CN114277067A - 一种利用韧皮纤维生产pha材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用韧皮纤维生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料的方法。对韧皮纤维进行粉碎、酶解和发酵，制备聚羟基脂肪酸酯产品。该方法降低成本，原料利用率高，产品质量优。

Description

一种利用韧皮纤维生产PHA材料的方法
技术领域
本发明属于生物材料及其制备领域，具体涉及一种利用韧皮纤维生产PHA材料的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类具有良好力学性能的生物聚合材料，完全由微生物发酵而产生，其可以在土壤、堆肥和海洋等各种环境中快速完全降解，是目前公认的替代塑料的最佳选择之一。然而，由于原料、成本等因素，PHA始终没有得到大规模的生产。
发明内容
本发明的目的是提供了一种利用韧皮纤维生产PHA材料的方法。
本发明的第一方面，提供了一种利用韧皮纤维生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料的方法，包括酶解步骤和发酵步骤，所述的酶解步骤包括步骤(a)-(a3)：
(a)提供含有韧皮纤维的酶解底物；
(a1)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用外切葡萄糖酶对所述的酶解底物进行酶解，得到第一酶解糖液；
(a2)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用内切葡萄糖酶对所述的第一酶解糖液进行酶解，得到第二酶解糖液；
(a3)在35-50℃下，调节体系pH为4.5-5.5，在高剪切均质搅拌条件下，用葡萄糖苷酶对所述的第二酶解糖液进行酶解，得到第三酶解糖液；
所述的发酵步骤包括步骤(b)-(c)：
(b)对所述的第三酶解糖液进行稀释，得到发酵底液；
(c)对所述的发酵底液进行发酵，得到含有PHA产品的发酵产物。
在另一优选例中，用清水对第三酶解糖液进行稀释。
在另一优选例中，所述的PHA材料的原料来自于韧皮纤维作物的韧皮部分。
在另一优选例中，所述的韧皮纤维作物为麻类。
在另一优选例中，所述的麻类选自下组：红麻、黄麻、苎麻，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(a3)中，所述的第三酶解糖液的糖度为18-22％。
在另一优选例中，在步骤(c)中，发酵过程采取流加补料，在24h内保持发酵液中总糖度不低于15％。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的发酵底液的糖度为15-20％。
在另一优选例中，在步骤(c)中，发酵温度为35-42℃。
在另一优选例中，在步骤(c)中，发酵的菌种为大肠杆菌工程菌。
在另一优选例中，所述的大肠杆菌工程菌产PHA。
在另一优选例中，在步骤(c)中，发酵时间为40-60h。
在另一优选例中，在酶解前，对韧皮纤维进行切碎处理和预浸处理，其中，所述的切碎包括如下步骤：
(Z1)将干燥的韧皮纤维切碎，然后过筛，得到碎韧皮纤维；
(Z2)分离所述的碎韧皮纤维，然后进行超细粉碎，得到超细韧皮纤维；
(Z3)对所述的超细韧皮纤维进行预浸处理，然后进行汽爆，得到待酶解的韧皮纤维物料。
在另一优选例中，在步骤(Z1)中，所述的干燥的韧皮纤维是指含水量为8-20％的韧皮纤维。
在另一优选例中，在步骤(Z1)中，过筛后，所述的碎韧皮纤维的尺寸为1-10cm，较佳为1.5-6cm。
在另一优选例中，在步骤(Z2)中，用旋风分离装置进行碎韧皮纤维分离。
在另一优选例中，在步骤(Z2)中，所述的超细韧皮纤维的尺寸为0.02-2mm，较佳为0.05-0.5mm。
在另一优选例中，在步骤(Z3)中，用蒸汽爆破装置进行汽爆。
在另一优选例中，汽爆温度为150-280℃，较佳为180-250℃。
在另一优选例中，汽爆时，若压力不足可通入压缩空气。
在另一优选例中，保压时间为2min-15min，较佳为3-10min。
在另一优选例中，在步骤(Z3)中，汽爆压力为1.2-2.5MPa，较佳为1.6-2.2MPa。
在另一优选例中，预浸液选自下组：pH为5.0-6.0的稀盐酸、pH为8.0-9.0的氢氧化钠溶液或清水。
