用TNP和NP处理24小时。然后将收集的细胞用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)溶液(均购自BD Biosciences)在室温黑暗中染色15分钟，并立即通过流式细胞仪进行分析。定量膜联蛋白V阳性细胞的百分比以评估破骨细胞的凋亡率。此外，为了确定TNP对破骨细胞的抑制作用归因于CD80/86分子参与破骨细胞，将CD80和CD86的中和抗体 (10μg/ml，均来自R&D系统)加入到细胞培养中24小时以阻断CD80/ CD86，然后再用TNP处理24小时，并如上所述收集细胞进行凋亡分析。

在鼠和犬牙周炎模型中使用TNP进行治疗

所有动物程序均已获得上海交通大学医学院附属机构动物护理和使用委员会的批准。对于早期和晚期牙周炎的小鼠模型，将8-10周龄的雌性C57BL /6小鼠通过在牙颈部周围进行结扎来诱导牙周炎。简而言之，将丝线缝线 (8-0，Jinhuan)置入小鼠M1的龈下区域分别10天和30天，以诱导早期和晚期牙周炎。每周检查一次结扎，并在松动或移位的情况下更新结扎。根据上颌治疗侧的牙槽骨吸收水平确定两种牙周炎模型后，将结扎线去除，并采用小鼠研究TNP的有益作用。对于早期牙周炎，在第1、3、5、7、9、11、 13和15天，在M1的近端，M2的远端以及M1和M2之间向牙龈组织中注入20μl小鼠TNP(2mg/ml)。按照与阴性对照组相似的方案注射无菌PBS，并饲养幼稚小鼠作为健康对照组。对于晚期牙周炎，将20μl小鼠TNP(2mg /ml)类似地以相同的给药频率给予牙龈15天。PBS治疗组和幼稚组也分别用作阴性对照和健康对照。小鼠的牙周炎模型的建立和治疗过程均在双目放大镜下进行。对于牙周炎的犬模型，使用八只雄性比格犬(12-18个月)用于犬TNP的治疗实验。在比格犬中诱发了结扎性牙周炎，为了准备和维持牙周组织的健康状态，所有的狗都使用“Gracey”刮匙(Hu-friedy)进行了牙菌斑刮治术，并接受了两周的硬颗粒饮食。之后，通过在其中六只狗的左下颌第三前磨牙(PM3)，第四前磨牙(PM4)和M1以及左上颌PM2，PM3和 PM4的牙颈部周围放置2-0丝线缝线，诱发了牙周炎牙齿。为了稳定结扎，使用高速手机的小球钻在牙颈部的近端和远端创建了一个浅凹口，并在结扎周围添加了牙科复合树脂。在接下来的8周中提供软湿饮食，以增加菌斑的形成。每周检查一次结扎，脱落或松弛的结扎立即补上。在牙周炎诱导期后，将狗随机分为三组：TNP组(n＝2，12颗牙齿)向每颗牙齿的近端侧牙龈中注射50μl犬TNP(2mg/ml)，然后将它们注射入牙齿。远端对照组(n＝2， 12颗牙齿)以相似的方式接受无菌PBS处理，并作为阴性对照组。将De/ir 组(n＝2，12颗牙齿)接受常规的牙周炎临床治疗(牙菌斑清创和牙周袋中的洗必泰冲洗)作为阳性对照。为了进行疗效研究，在4周内每周两次给予上述治疗。在其他组的治疗实验之前，对另外两只没有诱导牙周炎的狗(n＝2， 12颗牙齿)再次进行牙菌斑刮治术，然后在治疗期间作为健康对照组(指定为naive组)。

临床牙周检查和影像学分析

去除结扎牙齿后(第0周，基线)，使用无菌牙周探针(Hu-Friedy)检查了包括PI，mSBI，PPD，CAL在内的临床牙周参数，以评估牙周炎和组织损伤。同时，还进行了标准的牙根尖X光片检查，以评估CEJ(作为牙齿上的参考界标)与边缘骨水平之间的距离所表示的牙槽骨水平变化。治疗四周后，对所有狗的临床牙周状况和影像学分析进行了重新评估。所有牙周参数测量均由同一位经验丰富的临床医生以盲法进行。

