CN114272254B - 甘草次酸和芍药苷的组合在治疗肝损伤、肝纤维化中的应用 - Google Patents
甘草次酸和芍药苷的组合在治疗肝损伤、肝纤维化中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及甘草次酸和芍药苷的组合在治疗肝损伤、肝纤维化中的应用。具体地，本发明提供了一种一定比例的甘草次酸和芍药苷的组合，优选地为1：4，及其在制备缓解和/或治疗急性肝损伤、慢性肝损伤、肝纤维化的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及甘草次酸和芍药苷的组合在治疗肝损伤、肝纤维化中的应用。
背景技术
肝损伤是各种肝病的共同病理环节，多种有害因素如病毒、药物、酒精等均可导致肝脏受损，其中急性肝损伤起病急、进展快、并发症多、死亡率高、治疗难度大。肝脏若长期处于受损、炎症环境中，肝脏修复与瘢痕形成过程紊乱，最终导致肝纤维化。
肝纤维化是慢性肝损伤常见的伤愈合反应，病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精的过度摄入、代谢和自身免疫性疾病等，都是肝纤维化的形成因素。长期的肝纤维化会引发肝硬化及原发性肝细胞癌，全球每年因此类疾病死亡的人数约150万人。
无论是急性肝损伤还是慢性肝纤维化都伴有较高的致死率，目前尚无疗效良好的治疗药物。
在多种类型的急性、慢性肝损伤中，甘草小分子甘草次酸(Glycyrrhetinicacid,GA)、芍药小分子芍药苷(Paeoniflorin,PF)单独用药时的保肝功效已有较多报道。如在ANIT诱导胆汁淤积性肝损伤中，GA可调控转运体表达进而调节胆汁酸平衡，并通过Sirt1/FXR信号通路改善肝损伤；在CCl4诱导的肝纤维化模型中，GA也可通过调节Nrf2相关通路抵抗肝纤维化；PF在体内可通过PI3K/Akt依赖的途径激活Nrf2，从而达到保护ANIT诱导的急性肝损伤的作用。但至今尚未有研究报道指出二者组合用药时，是否具有优于单药的保护和治疗急、慢性肝损伤的保肝活性。
因此本领域迫切需要研发新型的用于治疗肝损伤、肝硬化的药物，优选地甘草次酸、芍药苷的组合及其在制备治疗肝损伤、肝硬化的药物中的应用。
发明内容
本发明的目的是，提供一种甘草次酸、芍药苷的组合，及其在制备治疗肝损伤、肝纤维化的药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含甘草次酸和芍药苷，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:2～1:12。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为2:4～3:19。
在另一优选例中，所述甘草次酸包括：α型甘草次酸，β型甘草次酸。
在另一优选例中，所述甘草次酸为18β-甘草次酸(GA)。
在另一优选例中，所述的药物组合物为选自下组的形式：口服制剂、注射制剂。
在另一优选例中，所述制剂选自下组：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
在另一优选例中，所述组合物或制剂给药方式为注射给药，优选地为腹腔注射给药。
在另一优选例中，所述药物组合物用于一种或多种选自下组的用途：
1)制备治疗和/或缓解急性肝损伤的药物；
2)制备治疗和/或缓解慢性肝损伤的药物；
3)制备治疗和/或缓解肝纤维化的药物；
4)制备治疗肝保护的药物。
在另一优选例中，所述组合物中甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15，较佳地为1:2～1:12，更佳地为2:4～3:19。
在另一优选例中，所述甘草次酸给药剂量为5mg/kg～50mg/kg样本重，较佳地为15mg/kg～40mg/kg样本重，更佳地为25mg/kg样本重。
在另一优选例中，所述芍药苷给药剂量为20mg/kg～250mg/kg样本重，较佳地为40mg/kg～160mg/kg样本重，更佳地为100mg/kg样本重。
在本发明的第二方面，提供可一种甘草次酸和芍药苷的组合物的用途，所述组合物用于制备治疗肝脏疾病和/或改善肝脏机能的药物组合物。
在另一优选例中，所述的肝脏疾病选自下组：急性肝损伤、慢性肝损伤、肝纤维化。
在另一优选例中，所述的治疗肝脏疾病和/或改善肝脏机能指选自下组的指标被降低或改善：ALT、AST、ALP、TBIL，或其组合。
