CN114262391B - 一种tempo修饰透明质酸及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种TEMPO修饰透明质酸及其制备方法和应用，其结构如下所示，透明质酸进行羟基活化后与4‑氨基‑TEMPO反应后得到TEMPO修饰透明质酸。本发明中将TEMPO分子接到上述高分子量的透明质酸上，可赋予透明质酸捕获自由基的能力，增强透明质酸的皮肤保护作用的同时大大降低TEMPO的副作用，并采用羟基活化过程使整个修饰过程无需添加毒性较大助剂，提高产品的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种TEMPO修饰透明质酸及其制备方法和应用。
背景技术
在正常情况下体内自由基(主要为活性氧自由基)作为人体内的信号分子，具有一定的功能，如免疫和信号传导功能。但在某些刺激、损伤、疾病等情况下，人体会产生过多自由基，特别是活性氧自由基。自由基具有非常活泼的未成对单电子，可与众多底物反应，在体内与蛋白、DNA等反应就会起破坏作用，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病，如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。而在受到辐射、污染物及药物作用下皮肤内产生的自由基可与胶原蛋白、皮肤细胞等反应，导致皮肤失去弹性而老化、产生皱纹和肤色暗沉等(中国美容医学2009,18(5)),707)。众多研究表明，清除多余自由基有利于疾病的预防和治疗。因此，开发和利用高效无毒的自由基清除剂，具有重要的意义。
2,2,6,6-四甲基派啶氧化物(TEMPO)本身是稳定的自由基，它不容易与其它物质反应，但可与自由基反应生成稳定的物质，因此是一类高效的自由基捕捉剂(高等学校化学学报2018,39(9),1961；中国药学杂志2007,42,1380)。但是，TEMPO小分子具有一定的毒性和刺激性，不能直接应用。它也具有很强的皮肤穿透性，不能直接用作化妆品中的皮肤调理剂。
透明质酸具有优良的水溶性、良好的生物相容性和生物降解性，已作为健康安全的材料广泛应用于体内和生活中。高分子量的透明质酸作为奢侈级的化妆品保湿剂，能够吸收自身重量1000倍的水，并能够在皮肤表面形成一层透气的薄膜，阻隔外界紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害(中国化妆品2017,Z1,51)。然而，化妆品用高分子透明质酸需要具备较高的生物安全性，传统的高分子透明质酸功能化修饰方法均需要在反应过程需要添加多种毒性较大的助剂(如羧基活化剂二环己基碳二亚胺)，后续提纯困难，残留的毒性助剂会带来材料实际应用上的风险，批量生产工艺复杂，成本高，如CN 109880125 A中公开的透明质酸凝胶。因此，急需一种安全简单的高分子透明质酸修饰方法，用于批量生产功能改性的高分子透明质酸。
发明内容
本发明旨在针对现有技术中TEMPO小分子存在毒性和刺激性，将其修饰在透明质酸上，降低其作为保湿剂、化妆品等的毒性和刺激性；同时克服了常规透明质酸修饰方法中使用毒性较大助剂的问题，TEMPO修饰透明质酸过程中所使用的助剂、副产物均为化妆品批准使用的助剂、安全性高，甚至修饰过程可在水中完成。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一方面，本发明提供一种TEMPO修饰透明质酸，结构如下所示：
其中x表示透明质酸中TEMPO修饰部分的占比，x为0.01-0.2；，例如x＝0.01，0.05，0.1，0.15，0.2；n表示透明质酸的链节数，由透明质酸分子量决定，本发明中用到的透明质酸分子量为100万-500万，n范围为2500-12500。
另一方面，本发明提供所述的TEMPO修饰透明质酸的制备方法，包括步骤：
步骤1，采用羟基活化试剂对透明质酸进行羟基活化；
步骤2，向活化后的透明质酸中加入4-氨基-TEMPO，反应后得到所述TEMPO修饰透明质酸。
本发明中采用TEMPO修饰在透明质酸上，这样大分子难以进入细胞或渗透穿过，能够有效的解决TEMPO作为小分子存在的毒性和刺激性问题，大大降低其副作用，产品具有高效的自由基捕捉性能，用于皮肤中可消除自由基，保护皮肤，可安全应用到化妆品等领域；基于现有技术中透明质酸的修饰过程，多需要添加毒性较大的助剂(如羧基活化剂二环己基碳二亚胺)，后续提纯困难，因此本发明中先对透明质酸进行羟基活化，生成可被氨基取代的碳酸酯键，进而与4-氨基-TEMPO反应得到目标透明质酸修饰产物。其反应过程如下图。
该方法与传统的羧基活化修饰方法相比，其独特的优势体现在：1.TEMPO修饰透明质酸过程中避免了毒性较大的羧基活化剂；2.反应副产物(苯氧乙醇、乙酸)及原料在水中的降解产物(苯氧乙醇)均被收录于《2015版允许使用的化妆品原料目录》，大大降低了产品的使用风险。
