CN114277061A - 一种发酵辣木叶的制备方法及其在水产养殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵辣木叶的制备方法及其在水产养殖中的应用，包括将解淀粉芽孢杆菌和酪酸芽孢杆菌35℃LB培养基培养18～20h，调整菌液浓度为107cfu/mL‑108cfu/mL，将辣木叶粉碎后，过80～100目筛，以料水比5％～10％加入蒸馏水，混合，灭菌，按2％～5％的菌液接种量将解淀粉芽孢杆菌和酪酸芽孢杆菌菌液同时接入灭菌后的辣木叶混合溶液中，30℃发酵48～72小时，再将发酵好的样品，进行冷冻干燥，即发酵辣木叶成品。本发明能有效提高发酵后辣木叶的营养价值，降低辣木叶中的抗营养因子。与未发酵的辣木叶相比，经发酵后辣木叶粉比未发酵辣木叶粉蛋白质含量、总酚含量、黄酮、小肽和氨基酸含量显著提高，分别提高了36.45％、358.91％、171.43％、77.63％和66.47％，经发酵后辣木叶单宁含量比未发酵辣木叶粉单宁含量显著降低，降低了17.39％。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵辣木叶的制备方法，以及将该发酵辣木叶作为饲料原料应用于水产养殖中，具体为一种发酵辣木叶的制备方法及其在水产养殖中的应用，属于水产养殖技术领域。
背景技术
辣木(Moringa Oleifera)属于辣木科辣木属植物，源起于印度北部喜马拉雅，共有13个品种。辣木中不仅含有丰富的蛋白质、粗纤维、矿物质、维生素等，而且具有较高的医用价值和药用价值，对治疗多种疾病有一定的作用，因此国际上称之为“奇迹之树”、“植物钻石”。辣木叶含有丰富的营养成分，目前已经被广泛的应用于畜牧业，但由于辣木叶中含有一些抗营养因子，不利于水产动物的摄食及消化吸收，因此，限制其在水产饲料中的应用。
生物发酵技术不仅可以利用微生物降低植物性原料中的抗营养因子，而且通过微生物发酵可以有效提高蛋白质水平及有效物质含量。研究表明，利用发酵技术制作发酵饲料，在发酵过程中，能产生维生素、有机酸等未知因子，可以有效的降解饲料中的一些抗营养因子，能有效的提高动物采食量，增强其免疫能力。在水产养殖业中使用发酵饲料，可以提高养殖动物的消化、免疫能力，减少了池塘中的粪便、残饵对池塘水体的污染。
本发明拟利用微生物对辣木叶进行发酵，提高其营养价值，并探索其作为水生动物新型水产饲料添加剂的可行性。
发明内容
本发明的目的在于克服辣木叶直接饲喂水产动物时，水生动物不摄食并且营养物质消化吸收差的弱点，提供了一种用有益菌发酵辣木叶的方法，通过微生物发酵处理，提高辣木叶的营养价值，以及将辣木叶作为水产动物饲料添加剂应用于水产养殖业中。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种发酵辣木叶的制备方法，包括以下步骤，
(1)菌种的活化和菌液制备
选择枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA 和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，使菌种活化；将活化后的菌种接种到LB液体培养基中35℃培养18～20小时后，使用灭菌的PBS稀释菌液，将菌液浓度调整至1×107CFU/mL～1×108CFU/ mL；
(2)辣木叶预处理
将辣木叶低温冷冻干燥后，粉碎，过80～100目筛，待用；
(3)发酵条件的选择
取步骤(2)中粉碎过筛后的辣木叶分别以料水比为1:7.5、1:10、1:12.5 加入蒸馏水混合后，调节pH值至8.6，121℃的高压灭菌30min，待灭菌完成冷却至室温，将步骤(1)中枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的菌液按2％～5％的接种量分别接种到料水比为1:7.5、1:10、1:12.5的灭菌后的辣木叶水溶液中，控制发酵温度分别为30℃、35℃和40℃，发酵时间选择24小时、48小时和72小时，按L9(34)正交表进行正交试验，结果显示解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312在料水比1:10、时间48h、温度30℃条件下，辣木叶发酵最佳；
(4)发酵辣木叶成品的制备
根据步骤(3)的试验结果，将经解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌 JSIM-MCB20040312发酵的辣木叶在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥后进行超微粉碎，得到发酵辣木叶成品。
优选地，所述解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CCTCCM2015602，酪酸芽孢杆菌JSIM- MCB20040312保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:1647。
优选地，所述LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/ L，琼脂15～20g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2；LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司。
优选地，所述步骤(1)中所述枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA- 2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的菌液浓度相同，菌种在LB液体培养基中的培养时间为18h，所述步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌 JSIM-MCB20040312的菌液接种量相同。
一种发酵辣木叶的制备方法在水产养殖中的应用。