在另一优选例中，所述的治疗和/或缓解指选自下组的指标被降低或改善：α-SMA的表达水平降低、肝脏汇管区和中央静脉区周围纤维束的形成减少、慢性炎症水平改善，或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种治疗急性肝损伤和/或慢性肝损伤和/或肝纤维化的方法，包括步骤，给有需要的对象施用医学有效量的第一方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述对象为急性肝损伤和/或慢性肝损伤和/或肝纤维化患者。
在本发明的另一方面，提供了一种体外的非治疗性的降低血浆ALT和/或AST和/或TBIL的方法，包括步骤：将样本和医学有效量的第一方面所述的药物组合物接触。
在另一优选例中，所述样本选自：血浆样本、肝脏样本、或其组合。
本发明的另一方面，提供了一种体外的非治疗性的降低α-SMA表达的方法，包括步骤：将细胞和医学有效量的第一方面所述的药物组合物接触。
在另一优选例中，所述组合物中甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15，较佳地为1:2～1:12，更佳地为2:4～3:19。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.1显示了实施例1中的给药方案。
图1.2显示了小鼠血浆酶变化的情况。其中A为各组小鼠血浆酶ALT变化图；B为各组小鼠血浆酶AST变化图；C为各组小鼠血浆酶TBIL变化图。图中数据均以平均值±标准误差表示，各组与ANIT组间的统计学差异根据One-way ANOVA计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001，与ANIT组相比；各联合用药组与25mg/kg GA单药组间统计学差异根据t-test计算，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001，与25mg/kg GA单药组相比。
图1.3显示了小鼠肝组织切片及评分。
图2.1显示了实施例2中的给药方案。
图2.2中，A为各组小鼠血浆酶ALT变化图；B为各组小鼠血浆酶AST变化图；
C为各组小鼠血浆酶TBIL变化图。图中数据均以平均值±标准误差表示，各组与ANIT组间的统计学差异根据One-way ANOVA计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001，与ANIT组相比；25mg/kg GA+100mg/kg PF联合用药组与25mg/kg GA单药组间统计学差异根据t-test计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001。
图2.3显示了小鼠肝组织切片及评分。
图3.1显示了小鼠血浆酶的变化情况，其中A为实验进程中各组小鼠血浆酶ALT变化图；B为实验进程中各组小鼠血浆酶AST变化图。图中数据均以平均值±标准误差表示，统计学差异根据t-test计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001。
图4.1为GA与PF联合用药对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的保护作用的实验方案。
图4.2为小鼠血浆酶变化及α-SMA表达水平变化。其中，A为实验进程中各组小鼠血浆酶ALT变化图；B为实验进程中各组小鼠血浆酶AST变化图；C为小鼠肝脏组织α-SMA在mRNA水平的表达变化；D为小鼠肝脏组织α-SMA在蛋白水平的表达变化。图中数据均以平均值±标准误差表示，统计学差异根据t-test计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001。
图4.3显示了小鼠肝脏组织H&E染色、Masson染色及纤维化、炎症评分结果。其中，A为各组小鼠肝脏组织H&E染色(10X)及Masson染色(10X)镜下观察；B为各组小鼠肝脏纤维化程度评分结果(根据Masson染色结果)；C为各组小鼠肝脏慢性炎症评分结果(根据H&E及Masson染色结果)。图中数据均以平均值±标准误差表示，统计学差异根据t-test计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001,****p<0.0001。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，一定比例的甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)、芍药苷(Paeoniflorin,PF)的组合能有效治疗肝损伤、肝纤维化，在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明提供了一种GA、PF的组合，优选地GA：PF的质量比为1:4时，能够有效地抗急性、慢性肝损伤，肝纤维化。以此为基础，本发明研究了GA、PF的组合在制备治疗急性、慢性肝损伤，肝纤维化的药物中的应用。