在鼠和犬模型中评估局部免疫炎症反应

对于小鼠部分的研究，治疗结束后将小鼠处死并小心地将M1和M2周围的牙龈组织与上颌骨分开，并切成1mm³的小块。通过胶原酶IV、分散酶II、 DNA酶I在37℃下3小时的酶解过程获得单细胞悬液，然后过滤70μm以收集悬液。还收获颈部引流淋巴结(CLN)，在缓冲液中匀浆并过滤以收集单细胞悬液。对于细胞内细胞因子分析，首先用白细胞激活混合物(BD Biosciences)刺激上述细胞5小时，然后进行FcγR阻断，活力染色和表面染色，以抗CD3-FITC、CD4-PerCP-Cy5.5、CD25-PE的抗体(全部来自 Biolegend)。然后将细胞固定，透化并用针对IL-17a-APC，TNF-α-PE，IFN- γ-PE-Cy7和Foxp3-APC的抗体染色，以进行流式细胞术分析。取材后，立即收集治疗过的牙齿周围的小鼠和犬的牙齿周围的牙龈组织，并将其储存在 -80℃下进行RNA提取，合成了该cDNA，并用于实时qPCR分析牙龈组织中的基因表达。

TNP的制备和表征

根据上述的内容，制备TNP，即从小鼠脾细胞中纯化(CD4⁺CD25⁺Foxp3 ⁺)Treg细胞，并在体外扩增，然后收集Treg细胞膜，并通过挤出法涂覆在聚乳酸-乙醇酸(PLGA)纳米颗粒核上。乙酸铀酰染色后透射电子显微镜(TEM) 对合成的TNP的观察表明，Treg膜完全包裹在PLGA核上，与裸露的核相比，呈现典型的核-壳形态，即PLGA纳米颗粒核(称为NP)的核心结构(图1b)。动态光散射(DLS)结果表明，与未涂覆的NP相比，TNP的水合直径增加了约17nm(图1c)。TNPs的表面zeta电位比NP核的负电位小，而与Treg膜衍生的囊泡相似(图1d)。此外，Western印迹结果也证实了Treg细胞膜衍生的特征性膜蛋白的存在，包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)，淋巴细胞激活基因3分子(LAG3)，CD39，CD73和CD27，进一步表明已成功将Treg膜包被到NPs(图1e)。此外，通过用等量的膜蛋白对TNPs和Treg 细胞上的CTLA-4进行免疫染色，证实了TNPs上表面蛋白的向外定向。流式细胞仪分析的定量中值荧光强度(MFI)结果显示，两组之间无显著差异(图 1f)，这表明TNP上的膜蛋白与Treg细胞上的膜蛋白定向或定位是一致的。在TNPs上正确定位定向将保证发挥膜蛋白配体的生物学功能。

TNPs抑制破骨细胞生成

为了验证TNP和破骨细胞之间的相互作用，将荧光标记的TNP和NP与破骨细胞一起进行共聚焦观察。如图2a所示，与NP相比，巨噬细胞膜上粘附的TNP更多。流式细胞仪分析进一步证实，用TNP处理的破骨细胞比NP 对应的MFI显着增加(图2b所示)。这些结果表明TNP具有与破骨细胞特异性结合的能力，这可能归因于TNP上CTLA-4蛋白与破骨细胞上共刺激分子 CD80/86之间的配体-受体相互作用。此外，在存在TNP或NP的情况下，诱导破骨细胞分化为破骨细胞。诱导5天后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 染色评估破骨细胞的形成。染色图像(图2c)和定量分析(图2d)均表明，与磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和NP组相比，TNPs明显减少了巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和核因子κ-配体受体激活剂(RANKL)诱导的TRAP⁺多核破骨细胞的数量。