在另一优选例中，预浸时间为2-12h。
在另一优选例中，预浸温度为40-85℃，较佳为60-75℃。
在另一优选例中，所述的高剪切均质搅拌的转速为8,000-20,000rpm。
在另一优选例中，酶解总时间为48-72h。
在另一优选例中，对所述的发酵产物离心脱水，然后用乙醇加压提取后进行干燥造粒，得到PHA产品。
在另一优选例中，常温下，所述的PHA产品呈粉末状或颗粒状固体。
在另一优选例中，所述的发酵产物中PHA干物质浓度为150-300g/L，其中发酵总固形产物中PHA含量不低于50％。
本发明的第二方面，提供了一种利用韧皮纤维生产的聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料，所述的聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料用本发明第一方面所述的方法制备。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选首次开发了一种新颖的利用韧皮纤维生产PHA材料的方法。本发明的制备流程简单，原料采用了高产量的麻类纤维，避免了使用玉米等淀粉作物为原料时与人争粮的窘境，并明显降低了成本，同时由于原料的优异组分，提高了最后产品的质量与总体生产效率。在此基础上，完成了本发明。
利用韧皮纤维生产PHA材料的方法
本发明还提供了一种利用韧皮纤维生产PHA材料的方法，所述的方法采用来自于麻类作物的韧皮纤维作为原料，避免了常规采用粮食作物制备的缺陷。且通过本发明的酶解方法可以获得具有较高糖度的酶解液，从而进行连续发酵。
本发明中，使用的韧皮纤维来源于麻类作物，例如红麻、黄麻等韧皮纤维作物的外皮。一个优选的实施方式中，所述的麻类作物为红麻。
本发明的步骤具体包括酶解步骤和发酵步骤，通过酶解步骤提供酶解液，从而作为发酵步骤中的底液。所述的酶解步骤具体包括步骤(a)-(a3)：
(a)提供含有韧皮纤维的酶解底物；
(a1)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用外切葡萄糖酶对所述的酶解底物进行酶解，得到第一酶解糖液；
(a2)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用内切葡萄糖酶对所述的第一酶解糖液进行酶解，得到第二酶解糖液；
(a3)在35-50℃下，调节体系pH为4.5-5.5，在高剪切均质搅拌条件下，用葡萄糖苷酶对所述的第二酶解糖液进行酶解，得到第三酶解糖液。
在酶解后，对所述的第三酶解糖液进行发酵处理，所述的发酵步骤包括步骤(b)-(c)：
(b)对所述的第三酶解糖液进行稀释，得到发酵底液；
(c)对所述的发酵底液进行发酵，得到含有PHA产品的发酵产物。
本发明的一些具体实施方式下，所述的操作方法包括如下步骤：
将麻类纤维干燥至水分8-20％后，送入切碎机进行切断，切断后长度为1-10cm，更佳的为1.5-6cm，过筛后送入旋风分离装置，随后送入超细粉碎机中进行超细粉碎，粉碎尺寸为20-800目，更佳的为50-300目。
粉碎后的物料送入蒸汽爆破装置中进行汽爆，汽爆前进行预浸处理，预浸温度为30-60℃，预浸时间为2-12个小时，汽爆温度为150-280℃，更佳的为180-250℃，汽爆压力为1.2-2.5Mpa，更佳的为1.6-2.2Mpa。
通过高速汽爆后的物料，迅速直接送入酶解罐中进行酶解处理，酶解过程中采用乳化均质处理，采用外切葡萄糖酶-内切葡萄糖酶-葡萄糖苷酶分步投放的方式进行酶解，酶解时间为48-72小时，期间需动态调整PH与温度以适应不同酶制剂的需求，酶解后的糖液经过封闭式过滤沉淀后，送入发酵罐中进行发酵，发酵初始底物浓度为15-20％，菌种为产PHA的大肠杆菌工程菌，发酵温度为35-42℃，过程中采取流加补料，在24h内保持总糖浓度不低于15％，总发酵时间为40-60h，发酵后干物质浓度为150-300g/L，其中PHA含量不低于50％，将物料送入离心装备脱水后进行乙醇加压提取，获得PHA成品。
与现有技术相比，本发明的主要优点包括：
(1)采用韧皮纤维为原料，避免了使用粮食原料；
(2)对高聚合度和高纤维含量的韧皮作物的外皮进行粉碎和预浸，使得酶解底物浓度与效率大大提高；
(3)采用了特殊的分步酶解工艺，从而对高纤维底物实现了高效率酶解，得到高糖度的酶解液，适用于连续发酵；