术语
如本文所用，“本发明的组合物”，“本发明的药物组合物”，“本发明的甘草次酸和芍药苷的药物组合物”，可互换使用，均指的是一定配伍的甘草次酸和芍药苷的药物组合物，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15，较佳地为1:2～1:12，更佳地为2:4～3:19。
甘草次酸
甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)是从天然植物药甘草(GlycyrrhizaUralensis)的根中提取的甘草酸经过水解后精制而得。药理实验证明，甘草次酸作为甘草酸在体内代谢的产物，在血液中能够得到很好的吸收，其药理应用因而也比较广泛。甘草次酸通过诱导肿瘤细胞的凋亡和分化、阻滞细胞周期、抑制肿瘤多药耐药性以及抑制促癌剂的诱癌作用等方式，对肝癌、肺癌、胃癌及白血病等多种肿瘤细胞系的体外生长具有广泛的抑制作用，同时对正常体细胞的毒性较小。
芍药苷
芍药苷为赤芍(毛茛科植物芍药(paeonialactilloraPall.)或川赤芍(P.vaitchiilynch)的干燥根的有效部位；芍药苷为吸湿性无定形粉末(90％为类白色粉末)，熔点196℃，在酸性环境下芍药苷稳定(pH2～6)，在碱性环境下不稳定。
芍药苷有免疫调节作用，临床常用于肿瘤和血瘀证的治疗，尤以肝病常见)的主要有效部位，芍药苷具有降低血糖，抗肿瘤、扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿、抗应激性溃疡病、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面作用，而且毒性小。临床己用于治疗冠心病。
芍药苷因具有扩张血管、抗炎、抗溃疡、抗过敏、解热解痉及缓解疼痛、神经保护、增加冠状动脉流量、免疫调节、利尿等多种药理作用，可作为有效成分用于治疗冠心病、类风湿性关节炎、肝炎和老年性相关疾病等。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含甘草次酸和芍药苷，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:2～1：12。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为2:4～3:19。
本发明的药物组合物含有安全有效量的甘草次酸和芍药苷，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的甘草次酸和芍药苷，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1～1:15施用于哺乳动物，其中所述甘草次酸给药剂量为5mg/kg～50mg/kg体重，较佳地为15mg/kg-40mg/kg体重，更佳地为25mg/kg体重；
所述芍药苷给药剂量为20mg/kg～250mg/kg体重，较佳地为40mg/kg-160mg/kg体重，更佳地为100mg/kg体重。
当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
肝损伤
肝脏是物质代谢的重要器官，具有分泌、排泄、合成、生物转化及免疫等多种生理功能。当肠黏膜屏障被破坏、外源性毒素入侵时，肝生物转化作用减弱，肝脏受损严重。很多因素都可以引起肝脏损伤，包括外伤导致的肝损伤、化学性肝损伤，主要是由于平时用药及酒精等因素造成的肝脏损伤以及病毒性肝炎所导致的肝损伤等。肝损伤发病率高，是一种难以治愈的疾病。严重的肝损伤导致肝纤维化，末期肝硬化甚至肝癌的病理过程不仅包括病毒的直接作用，而且免疫失调也起关键作用。
急性肝损伤是最常见的肝脏疾病，它是指机体暴露于有害条件下，如病毒感染、肝毒性药物、有毒物质、乙醇及放射等，短期内出现肝功能指标(如谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT、超氧化物歧化酶SOD)的异常。