接下来，申请人通过流式细胞术分析了TNP对破骨细胞凋亡的影响。 Annexin-V的染色强度显着增加以及定量结果(图2e)反映出，与NPs或PBS 处理相比，用TNPs处理的破骨细胞产生更高的凋亡率(p<0.001)。由于TNPs 从Treg细胞继承了膜蛋白CTLA-4，因此推测TNPs可以与巨噬细胞上的 CD80/86相互作用，从而抑制破骨细胞的生成。为了确定该假设，将破骨细胞用CD80和CD86的中和抗体预处理以进行结合位点阻断，然后与TNPs孵育24小时。流式细胞仪分析表明，CD80/86阻滞消除了TNP孵育导致破骨细胞的凋亡率明显增加(图2f)，这意味着TNPs特异性针对破骨细胞上的 CD80/86抑制破骨细胞生成。为了阐明下游分子机制，分别通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹研究了用TNP或NP处理的破骨细胞中的基因和蛋白质表达。吲哚胺2，3-二加氧酶(IDO)的蛋白质表达(图2g)和相对的mRNA表达水平(图2h)均被上调。这种促进的色氨酸分解代谢可能是由于破骨细胞上的CD80/86和TNPs上的CTLA-4的结合而引起的，从而导致破骨细胞凋亡以及破骨细胞分化受损。此外，在用TNP处理的破骨细胞中，破骨细胞相关基因的下调，包括活化T细胞1(NFATc-1)的核因子(图2i) 和RANKL(图2j)，进一步证实了TNP对破骨细胞分化的抑制作用。总体而言，这些结果表明，TNPs专门针对破骨细胞上的共刺激分子CD80/86，通过上调IDO的表达来有效地抑制破骨细胞生成，从而进一步诱导破骨细胞凋亡。

TNP抑制DC的成熟

Treg细胞通过细胞接触依赖性方式对抗原呈递细胞(APC)发挥抑制作用。因此，TNP也可能通过两侧细胞膜蛋白之间的相互作用影响APC，特别是DC细胞。为了观察TNP是否可以直接与DC结合，将被包被的纳米颗粒或裸NP孵育1小时的细胞通过TEM成像。如图所示，与DC结合的TNP比 NP多(图3a)。此外，将DC与荧光标记的纳米颗粒一起温育以通过流式细胞术定量结合。与NP相比，DC的较高的MFI(p＜0.01)表明TNP可以特异性地靶向DC的细胞膜(图3b)。为了确定紧密接触的效果，在与TNP或 NP孵育后检查DC膜上共刺激分子(包括CD70，CD80和CD86)的表达。流式细胞术直方图(图3c)和定量MFI分析(图3e-g)显示，与用NP和PBS 培养DC细胞相比，CD70(图3e)，CD80(图3f)和CD86(图3g)的表达始终下调。为了探索表面共刺激分子下调的机制，在4℃温育1小时后，对DC和TNP上的CD80和CD86进行了免疫荧光染色。如图3d所示，TNP(红色)与CD80或CD86(均为绿色)之间的紧密相互作用可以通过细胞表面荧光信号的共定位(黄色)以及DC内部的几个黄色共定位斑片来解释(如标有白色虚线圆圈)。细胞内部的斑块表明TNPs捕获了DC表面的CD80和CD86 配体，随后形成的复合物被内吞。此外，申请人通过qPCR检测了TNP处理 48小时后DC中这些共刺激分子的基因表达水平。显示的结果表明，与其他两组相比，仅CD80的mRNA水平表现出明显的增加，并且所有组中CD70 和CD86的转录水平的差异可忽略不计。总之，在Treg细胞膜赋予的表面蛋白的帮助下，TNP通过与其膜共刺激分子直接相互作用来抑制DC的成熟。申请人推测TNPs上的CTLA-4可以通过跨胞吞作用捕获DCs上的配体，例如CD80和CD86，而表面CD27可以另外诱导CD70内在化DCs，从而减少膜蛋白这些共刺激分子的水平进一步抑制DC的成熟。同时，TNPs上的LAG3 可以直接作用于主要的组织相容性复合物II类(MHC II)，它是触发抑制途径的配体，抑制DC的成熟和免疫刺激功能。