优选地，所述饲料中发酵辣木叶的有效添加量为0.5％～1％。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过双菌种发酵辣木叶，发酵周期短，发酵条件易控制，操作简便，易于标准化生产；
2、本发明通过发酵辣木叶工艺制备，能有效提高发酵后辣木叶的营养价值，降低辣木叶中的抗营养因子。与未发酵的辣木叶相比，经发酵后辣木叶粉比未发酵辣木叶粉蛋白质含量、总酚含量、黄酮、小肽和氨基酸含量显著提高，分别提高了36.45％、358.91％、171.43％、77.63％和66.47％，经发酵后辣木叶单宁含量比未发酵辣木叶粉单宁含量显著降低，降低了17.39％；
3、饲料中发酵辣木叶添加量为0.5％～1％时，可显著提高克氏原螯虾的增重率和特定生长率，说明本发明制备的辣木叶应用于水产动物养殖时，显著提高了水产动物的生长，证明了将发酵辣木叶作为水产动物饲料添加剂的可行性。
附图说明
图1为本发明不同发酵菌种下发酵辣木叶蛋白质、总酚含量图。
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312发酵辣木叶蛋白质、总酚含量图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明所采用试验方法均为常规方法，所用试验器材、材料、试剂等均可以商家途径获得。
本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JSSW-LA，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC M 2015602；保藏日期2015年10月12日；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学；
酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB 20040312，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号 CGMCC No.1647；保藏日期2006年3月10日；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
一种发酵辣木叶的制备方法
实施例1比较枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和酪酸芽孢杆菌对辣木叶发酵的影响
将枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、枯草芽孢杆菌ZSP、枯草芽孢杆菌JD、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，使菌种活化；用接种环挑取已活化的单菌落接种到LB液体培养基中，35℃扩培18h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS 稀释菌液，调整菌液浓度至1×107CFU/mL；
将辣木叶粉碎后过100目筛，每公斤辣木叶加入10公斤水，混合后121℃的高压灭菌30min并冷却至室温，待用；将扩培后的各菌液以2％的接种量接种至灭菌后的辣木叶混合物中，30℃发酵48小时后，将发酵物在-80℃条件预冷 2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥，测定蛋白质含量及总酚含量，测定结果如图1所示，结果表明，解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JS IM- MCB20040312发酵效果最佳，解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA的总酚、蛋白质含量分别为34.89mg/g和147.33mg/g；酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的总酚、蛋白质含量分别为41.25mg/g和138.56mg/g。
根据上述结果，筛选解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、酪酸芽孢杆菌JS IM- MCB20040312及其复合菌种对辣木叶发酵的影响。将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，使菌种活化；用接种环挑取已活化的单菌落接种到LB液体培养基中，35℃扩培 18h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，调整菌液浓度至1×107CFU/ mL；将辣木叶粉碎后过100目筛，每公斤辣木叶加入10公斤水，混合后121℃的高压灭菌30min并冷却至室温，待用；将扩培后的解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312菌液分别以2％的接种量接种至灭菌后的辣木叶混合物中，同时，将扩培后的解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM- MCB20040312菌液1:1混合后以2％的接种量同时接种至灭菌后的辣木叶混合物中，30℃发酵48小时后，将发酵物在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥，测定蛋白质含量及总酚含量，测定结果如图2所示，结果表明，解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312同时接种时发酵效果最佳，具有一定的协同作用，其总酚、蛋白质含量分别为45.53mg/g和 168.78mg/g。
根据上述结果，将经解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JS IM-MCB20040312发酵的辣木叶在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥后进行超微粉碎，得到发酵辣木叶成品。
