CN114264712A

CN114264712A - 基于石墨烯场效应晶体管的miRNA检测方法及应用

Info

Publication number: CN114264712A
Application number: CN202111602670.7A
Authority: CN
Inventors: 符汪洋; 王乾龙; 经求是; 秦怡; 张晓艳
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114264712B

Abstract

本发明公开了一种基于石墨烯场效应晶体管(GFET)的miRNA检测方法及其应用,本发明将GFET表面利用共价键修饰上的DNA探针，可特异性识别待测miRNA，随后在DSN酶的作用下，将DNA探针水解并释放出miRNA，释放出的miRNA可参与到下一个循环，依次持续水解GFET表面上DNA，进而引起GFET电信号的变化，该信号强度的变化与miRNA的浓度相关。该发明首次将DSN与GFET结合，并充分利用了DSN在miRNA检测中的高特异性和信号放大功能，以及GFET在生物检测中的超敏和快速特点，可实现生物样品中miRNA的高特异性，快速、超敏的检测。

Description

基于石墨烯场效应晶体管的miRNA检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地，本申请提供了一种基于石墨烯场效应晶体管的miRNA检测方法及其应用。

背景技术

miRNA是一类长度只有18-25个核苷酸的单链小分子RNA，其主要是由染色体DNA的非编码区域编码转录而来。大多数疾病的发生发展过程中，miRNA表达水平的变化与疾病的诊断、分期、治疗及预后判断等有着密切的联系。因此，miRNA被认为是一类极具应用前景的新型疾病相关生物标志物，有望在疾病的预防、诊断、治疗及预后判断等方面发挥重要的作用。目前，较为传统的miRNA检测方法，主要为Northern blotting及微阵列分析。Northernblotting被认为是miRNA检测的金标准方法，然而由于其比较耗时、样品消耗大且灵敏度不高使得其未得到广泛的应用。miRNA微阵列技术具有高通量分析的能力，但同时受制于灵敏度低、反应时间长等缺点，也未得到大面积的推广。

场效应晶体管(FET)生物传感器是近年来最具潜力的生物传感器之一，因为它在检测样本时具有免标记，超灵敏和快速等特点。石墨烯是一种二维的纳米材料，它具有很多优良的性能，比如其比表面积大，导电性能好、电子迁移率高、生物兼容性强以及表面易于功能化等，使基于石墨烯的场效应晶体管(GFET)成为生物传感器的最佳选择。双链特异性核酸酶(DSN)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链，而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶，且具有容易修饰，催化效率高，化学稳定性好等优点，在miRNA的检测中应用广泛。

发明内容

本申请充分利用GFET和DSN酶的优势，建立了一种超敏、特异性强、并能快速测定miRNA的生物传感器，并将其应用于miRNA检测。

本发明的目的是提供一种基于石墨烯场效应晶体管的miRNA检测方法及其应用。本发明中用到的生物传感器GFET其表面有利用共价键修饰上的DNA探针，可特异性识别待测miRNA，随后在DSN酶的作用下，将DNA探针水解并释放出miRNA，释放出的miRNA可参与到下一个循环，依次持续水解GFET表面上DNA，进而引起GFET电信号的变化，实现miRNA超敏、快速、高特异性的放大检测(原理如图1所示)。

一方面，本申请提供了一种功能化的GFET，其特征在于，所述功能化的GFET包括衬底、功能化的单层石墨烯、源/漏极及反应池；所述功能化的GFET上共价修饰有DNA探针。

进一步地，所述功能化的GFET中单层石墨烯平铺在衬底表面，源/漏极镀在石墨烯表面。

进一步地，所述衬底为Si/SiO₂。

进一步地，所述功能化的GFET通过以下方法功能化：依次向反应池中加入PBASE、DNA探针、乙醇胺和吐温20。

进一步地，所述DNA探针在DNA一端依次连有氨基、linker和可与目标miRNA完全碱基互补配对的序列，其中linker为含有不定数量的亚甲基和腺嘌呤或者胸腺嘧啶。

进一步地，所述功能化的GFET通过以下方法功能化：向封装池内加入1mM PBASE的乙醇溶液于室温静置2h并洗涤；加入2μM DNA探针溶液于室温静置18h并洗涤；加入5mM乙醇胺溶液于室温静置2h并洗涤；加入0.05％吐温-20溶液于室温静置0.5h并洗涤。

另一方面，本申请提供了使用上述功能化的GFET检测miRNA的方法，其特征在于，其包括将功能化的GFET与DNS酶结合进行检测。

进一步地，所述方法包括配制包括目标miRNA、DSN、RNase抑制剂、DSN buffer的反应溶液；将其加入GFET的反应池内，与锁相或者半导体分析仪的连接，反应，实时观察电信号的变化。

进一步地，所述方法包括配制总体积为20-300μL的反应溶液，其中反应体系内含有包括目标miRNA、0.1-0.5U DSN、10-40U RNase抑制剂、0.1-1x DSN buffer。随后将其加入GFET的反应池内，与锁相或者半导体分析仪的连接，于37-60℃条件下反应15-150min，实时观察电信号的变化。

进一步地，测定时采用液态栅压，参比电极为Ag/AgCl电极或者pt电极。

本申请中GFET和场效应晶体管可以交换使用；PBASE和1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯可以交换使用；DSN和双链特异性核酸酶可以交换使用。