TNP抑制T细胞的增殖和活化

为了研究TNP是否可以直接在T细胞上起作用，将从幼稚小鼠中分离出的脾细胞与荧光标记的TNP或NP进行共聚焦成像。与NPs对CD3⁺T细胞的有限非特异性粘附不同，有大量TNP紧密结合在T细胞膜上(图4a)，表明存在特异性相互作用。还用标记的TNP或NP培养细胞，以量化纳米粒子与CD3⁺T细胞的结合。流式细胞仪分析证实，用TNPs处理的T细胞相对于NPs表现出更高的MFI(p<0.001)，进一步证实了它们的密切联系(图4b)。然后，申请人检测了TNP对CD3和CD28激活的T细胞的免疫抑制作用。对 CD3⁺CD4⁺细胞区室的分析显示，相比于总CD3⁺CD4⁺细胞，TNP显着限制了Ki67⁺，肿瘤坏死因子-α阳性(TNF-α⁺)和干扰素-γ阳性(IFN-γ⁺)细胞的比例NPs和PBS处理后的结果(图4c-e)表明TNPs干扰CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子的产生。对于CD3⁺CD8⁺区室的增殖和激活反应，观察到相似的结果(图4f-h)。值得注意的是，CD39和CD73是胞外核苷酸分解酶，通过顺序降解活化细胞泄漏的胞外三磷酸腺苷(ATP)赋予Treg细胞抑制功能。因此，据推测携带CD39和CD73的TNP趋于在T细胞上紧密聚集以水解释放至细胞周围位点的ATP，从而有效抑制T细胞的增殖和炎性细胞因子的分泌。

TNP介导的两种鼠类牙周炎模型中的免疫调节

首先在由结扎30天导致的晚期牙周炎的小鼠模型中评估了TNP减轻炎症和牙周组织损伤的功效。诱导后，在指定的时间点将TNP注射到发炎的牙周组织中(图5a)。用PBS处理的小鼠用作对照。为了验证TNP在牙周微环境中的免疫抑制功能，收集牙龈组织和宫颈淋巴结(CLN)并进行流式细胞仪测量。与PBS组相比，对牙龈细胞的分析表明，TNP显著地减弱了产生TNF- α的CD4⁺T细胞(图5b)，CD4⁺IFN-γ⁺T细胞(图5c)、白介素17a(IL-17a) 分泌型CD4⁺细胞以及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg群体的百分比(图5e)，尽管从TNP处理过的小鼠身上采集的牙龈相对于健康的幼稚小鼠而言显示出更高比例的这些CD4⁺亚群。对CLNs的分析表明，相对于PBS组，TNPs显著地降低了CD4⁺IFN-γ⁺和CD4⁺IL-17a⁺T细胞的比例，而CD4⁺TNF-α⁺和CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞在所有组中的差异很小。这些结果表明，TNP具有减轻小鼠牙龈和CLNs免疫反应的巨大潜力。为了评估TNPs改善骨骼吸收的功效，从小鼠中收获上颌骨的摩尔面积，并通过微型计算X射线断层扫描 (micro-CT)进行扫描。颊侧(图5f)和舌侧的三维CT代表图以及冠状二维视图表明，在牙周周围存在严重的牙槽骨丢失。PBS组的第一臼齿(M1)和第二臼齿(M2)，表明成功建立了高级牙周炎模型。与PBS处理的小鼠相比，用TNP治疗的小鼠的牙槽骨水平明显更高。牙槽骨顶与牙釉质交界处的距离 (ABC-CEJ)(牙槽骨吸收的指标)的测量结果始终证实，TNP基本上抑制了牙槽骨的丢失(图5j)。另外，将上颌骨切开用于组织学分析。考虑到破骨细胞的活性，代表性的TRAP染色图像(图5g)和TRAP阳性细胞的定量分析 (图5k)显示出类似的趋势，即TNP治疗导致牙周炎发展后TRAP⁺破骨细胞数量明显减少。这些结果证实了TNP在牙周炎中阻止破骨细胞活化和挽救骨质流失的显着优势。苏木精和曙红(H&E)染色后，PBS组的组织切片显示牙龈组织破坏，牙周组织纤维紊乱，附着力丧失以及明显的骨吸收(图5h)。这些与缓解的组织损伤，骨吸收减少和TNP组各部分的附着丧失形成鲜明对比。如图5i和1所示，TNP组在牙龈中呈现有限的TNF-α⁺细胞染色区域，而在从PBS组取样的牙龈组织切片中扩散地观察到大量细胞。牙龈组织的基因表达分析表明，炎症相关基因包括IL-1β，IL-6，TNF-α，IFN-γ和基质金属蛋白酶8(MMP-8)，以及与破骨细胞相关的基因如单核细胞在PBS处理的小鼠中，趋化蛋白1(MCP-1)和RANKL显着上调，而TNP的施用导致牙龈中这些基因的表达水平显着降低。