急性肝损伤动物模型是用于研究急性肝损伤的重要工具，它为病理机制的研究、药物有效性及药物的新的作用靶点的研究提供了广泛的应用平台。当前，酒精性肝损伤、CCl4诱导的急性肝损伤以及脂多糖诱导的急性肝损伤模型已被广泛应用于治疗急性肝损伤药物的筛选、药物作用靶点及药理机制的研究，为临床药物的开发利用提供了基础。
急性肝损伤是慢性肝病的基础，严重或者持续的肝脏损伤可导致肝脏不可修复的损伤，致使肝脏功能衰竭。
肝纤维化
纤维化是一种常见的肝脏疾病，是慢性肝病一个共同的病理过程，是肝脏的一种可逆性损伤-愈合反应，主要由酒精滥用、病毒感染、胆管梗阻，以及HBV、HCV、非酒精性脂肪肝等病因引起,在中西方人群中发病都是非常普遍的。其特征表现为细胞外基质(ECM)的过度产生并在肝内过多沉积，影响肝细胞血流以及肝细胞功能，是肝功能受到损伤，失去基本的生物代谢功能，最终进展为肝硬化、慢性肝功能衰竭。对于晚期肝纤维化及肝癌患者，唯一有效的治疗方法就是肝移植。目前，肝组织活检是诊断的金标准，组织学病理的鉴定可以根据炎症、坏死的情况对肝纤维化的程度进行分级，但是由于其侵入性带来的疼痛，以及取材的随机性导致其临床应用有很大的局限性。
本发明的主要优点在于：
a)首次发现了甘草次酸和芍药苷一定比例配伍的药物组合物可以用于制备治疗和/或缓解急性肝损伤、慢性肝损伤、肝纤维化的药物；以及制备肝保护的药物。
b)本发明的甘草次酸和芍药苷的组合物可显著降低血浆酶ALT、AST水平，从而和/或缓解急性肝损伤、慢性肝损伤。
c)本发明的甘草次酸和芍药苷的组合物可显著降低α-SMA的表达，从而和/或缓解肝纤维化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1对GA、PF配伍比例的优化
1.1实验方案
实验动物选取6-8周龄雄性C57/BL6小鼠，体重22±2g，每组5只。实验分组情况如下：空白对照组(NC)、75mg/kg ANIT模型组、25mg/kg GA给药组、25mg/kg PF给药组、50mg/kg PF给药组、100mg/kg PF给药组、150mg/kg PF给药组、200mg/kg PF给药组、250mg/kg PF给药组、25mg/kg GA+25mg/kg PF(1:1)给药组、25mg/kg GA+50mg/kg PF(1:2)给药组、25mg/kg GA+100mg/kg PF(1:4)给药组、25mg/kg GA+150mg/kg PF(1:6)给药组、25mg/kgGA+200mg/kg PF(1:8)给药组、25mg/kg GA+250mg/kg PF(1:10)给药组。0.5％CMC-Na配制相应浓度GA、PF溶液；橄榄油配制相应浓度ANIT溶液。
具体给药方式如图1.1所示。各给药组小鼠腹腔注射相应药物5天，空白对照组及ANIT模型组小鼠腹腔注射0.5％CMC-Na溶液5天，第3天时，空白对照组小鼠灌胃橄榄油溶液，同时ANIT模型组小鼠及各给药组小鼠灌胃75mg/kg ANIT，构建小鼠急性肝损伤模型。48h后，即给药处理的第5天，解剖小鼠。收集血浆及肝脏样本，检测血浆ALT、AST、TBIL等指标，病理诊断肝脏组织切片。
1.2实验结果
对各组小鼠血浆酶ALT、AST、TBIL等指标的检测发现(图1.2)：单独用药时，仅25mg/kg GA给药组可显著降低血浆ALT、AST、TBIL，具有明显肝保护活性，PF各剂量组均未见明显改善。
联合用药时，GA与PF在不同比例下均可显著降低血浆肝酶ALT、AST、TBIL。当二者配伍比例为1：4时，其保肝降酶功效显著优于单药组，血浆肝酶各指标与单药组相比均显著下降；当二者配伍比例为1：6时，仅ALT、AST两指标相较于单药组显著下降，TBIL与单药组无统计学差异；当二者配伍比例为1：10时，仅AST相较于单药组显著下降，ALT、TBIL与单药组无统计学差异。
随后，对各组小鼠肝组织切片进行H&E染色，并对其肝细胞坏死情况及炎性细胞浸润情况进行评分，结果显示(图1.3)：ANIT造模处理后，小鼠肝细胞坏死，炎性细胞浸润增加；单独给药时，仅25mg/kg GA给药组可减少小鼠肝细胞坏死程度，降低肝内炎性细胞浸润情况，PF各剂量均无明显改善；
联合用药时，GA、PF各比例组合均可一定程度减轻肝细胞坏死及炎症，其中1:4和1:10两种比例组合效果最佳。
综上，GA:PF＝1:4，是二者较为合适的、发挥显著优于单药的比例组合。
实施例2.对GA、PF配伍剂量的优化
2.1实验方案