本申请中的衬底可选各种已知或研究中的绝缘材料，包括但不限于Si/SiO₂。

本申请的方法可用于检测人体或动物体样本病原体等的诊断用途；也可以用于检测环境、食品样本等中病原体；检测非病原体的其他核酸等的非诊断用途。

附图说明

图1：基于GFET和DSN放大检测miRNA的传感原理图；

图2：石墨烯场效应晶体管表面功能化流程图；

图3：GFET传感器特异性的考察；

图4：肺癌患者全血中miR-21含量测定。

具体实施方式

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：GFET器件的制备及miRNA检测

将铜基单层石墨烯切割成约2mm宽，8mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡12h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为1mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，室温静置使其凝固。将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃片，并将其放置于0.5M过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，利用铜线引出源漏极。向封装池内加入1mM PBASE的乙醇溶液于室温静置2h并洗涤；加入2μM DNA探针溶液于室温静置18h并洗涤；加入5mM乙醇胺溶液于室温静置2h并洗涤；加入0.05％吐温-20溶液于室温静置0.5h并洗涤，完成GFET的功能化。

GFET与DSN结合检测miRNA的工作曲线

配制总体积为30μL的反应溶液，其中反应体系分别内含有包括目标miRNA(0.1fM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)、0.2U DSN、20U RNase抑制剂、1x DSNbuffer。随后将其加入GFET的反应池内，利用恒流法与锁相连接，于45℃条件下反应60min，实时观察电信号的变化。每种浓度测定三次，并绘制该生物传感器对miRNA检测的工作曲线。

实施例2：GFET器件的制备与特异性考察

将铜基单层石墨烯切割成约1mm宽，5mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡8h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为0.5mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，室温静置使其凝固。将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃片，并将其放置于0.25M过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，利用铜线引出源漏极。向封装池内加入2mM PBASE的乙醇溶液于室温静置1h并洗涤；加入5μM DNA探针溶液于室温静置24h并洗涤；加入10mM乙醇胺溶液于室温静置1h并洗涤；加入0.1％吐温-20溶液于室温静置1h并洗涤，完成GFET的功能化。

配制总体积为50μL的反应溶液，其中反应体系分别内含有包括10pM目标miR-21/MisM-1/MisM-2/MisM-3/miR-141(核酸序列如表1所示)、0.3U DSN、40U RNase抑制剂、0.2xDSN buffer。随后将其加入GFET的反应池内，利用恒流法与锁相连接，于40℃条件下反应50min，实时观察电信号的变化。每种miRNA测定三次，考察该传感器对miR-21的特异性。如图3所示，该方法对miR-21有较好的特异性。

表1本发明中涉及到的核酸序列

实施例3：GFET与DSN结合检测肺癌患者全血内miR-21

将铜基单层石墨烯切割成约3mm宽，9mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡20h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为1mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，室温静置使其凝固。将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃片，并将其放置于0.25M过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，利用铜线引出源漏极。向封装池内加入3mM PBASE的乙醇溶液于室温静置2h并洗涤；加入10μM DNA探针溶液于室温静置18h并洗涤；加入4mM乙醇胺溶液于室温静置1h并洗涤；加入0.5％吐温-20溶液于室温静置2h并洗涤，完成GFET的功能化。

首先利用Trizol试剂盒提取全血内的总RNA。然后配制总体积为100μL的反应溶液，其中反应体系分别内含有包括5μL样品、0.2U DSN、20U RNase抑制剂、0.1x DSNbuffer。随后将其加入GFET的反应池内，利用恒流法与锁相连接，于45℃条件下反应70min，实时观察电信号的变化，依据工作曲线可得出肺癌患者全血内miR-21的含量。其测试结果如图4所示，相对于健康者，肺癌患者全血内miR-21的含量有明显升高。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 基于石墨烯场效应晶体管的miRNA检测方法及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<400> 2

uagcguauca gacugauguu ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<400> 3

uagcuuacca gacugacguu ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<400> 4

uaucuuguca gacuaauguu ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<400> 5

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<400> 6

ttttttcaac atcagtctga taagcta 27

Claims

1.一种功能化的GFET，其特征在于，所述功能化的GFET包括衬底、功能化的单层石墨烯、源/漏极及反应池；所述功能化的GFET上共价修饰有DNA探针。

2.根据权利要求1所述的功能化的GFET，其中所述功能化的GFET中单层石墨烯平铺在衬底表面，源/漏极镀在石墨烯表面。

3.根据权利要求1所述的功能化的GFET，其中所述衬底为Si/SiO₂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的功能化的GFET，其中所述功能化的GFET通过以下方法功能化：依次向反应池中加入PBASE、DNA探针、乙醇胺和吐温20。

5.根据权利要求4所述的功能化的GFET，其中所述DNA探针在DNA一端依次连有氨基、linker和可与目标miRNA完全碱基互补配对的序列，其中linker为含有不定数量的亚甲基和腺嘌呤或者胸腺嘧啶。

6.根据权利要求4所述的功能化的GFET，其中，所述功能化的GFET通过以下方法功能化：向封装池内加入1mM PBASE的乙醇溶液于室温静置2h并洗涤；加入2μM DNA探针溶液于室温静置18h并洗涤；加入5mM乙醇胺溶液于室温静置2h并洗涤；加入0.05％吐温-20溶液于室温静置0.5h并洗涤。

7.使用根据权利要求1-6任一项所述的功能化的GFET检测miRNA的方法，其特征在于，其包括将功能化的GFET与DNS酶结合进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法包括配制包括目标miRNA、DSN、RNase抑制剂、DSN buffer的反应溶液；将其加入GFET的反应池内，与锁相或者半导体分析仪的连接，反应，实时观察电信号的变化。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括配制总体积为20-300μL的反应溶液，其中反应体系内含有包括目标miRNA、0.1-0.5U DSN、10-40U RNase抑制剂、0.1-1x DSNbuffer。随后将其加入GFET的反应池内，与锁相或者半导体分析仪的连接，于37-60℃条件下反应15-150min，实时观察电信号的变化。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其中测定时采用液态栅压，参比电极为Ag/AgCl电极或者pt电极。