申请人通过结扎10天进一步评估了TNPs在早期牙周炎小鼠模型中的免疫调节能力和组织保护功效(图6a)。牙龈中CD4⁺T细胞亚群的流式细胞仪分析显示了相似的结果，即相对于PBS组，CD4⁺TNF-α⁺(图6b)，CD4⁺IFN- γ⁺(图6c)，CD4⁺IL-17a⁺(图6d)和CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺(图6e)始终呈现出TNP组的急剧下降。对CLN中CD4⁺T细胞反应的分析得出的结果与晚期牙周炎的结果相当。从图6f所示的H&E染色图像可以看出，在接受TNP 处理的小鼠中观察到减轻的软组织损伤和骨吸收减少。从micro-CT观察和定量骨吸收分析(图6g)，PBS处理的小鼠经历了中度牙槽骨丢失，表明早期牙周炎的发展。不出所料，TNP治疗有力地阻碍了骨吸收的进程。组织切片的 TRAP染色和定量分析(图6h)一致显示TNP抑制了骨吸收前沿部位附近 TRAP阳性的破骨细胞活性。此外，PBS组的小鼠表现出大量的TNF-α⁺细胞，但是TNP给药有效地减少了这些炎性细胞向牙周炎部位的浸润(图6i)。另外，从TNP组切下的牙龈组织中的炎症和破骨细胞相关基因的表达相对于 PBS组显着下调。

临床前犬牙周炎模型中TNP介导的免疫调节

为了研究TNP在牙周炎治疗中的潜力，建立了临床前的结扎诱导的牙周炎犬模型，以评估TNP在减轻牙周炎症和骨吸收方面的作用。通过在牙齿的子宫颈周围结扎8周，在比格犬的左下颌骨和上颌骨中诱发牙周炎。牙周炎发生后，分别用PBS，常规的牙周炎临床治疗(斑块清创和局部洗必泰冲洗，称为“De/ir”组)和TNP进行治疗(图7a)。为了确定牙周状态和炎症水平，在第0周(基线)和治疗后第4周时进行了一系列临床牙周检查，包括斑块指数(PI)，改良的沟出血指数(mSBI)，牙周袋深度(PPD)和临床附着丧失(CAL)。在用PBS，De/ir和TNPs治疗的狗中，这些牙周参数的基线值(第0周)没有显示出显着差异，但比健康的幼犬明显增加(图7b-e)。可以预期，De/ir组在第4周的PI评分比其他组低得多(图7b)，表明对牙齿上的牙菌斑定植具有良好的控制。在第4周，TNP和De/ir组的mSBI(图7c)， PPD(图7d)和CAL(图7e)得分明显低于PBS组。显然地，与De/ir处理相比，TNP能够减少了所有这些参数。临床检查表明，TNP和De/ir治疗均能有效缓解炎症和组织损伤的严重程度，但TNP治疗在恢复牙周健康方面表现出增强的性能。还通过根尖周X光片分别在第0周(基线)和第4周(图 7f)检测到牙槽骨水平的变化。诱导牙周炎后的狗在第0周显示相似的射线照相牙槽骨水平，这比健康组的牙槽骨水平明显低，表明牙周炎模型的确立。在第4周时，使用TNPs表现出与基线相当的骨水平，这与PBS和De/ir组的骨吸收进展形成鲜明对比。取材后，收集狗的上颌骨和下颌骨，并通过 micro-CT扫描。从颊侧和舌侧的代表性3D micro-CT视图表明，与用PBS和 De/ir治疗的狗相比，经TNP处理的牙槽骨吸收明显降低(图7g)。ABC-CEJ 距离的定量分析进一步证实，与PBS(p<0.001)和De/ir(p<0.01)处理相比，TNP对骨丢失具有抑制作用。值得注意的是，与PBS组相比，De/ir治疗未显示出控制骨吸收的明显优势。组织切片的TRAP染色进一步证实，使用 TNP可有效抑制结扎部位周围牙槽骨的破骨细胞活性。从H&E染色切片观察到这些组之间牙周组织学差异(图7h)。与正常犬的牙周相比，PBS组在牙周组织中表现出严重的附着丧失和溃疡性病变，包括牙龈组织丧失，牙龈组织纤维的不规则排列以及严重的和扩散的炎性细胞浸润。相反，治疗组出现的溃疡现象和附着力减少较少，其中TNP治疗的狗在限制炎症以及减轻牙龈损伤和附着力丧失方面明显优于De/ir组。牙龈组织中的基因表达评估显示，与炎症相关的基因(包括IL-1β，IL-6，IL-17a和破骨细胞相关的基因RANKL) 在PBS和De/ir组均明显上调，而经TNP处理的狗的这些基因的表达水平显着下降。综上所述，在牙周炎的临床前犬模型中，TNPs在减轻炎症反应和牙槽骨吸收方面具有令人满意的疗效，强调其作为治疗慢性牙周炎的替代方法及其进一步临床转化的潜力。