实验动物选取6-8周龄雄性C57/BL6小鼠，体重22±2g，每组6只。实验分组情况如下：空白对照组(NC)、75mg/kg ANIT模型组、5mg/kg GA给药组、20mg/kg PF给药组、5mg/kgGA+20mg/kg PF给药组、10mg/kg GA给药组、40mg/kg PF给药组、10mg/kg GA+40mg/kg PF给药组、15mg/kg GA给药组、60mg/kg PF给药组、15mg/kg GA+60mg/kg PF给药组、25mg/kg GA给药组、100mg/kg PF给药组、25mg/kg GA+100mg/kg PF给药组、40mg/kg GA给药组、160mg/kg PF给药组、40mg/kg GA+160mg/kg PF给药组。0.5％CMC-Na配制相应浓度GA、PF溶液；橄榄油配制相应浓度ANIT溶液。
具体给药方式如图2.1所示。各给药组小鼠腹腔注射相应药物5天，空白对照组及ANIT模型组小鼠腹腔注射0.5％CMC-Na溶液5天，第3天时，空白对照组小鼠灌胃橄榄油溶液，同时ANIT模型组小鼠及各给药组小鼠灌胃75mg/kg ANIT，构建小鼠急性肝损伤模型。48h后，即给药处理的第5天，解剖小鼠。收集血浆及肝脏样本，检测血浆ALT、AST、TBIL等指标，病理诊断肝脏组织切片。
2.2实验结果
对各组小鼠血浆酶ALT、AST、TBIL等指标的检测发现(图2.2)：单独用药时，GA的肝保护效果呈剂量依赖，仅较高剂量25mg/kg GA和40mg/kg GA给药组可显著降低血浆酶ALT、AST、TBIL的升高，其余各剂量GA组均无明显药效。PF各剂量均未见血浆酶的明显改善。
联合用药时，较低剂量的两药组合(5mg/kg GA+20mg/kg PF、10mg/kg GA+40mg/kgPF、15mg/kg GA+60mg/kg PF)可轻微改善肝功能指标ALT、AST等，同时部分组合(5mg/kg GA+20mg/kg PF)与单药组相比具有轻微优势。当GA、PF的配伍剂量升高至25mg/kg GA+100mg/kg PF和40mg/kg GA+160mg/kg PF时，均可显著降低各肝功能指标，其中25mg/kg GA+100mg/kg PF剂量组合，与单药组相比，ALT、AST两指标具统计学差异，有优于单药的保肝效果。
随后，对各组小鼠肝组织切片进行H&E染色，并对其肝细胞坏死情况及炎性细胞浸润情况进行评分，结果显示(图2.3)：ANIT造模处理后，小鼠肝细胞坏死、炎症细胞浸润情况加重，GA或PF单独用药时，未见明显改善。联合用药时，25mg/kg GA+100mg/kg PF给药组相较于单药及ANIT组，可改善肝细胞坏死及炎性细胞浸润程度；15mg/kg GA+60mg/kg PF与40mg/kg GA+160mg/kg PF两个剂量组合，相较于单药组明显改善了小鼠肝内炎症情况。
结合各剂量组合的血生化检测及肝组织切片评分情况，当GA、PF在1:4固定比例下，25mg/kg GA+100mg/kg PF是二者较为合适的剂量组合。
实施例3GA、PF在最优配伍比例及剂量下，对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用
3.1实验方案
选取GA：PF＝1：4、25mg/kg GA+100mg/kg PF的比例及剂量配伍组合，利用0.05ml/kg CCl4诱导24h构建的小鼠急性肝损伤模型，探究两者配伍对CCl4诱导的肝损伤的保护作用。
实验分组情况如下：空白对照组(NC)、CCl4模型组、25mg/kg GA给药组、100mg/kgPF给药组、25mg/kg GA+100mg/kg PF给药组，每组6只。0.5％CMC-Na配制相应浓度的GA、PF溶液，CCl4采取灌胃给药方式，GA、PF单药组及GA与PF组合用药组药物均采用腹腔注射的给药方式。
各给药组小鼠腹腔注射相应药物5天，空白对照组及CCl4模型组小鼠腹腔注射0.5％CMC-Na溶液5天，第4天时，空白对照组小鼠灌胃橄榄油溶液，同时CCl4模型组小鼠及各给药组小鼠灌胃0.05mg/kg CCl4，构建小鼠急性肝损伤模型。24h后，即给药处理的第5天，解剖小鼠。收集血浆及肝脏样本，检测血浆ALT、AST、TBIL等指标。
3.2实验结果
对各组小鼠血浆酶ALT、AST、ALP、TBIL等指标的检测发现：0.05ml/kg CCl4经口灌胃24h后，小鼠血浆ALT、AST水平显著升高，说明CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型构建成功。
GA或PF单独给药时，对CCl4引起的小鼠血浆酶升高无明显的下降作用，二者单独使用对CCl4诱导的肝损伤无明显保护作用。
而GA与PF联合给药时，相比于模型组，可显著降低小鼠血浆酶ALT、AST水平(图3.1)，表现出明显的肝保护效果。