上述实施例中，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司
LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂15～ 20g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2。
LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2。
经前期基础试验可知，活化后的枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA- 2、枯草芽孢杆菌ZSP、枯草芽孢杆菌JD、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312在扩培时间为18h时活性最高，因此在上述实施例中，扩培时间选择18h。
实施例2比较菌种、料水比、温度、时间对辣木叶发酵的影响
菌种分别选择解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312以及解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312混合物，粉碎后的辣木叶料水比分别为1:7.5、1:10、1:12.5，发酵温度分别为30℃、35℃和40 ℃，发酵时间选择24小时、48小时和72小时，按L9(34)正交表进行正交试验。正交试验设计及结果如表1所示。
将解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA、酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312按实施例1中的方法活化后，35℃扩培18h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，调整菌液浓度至1×107CFU/mL。辣木叶粉碎后过100目筛，按照正交试验表中的料水比加入蒸馏水，混合后121℃的高压灭菌30min并冷却至室温，待用；将扩培后的菌液以3％的接种量接种至灭菌后的辣木叶混合溶液中，同时按1:1将两个菌液混合后以3％的接种量进行接种，按照发酵温度和时间进行发酵后，发酵结束后，在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥，测定蛋白质含量及总酚含量。结果如表1所示，解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312混合物，在料水比1:10、时间72h、温度30℃条件下，辣木叶发酵最佳。在此条件下发酵后辣木叶总酚含量为41.54mg/g，蛋白质含量为 325.48mg/g。
表1 L9(34)正交试验设计及蛋白质含量测定结果
注：A.菌种，B.料水比，C.温度，D时间；K1-K3代表各因素各水平下试验指标的影响大小；R代表各因素对试验指标的影响主次。
表2 L9(34)正交试验设计及总酚含量测定结果
注：A.菌种，B.料水比，C.温度，D时间；K1-K3代表各因素各水平下试验指标的影响大小；R代表各因素对试验指标的影响主次。
实施例3发酵前后辣木叶营养成分含量对比分析
解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312按实施例1的方法活化后，35℃扩培18h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。辣木叶粉碎后过100目筛，按照料水比1:10加入蒸馏水，混合后121℃的高压灭菌30min，冷却至室温待用；将扩培后的菌液按1:1混合后以2％的接种量接种至辣木叶混合物中，30℃发酵48h后，在-80℃条件预冷 2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥，测定辣木叶发酵前与发酵后蛋白质含量、总酚含量、黄酮、小肽、单宁含量变化，测定结果如表3所示。
结果发现，经发酵后辣木叶粉比未发酵辣木叶粉蛋白质含量、总酚含量、黄酮、小肽和氨基酸含量显著提高，分别提高了36.45％、358.91％、171.43％、 77.63％和66.47％，经发酵后辣木叶单宁含量比未发酵辣木叶粉单宁含量显著降低，降低了17.39％，上述结果表明，经发酵后辣木叶粉比未发酵辣木叶粉营养含量显著提高，经发酵后辣木叶粉利于水产动物的摄食及消化吸收。
表3发酵前后辣木叶营养成分含量变化
实施例4发酵辣木叶的制备方法在水产养殖中的应用
解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312按实施例1的方法活化后，35℃扩培18h后测定菌液浓度，使用灭菌的PBS稀释菌液，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。辣木叶粉碎后过100目筛，按照料水比1:10加入蒸馏水，混合后121℃的高压灭菌30min，冷却至室温待用；将扩培后的菌液按1:1混合后以2％的接种量接种至辣木叶混合物，30℃发酵48h后，在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥。
取规格相同的克式原螯虾600尾，随机分成4组，每组3个重复，每个重复 50尾虾，将发酵后辣木叶添加至克式原螯虾的饲料中，添加量分别为0、 0.25％、0.5％和1％，试验饲料原料组成及营养组成如表4所示，养殖60天。
每日根据饲料分组情况投喂相应的饲料，日投喂量为虾体重的2％，根据虾的摄食情况和生长情况调整投喂量，以投喂1h后吃完为宜，每日投喂3次(8： 00、12：00和18：00)，均为饱食投喂。