从牙周炎晚期和早期小鼠模型的体内结果来看，TNP明显抑制牙龈组织和cLNs中CD4⁺TNF-α⁺，CD4⁺IFN-γ⁺和CD4⁺IL-17a⁺亚群的比例，表明 TNPs能有效抑制T辅助1(Th)细胞和Th17细胞的浸润和分化。众所周知，慢性牙周炎患者的牙周病变中Th1和Th17细胞明显上调，因此TNP治疗显示出其调节临床相关免疫反应的潜力。此外，通过TNP给药，小鼠的牙龈组织炎症和牙槽骨吸收进一步受到破坏，这被认为是临床实践中发生和治疗结果的主要指标。

与牙周刮治和牙周袋冲洗(De/ir组)相比，TNP治疗在牙周炎的比格犬牙周炎模型中也显示出更加显著的治疗效果(De/ir组)。为了评估牙周炎症的严重程度，对犬采用了牙周探测的临床检查方法。结果表明，与未治疗组和De/ir组相比，TNP给药4周可显着减轻mSBI评分，PPD和CAL所指示的出血，牙龈炎症和附着组织丢失。除CAL指标外，牙槽骨吸收水平作为牙周炎发展和进展的另一个临床诊断标准，犬牙根尖周片和显微CT图像一致表明TNP治疗的免疫调节策略显著抑制了牙槽骨吸收水平的，这比De/ir组的抗微生物策略有效得多。因此，犬模型中理想的体内治疗潜能显示了TNP有望用于临床转化。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.具有多重免疫调控功能的仿生纳米颗粒，其包括，

纳米颗粒核；

外膜，其包裹所述纳米颗粒核；

所述外膜来源于CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的Treg细胞的细胞膜，和所述外膜的膜蛋白与天然Treg细胞的膜蛋白定位一致。

2.如权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核包括具有生物相容性的或合成的材料，其选自聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸以及聚谷氨酸；优选的，所述纳米颗粒核包括聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。

3.如权利要求1或2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒的水合直径较纳米颗粒核增大，和表面电位较纳米颗粒核减小并与所述Treg细胞膜衍生的囊泡相似。

4.如权利要求1-3任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒由纳米颗粒核和外膜反复挤出得到；优选地，所述外膜和纳米颗粒核的比例为1:1。

5.如权利要求1或2所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒至少包括Treg细胞膜的特征性膜蛋白CTLA-4、LAG-3、CD39、CD73和CD27；优选地，所述仿生纳米颗粒能够结合巨噬细胞、树突状细胞(DC)和T细胞，从而抑制巨噬细胞向破骨细胞的分化，抑制DC的成熟和T细胞的增殖和活化。

6.如权利要求1-5任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒通过与破骨细胞上的共刺激分子CD80/86发生配体-受体相互作用，以抑制TRAP⁺破骨细胞的分化。

7.如权利要求1-6任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒能够通过与膜共刺激分子相互作用抑制DC细胞成熟和免疫刺激功能。

8.如权利要求1-7任一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述仿生纳米颗粒能够干扰CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子的产生；优选地，所述仿生纳米颗粒抑制Ki67⁺、TNF-α⁺、IFN-γ⁺T细胞；优选地，所述仿生纳米粒子抑制CD4⁺TNF-α⁺T细胞、CD4⁺IFN-γ⁺T细胞、CD4⁺IL-17a⁺细胞以及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的生成。

9.一种多重免疫调节的方法，其包括施用权利要求1-8任一项所述的仿生纳米颗粒；

优选地是用于牙周微环境的免疫调节，以减轻炎症或牙周组织损伤。

10.一种药物组合物，其用于治疗牙周炎或炎症引起的牙周组织损伤，其包括权利要求1-8任一项所述的仿生纳米颗粒，和/或药学上可接受的载体和/或赋形剂。

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