综合以上结果，我们得出结论：25mg/kg GA与100mg/kg PF联合用药时，对CCl4对诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，表现出明显的保肝药效，而GA、PF单独给药组未表现出保肝降酶的药理活性。
4.GA、PF在最优配伍比例及剂量下，对CCl4诱导小鼠慢性肝纤维化的治疗作用
4.1实验方案
选取GA：PF＝1：4、25mg/kg GA+100mg/kg PF的比例及剂量配伍，CCl4选取10％、4μL/g，即0.4ml/kg的剂量，采用一周腹腔注射3次CCl4油溶液，共计8周的造模时间，构建小鼠肝纤维化模型，探究GA、PF配伍对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的保护及治疗作用。
小鼠分组情况如下：空白对照组(NC)、CCl4-8week模型组、25mg/kg GA给药组、100mg/kg PF给药组、25mg/kg GA+100mg/kg PF给药组，每组8只。0.5％CMC-Na配制相应浓度的GA、PF溶液，CCl4油溶液、GA、PF单药组及GA与PF组合用药组药物均采用腹腔注射的给药方式。
给药方案如图4.1所示。除空白对照组外，各组小鼠腹腔注射10％CCl4油溶液(4μL/g)8周，每周3次，构建小鼠肝纤维化模型，同时空白对照组小鼠腹腔注射橄榄油(4μL/g)8周，每周3次。第5周开始，各组小鼠除继续腹腔注射10％CCl4油溶液或橄榄油溶媒外，同时腹腔注射相应的溶媒(0.5％CMC-Na溶液)或药物(GA、PF或GA+PF)，共给药4周。整个实验过程共计8周。
末次CCl4处理48h后进行解剖，收集血浆及肝脏样本，检测血浆ALT、AST、TBIL等指标，制作肝脏组织切片后进行H&E染色、Masson染色并评价相关指标，检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)在mRNA、蛋白水平的表达变化。
4.2实验结果
对小鼠血浆样本血浆酶的检测结果可看出，10％CCl4腹腔注射小鼠8周后，小鼠血浆ALT、AST水平显著升高，GA与PF联合给药后，相比于模型组及GA或PF单独给药组，均可显著降低小鼠血浆酶ALT、AST水平(图4.2A-B)。
肝脏发生纤维化后，肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)由静息状态被激活，激活后的HSC转变为以分泌α-SMA和胶原等胞外基质为主的肌成纤维细胞表型，参与肝纤维化进程，因此，检测α-SMA的表达变化，是衡量肝脏纤维化程度的重要指标。我们分别提取各组小鼠肝脏组织的总RNA和总蛋白,通过qPCR和Western blot技术，在mRNA水平和蛋白水平分别检测α-SMA的表达变化。
结果发现，在模型组小鼠中，α-SMA的表达在mRNA水平及蛋白水平均显著增高(图4.2C-D)；给药处理后，对比单独用药组和联合用药组发现，25mg/kg GA、100mg/kg PF分别单独给药干预后，未能显著降低α-SMA的表达，而25mg/kg GA与100mg/kg PF联合用药时，可在mRNA水平及蛋白水平显著降低α-SMA的表达(图4.2C-D)，表明二者组合用药可缓解肝脏的纤维化程度，起到抗肝纤维化的效果。
各组小鼠经解剖后，选取解剖后固定的小鼠肝脏组织制作组织切片，H&E染色及Masson染色后进行常规镜下观察，并由专业的病理学专家为各组小鼠肝脏纤维化程度、炎症程度进行打分。
切片Masson染色镜下观察后，并对小鼠肝脏纤维化程度进行评价打分，结果发现(图4.3A第二行，图4.3B，表4.1)，CCl4处理小鼠8周后，模型组小鼠肝脏汇管区、中央静脉区周围纤维束形成明显增加(图中蓝染部分)，小鼠肝脏纤维化程度严重；25mg/kg GA单独用药未能减少肝脏纤维化程度；有趣的是，不同于mRNA水平及蛋白水平的检测，100mg/kg PF用药组小鼠肝脏切片的Masson染色结果表现出肝脏纤维化程度的轻微降低；而当25mg/kgGA联合100mg/kg PF组合给药干预后，可显著减少小鼠肝脏纤维束的形成，降低小鼠肝脏纤维化程度，这与前期结果相一致。
H&E染色后，经过对全片镜下观察及评估，发现CCl4处理小鼠8周后，模型组小鼠肝脏中吞噬色素的巨噬细胞明显增加，意味着小鼠肝脏细胞损伤严重，免疫反应被激活；25mg/kg GA单独用药组未见明显改善；100mg/kg PF单独用药组小鼠肝组织中吞噬色素的巨噬细胞的增加有轻微降低，表明小鼠肝细胞损伤情况有轻微改善；GA与PF组合用药后，可观察到小鼠肝组织中吞噬色素的巨噬细胞明显减少，肝脏损伤及炎症程度得到显著改善(图4.3A第一行，表4.1)。