(4)高浓度糖酶解液流加工艺，保证产PHA的全程高效并实现最后的高含量PHA获取。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
(1)预处理步骤
红麻韧皮纤维，收获后自然干燥，含水量为14％，未经过其他任何处理。采用切碎机将红麻纤维切断后过筛，获得长度不超过10cm的红麻纤维小段，平均长度约为8cm，在过筛后用旋风分离装置进行去杂去尘。将获得的麻皮纤维送入带前置粗碎的气流式切割超细粉碎机中，所获得的产品过筛，获得尺寸在0.1mm以下的麻皮粉末。将获得的粉末进行预浸处理，预浸处理液为PH为5.5的稀盐酸溶液，预浸温度为65℃，预浸时间为6h。预浸后送入间歇式超音速蒸汽爆破装置，汽爆温度为200℃，压力为2.1Mpa，保压时间为6min。
(2)酶解步骤
汽爆后的原料通过管道直接送入酶解罐中，底物浓度为40％，调节PH至5.8后加入外切葡萄糖酶，打开高剪切均质机，转速为16,000rpm，酶解温度为40℃，酶解12h后，调节PH至5.8后加入内切葡萄糖酶，高剪切均质机转速为20,000rpm，酶解温度为45℃，酶解12h后，调节PH至5.0后加入葡萄糖苷酶，高剪切均质机转速为16,000rpm，酶解温度为45℃，12h后，高剪切均质机转速为12,000rpm，24h后酶解结束，酶解时间共计60h。
(3)发酵步骤
将酶解液配比成20％糖浓度的发酵底液，加入PHA工程菌种后进行发酵，发酵温度为35℃，动态检测发酵过程的糖度并采用流加补料，保证底物糖度在48h内不低于15％，发酵持续54小时后停止。稍经自然沉降后将下层发酵物离心脱水后得到发酵产物，发酵得率为26.1％，采用乙醇加压提取的方法得到PHA产品，PHA占干重的63％。
实施例2
(1)预处理步骤
红麻韧皮纤维，收获后自然干燥，含水量为14％，未经过其他任何处理。采用切碎机将红麻纤维切断后过筛，获得长度不超过10cm的红麻纤维小段，平均长度约为8cm，在过筛后用旋风分离装置进行去杂去尘。将获得的麻皮纤维送入带前置粗碎的气流式切割超细粉碎机中，所获得的产品过筛，获得尺寸在0.2mm以下的麻皮粉末。将获得的粉末进行预浸处理。预浸处理液为清水，预浸温度为70℃，预浸时间为6h。预浸后送入间歇式超音速蒸汽爆破装置，汽爆温度为220℃，压力为2.2Mpa，保压时间为8min。
(2)酶解步骤
汽爆后的原料通过管道直接送入酶解罐中，底物浓度为40％，调节PH至5.8后加入外切葡萄糖酶，打开高剪切均质机，转速为16,000rpm，酶解温度为40℃，酶解6h后，调节PH至5.8后加入内切葡萄糖酶，高剪切均质机转速为20,000rpm，酶解温度为45℃，酶解6h后，调节PH至5.0后加入葡萄糖苷酶，高剪切均质机转速为12,000rpm，酶解温度为45℃，12h后，高剪切均质机转速为8,000rpm，24h后酶解结束，酶解时间共计48h。
(3)发酵步骤
将酶解液配比成20％糖浓度的发酵底液，加入PHA工程菌种后进行发酵，发酵温度为35℃，动态检测发酵过程的糖度并采用流加补料，保证底物糖度在40h内不低于15％，发酵持续48小时后停止。稍经自然沉降后将下层发酵物离心脱水后得到发酵产物，发酵得率为23.4％，采用乙醇加压提取的方法得到PHA产品，PHA占干重的58％。
对比例1：
(1)预处理步骤
玉米秸秆，收获后自然干燥，含水量为18％，未经过其他任何处理。采用秸秆粉碎机将玉米秸秆粉碎至0.5-1cm的碎片，在过筛后用旋风分离装置进行去杂去尘。将获得的玉米秸秆送入气流式切割超细粉碎机中，所获得的产品过筛，获得尺寸在0.1mm以下的玉米秸秆粉末。将获得的粉末进行预浸处理，预浸处理液为清水，预浸温度为65℃，预浸时间为6h。预浸后送入间歇式超音速蒸汽爆破装置，汽爆温度为200℃，压力为2.1Mpa，保压时间为8min。
(2)酶解步骤
汽爆后的原料通过管道直接送入酶解罐中，底物浓度为40％，调节PH至5.8后加入外切葡萄糖酶，打开高剪切均质机，转速为12,000rpm，酶解温度为40℃，酶解12h后，调节PH至5.8后加入内切葡萄糖酶，高剪切均质机转速为16,000rpm，酶解温度为45℃，酶解12h后，调节PH至5.0后加入葡萄糖苷酶，高剪切均质机转速为16,000rpm，酶解温度为45℃，12h后，高剪切均质机转速为12,000rpm，24h后酶解结束，酶解时间共计60h。
(3)发酵步骤