养殖试验在室内循环养殖缸内进行，养殖缸直径为1m，养殖缸水位保持 40±5cm，定期检测水质指标，保证试验期间溶氧≥6.0mg/L，pH7.3±1.2，氨氮<0.2mg/L，亚硝酸盐<0.005mg/L。每天使用排污管进行排污，每周进行一次换水，保证良好的水质。每天观察虾的生长和摄食情况，发现死虾后及时捞起，称重并做好记录。
养殖试验结束后，测定克式原螯虾的生长性能，结果如表4所示，与对照组相比，发酵辣木叶添加量为0.25％时，克氏原螯虾增重率和特定生长率均没有显著差异；而当发酵辣木叶添加量为0.5％和1％时，克氏原螯虾的增重率和特定生长率均显著高于对照组。当发酵辣木叶添加量为0.5％和1％时，克氏原螯虾的增重率分别达到了164.69％和178.41％，与对照组相比分别提高了43.31％和 55.25％；特定生长率分别达到1.74和1.88，与对照组相比分别提高了13.73％和 22.88％，上述结果表明，将发酵辣木叶作为水产动物饲料添加剂可显著提高水产动物的生长。
表4试验饲料原料组成及营养组成
注：维生素A，25000IU；维生素D3，20000IU；维生素E，200mg；维生素K3，20mg；硫铵，40mg；核黄素，50mg；泛酸钙，100mg；盐酸吡哆醇，40mg；维生素B12，0.2mg；生物素，6mg；叶酸，20mg；烟酸，200mg；肌醇，1000 mg；维生素C，2000mg；胆碱，2000mg；磷酸二氢钙，20g；氯化钠，2.6g；氯化钾，5g；硫酸镁，2g；硫酸亚铁， 0.9g；硫酸锌，0.06g；硫酸铜，0.02g；硫酸镁，0.03g；硒酸钠，0.02g；氯化钴，0.05g；碘化钾，0.004g。
表5发酵辣木叶添加量对克氏原螯虾生长性能的影响
上述实施例中，克式原螯虾购自市场，LB液体培养基包括蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 5g/L。
上述实施例中，蛋白质含量的测定采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒，该试剂盒购自碧云天生物有限公司；总酚含量的测定采用植物总酚(TP)含量检测试剂盒，该试剂盒购自北京索莱宝公司。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种发酵辣木叶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)菌种的活化和菌液制备
选择枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312分别接种到LB固体培养基中，35℃培养24h，使菌种活化；将活化后的菌种接种到LB液体培养基中35℃培养18～20小时后，使用灭菌的PBS稀释菌液，将菌液浓度调整至1×107CFU/mL～1×108CFU/mL；
(2)辣木叶预处理
将辣木叶低温冷冻干燥后，粉碎，过80～100目筛，待用；
(3)发酵条件的选择
取步骤(2)中粉碎过筛后的辣木叶分别以料水比为1:7.5、1:10、1:12.5加入蒸馏水混合后，调节pH值至8.6，121℃的高压灭菌30min，待灭菌完成冷却至室温，将步骤(1)中枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的菌液按2％～5％的接种量分别接种到料水比为1:7.5、1:10、1:12.5的灭菌后的辣木叶水溶液中，控制发酵温度分别为30℃、35℃和40℃，发酵时间选择24小时、48小时和72小时，按L9(34)正交表进行正交试验，结果显示解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312在料水比1:10、时间48h、温度30℃条件下，辣木叶发酵最佳；
(4)发酵辣木叶成品的制备
根据步骤(3)的试验结果，将经解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312发酵的辣木叶在-80℃条件预冷2h，在-50℃～-60℃条件下真空干燥后进行超微粉碎，得到发酵辣木叶成品。
2.根据权利要求1所述的一种发酵辣木叶的制备方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCM2015602，酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:1647。
3.根据权利要求1所述的一种发酵辣木叶的制备方法，其特征在于：所述LB固体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂15～20g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2；LB液体培养基组成包含蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，以蒸馏水定容配置，pH7～7.2，粉碎机型号为CWJZ-30，购自广州旭朗机械设备有限公司。
4.根据权利要求1所述的一种发酵辣木叶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的菌液浓度相同，菌种在LB液体培养基中的培养时间为18h，所述步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌S1X-15、枯草芽孢杆菌IIIA-2、解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA和酪酸芽孢杆菌JSIM-MCB20040312的菌液接种量相同。
5.一种发酵辣木叶的制备方法在水产养殖中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种发酵辣木叶的制备方法在水产养殖中的应用，其特征在于：所述饲料中发酵辣木叶的有效添加量为0.5％～1％。
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