综合Masson染色及H&E染色结果，对各组小鼠肝脏慢性炎症反应程度进行评价。结果发现，CCl4处理小鼠8周后，小鼠肝内慢性炎症反应明显增加，100mg/kg PF单独用药可轻微改善肝内炎性水平，而25mg/kg GA单独用药组未见明显改善；GA与PF联合用药后，可显著降低小鼠肝内慢性炎症水平(图4.3A,C，表4.1)。
综合以上结果，我们得出结论：25mg/kg GA与100mg/kg PF联合用药时，显著降低小鼠血浆肝酶ALT、AST水平，因CCl4长期刺激所导致的肝脏纤维化得到明显改善，具体表现为α-SMA在mRNA及蛋白水平的表达显著降低，肝脏汇管区、中央静脉区周围纤维束的形成明显减少，小鼠肝内慢性炎症水平也得以改善。
GA与PF组合用药，对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有明显的治疗作用，二者联合表现出明显的抗肝纤维化效果，而GA或PF单独用药未见明显抗肝纤维化药效。
表4.1小鼠肝组织病理学诊断结果
注：NVL：未见异常；+：轻微；++：轻度；+++：中度；++++：重度
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
1.一种甘草次酸和芍药苷的组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于制备治疗肝脏疾病的药物组合物；所述的肝脏疾病选自下组：急性肝损伤、慢性肝损伤、肝纤维化；所述药物组合物包含甘草次酸和芍药苷，其中所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:1~1:10。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为1:2～1:10。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，所述甘草次酸和芍药苷的配伍重量比为2:4~3:19。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，所述甘草次酸包括：α型甘草次酸，β型甘草次酸。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，所述甘草次酸为18β-甘草次酸（GA）。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为选自下组的形式：口服制剂、注射制剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述制剂选自下组：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、或滴丸。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述制剂为含片。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物给药方式为注射给药。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物给药方式为腹腔注射给药。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物用于一种或多种选自下组的用途：制备治疗和/或缓解急性肝损伤的药物。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甘草次酸给药剂量为5mg/kg~50mg/kg样本重。
13.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述芍药苷给药剂量为20mg/kg~250mg/kg样本重。
14.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗肝脏疾病指选自下组的指标被降低或改善：ALT、AST、ALP、TBIL，或其组合。
15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗指选自下组的指标被降低或改善：α-SMA的表达水平降低、肝脏汇管区和中央静脉区周围纤维束的形成减少、慢性炎症水平改善，或其组合。
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