由于步骤(2)中的酶解液糖度过低，故只能配比成15％糖浓度的发酵底液，加入PHA工程菌种后进行发酵，发酵温度为35℃，采用一次性加料，发酵持续60小时后停止，因酶解液中含有杂醇，发酵不充分。稍经自然沉降后将下层发酵物离心脱水后得到发酵产物，发酵得率为6.1％，采用乙醇加压提取的方法得到PHA产品，PHA占干重的43％。
结果显示，采用现有技术中的玉米秸秆发酵液的情况下，酶解液糖度过低，因此无法进行连续发酵，然而，在采用本发明的红麻韧皮纤维作为原料的情况下，酶解得到的酶解液的糖度较高，因此可以进行连续发酵，从而提升生产工艺中的总体产量，提升发酵得率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种利用韧皮纤维生产聚羟基脂肪酸酯PHA材料的方法，其特征在于，包括酶解步骤和发酵步骤，所述的酶解步骤包括步骤(a)-(a3)：
(a)提供含有韧皮纤维的酶解底物；
(a1)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用外切葡萄糖酶对所述的酶解底物进行酶解，得到第一酶解糖液；
(a2)在35-50℃下，调节体系pH为5-6.5，在高剪切均质搅拌条件下，用内切葡萄糖酶对所述的第一酶解糖液进行酶解，得到第二酶解糖液；
(a3)在35-50℃下，调节体系pH为4.5-5.5，在高剪切均质搅拌条件下，用葡萄糖苷酶对所述的第二酶解糖液进行酶解，得到第三酶解糖液；
所述的发酵步骤包括步骤(b)-(c)：
(b)对所述的第三酶解糖液进行稀释，得到发酵底液；
(c)对所述的发酵底液进行发酵，得到含有PHA产品的发酵产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a3)中，所述的第三酶解糖液的糖度为18-22％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，发酵过程采取流加补料，在24h内保持发酵液中总糖度不低于15％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的发酵底液的糖度为15-20％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在酶解步骤前，对韧皮纤维进行切碎处理和预浸处理，其中，所述的切碎包括如下步骤：
(Z1)将干燥的韧皮纤维切碎，然后过筛，得到碎韧皮纤维；
(Z2)分离所述的碎韧皮纤维，然后进行超细粉碎，得到超细韧皮纤维；
(Z3)对所述的超细韧皮纤维进行预浸处理，然后进行汽爆，得到待酶解的韧皮纤维物料。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，预浸液选自下组：pH为5.0-6.0的稀盐酸、pH为8.0-9.0的氢氧化钠溶液或清水。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述的发酵产物离心脱水，然后用乙醇加压提取后进行干燥造粒，得到PHA产品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，常温下，所述的PHA产品呈粉末状或颗粒状固体。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵产物中PHA干物质浓度为150-300g/L，其中发酵总固形产物中PHA含量不低于50％。
10.一种利用韧皮纤维生产的聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯(PHA)材料用权利要求1所述的方法制备。
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RIJUTA, G.S. 等: "Pretreatment of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) biomass feedstock for polyhydroxybutyrate (PHB) production and characterization" *
尹芬 等: "木质纤维素材料合成PHA 预处理技术的研究进展", vol. 41, no. 5, pages 100 - 108 *

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