所述羟基活化试剂包括醋酸钠和氯甲酸苄酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸乙酯中至少一种。
进一步地，所述羟基活化试剂中氯甲酸苄酯或氯甲酸异丙酯或氯甲酸乙酯与醋酸钠的摩尔比为1-5：1。活化试剂中的醋酸钠为缚酸剂，其添加量需大于等于氯甲酸苄酯或氯甲酸异丙酯或氯甲酸乙酯的用量。
步骤1中，羟基活化过程具体包括：向含透明质酸的溶液中加入醋酸钠，随后加入氯甲酸苄酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸乙酯中至少一种，室温或加热搅拌下反应。
步骤1中，羟基活化过程反应温度为5-60℃，反应时间为2-48h反应温度升高，反应时间大大缩短。当反应溶剂为DMSO，可加热至50℃，反应时间可缩短至2h。当反应温度为40-60℃下，反应时间为2-10h；如反应在室温下进行，如5-35℃，则反应时间需12-48h。
进一步地，羟基活化试剂中氯甲酸苄酯或氯甲酸异丙酯或氯甲酸乙酯用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-20％。羟基活化试剂的用量决定了后期TEMPO的修饰比例，当透明质酸的TEMPO修饰比例过高时，产品的生物相容性有所下降，且过高的自由基比例不利于产品的保存，将极大程度的提升产品储存成本。羟基活化试剂用量增加，则透明质酸中被活化的羟基数目变多，后续可以有更多的TEMPO可以被修饰到透明质酸上。
更进一步地，羟基活化试剂用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-15％。确保产品具有更优的相容性和稳定性。
步骤2中，4-氨基-TEMPO的用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-20％；反应温度为室温，反应时间为2-12h。该反应活性较强，短时间内即可完成，优选反应时间为1-6h，但进一步延长反应时间可提高反应程度。
优选地，步骤2反应后通过无机酸或无机碱将反应溶液pH值调节为7.5-8.5。
优选地，4-氨基-TEMPO的用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-15％，如2％、3％、5％、8％、10％、12％。
优选地，所述透明质酸的分子量为100-500万。透明质酸的分子量越大，修饰过程反应越困难，但分子量越大，产品使用时成膜性越强，其能在皮肤表面形成保护膜而非被皮肤吸收。
步骤1和/或步骤2的反应试剂包括水、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、四氢呋喃(THF)其中的一种。
优选地，步骤1和/或步骤2的反应试剂为水。在本发明中，TEMPO修饰透明质酸的整个过程可在无毒无害的水中进行，其中所有原料和产物均溶于水，这样可最大程度的降低反应过程引入的有机溶剂带来的不安全性，减少后续反应的处理过程。
当步骤1和/或步骤2的反应试剂为除水以外的试剂时，反应结束后可采用透析、沉淀、干燥等操作对产品进行纯化，去除反应试剂，提高产品安全性。
本发明提供的TEMPO修饰透明质酸可在化妆品领域中的应用，产品保湿效果和自由基捕捉性能优异。具体地，TEMPO修饰透明质酸在化妆品中添加质量为0.05-1％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中将TEMPO分子接到上述高分子量的透明质酸上，可赋予透明质酸捕获自由基的能力，增强透明质酸的皮肤保护作用的同时大大降低TEMPO的副作用，并采用羟基活化过程使整个修饰过程无需添加毒性较大助剂，提高产品的安全性。
(2)本发明的修饰方法中无论是原料、副产物均为化妆品批准使用的助剂、安全性高，后续过程甚至无需任何处理，方法简单，易于大量生产。
附图说明
图1为应用例1中Tempo-HA2和HA的顺磁共振谱图。
图2为应用例2中不同测试浓度下Tempo-HA2和HA的细胞毒性。
图3为应用例2中不同测试浓度下Tempo-HA1、3-5的细胞毒性。
图4为应用例2中不同测试浓度下Tempo的细胞毒性。
图5为应用例4中人表皮细胞加入Tempo-HA1-5和HA后对经紫外线辐照后的增值活力差异。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
实施例1
步骤1，将3.79g透明质酸(分子量100万)溶于50mL水中，加入42mg乙酸钠，剧烈搅拌下加入86mg氯甲酸苄酯，室温下反应24h，得到羟基活化的透明质酸；
步骤2，将活化后的透明质酸溶于50mL水中，加入86mg 4-氨基-TEMPO充分搅拌并置于室温下反应24h冻干即得到以氨基甲酸酯键为链接键、TEMPO修饰比例为5％的透明质酸Tempo-HA1，产物收率为91％。
实施例2
步骤1，将3.79g透明质酸(分子量100万)溶于50mL水中，加入84mg乙酸钠，剧烈搅拌下加入172mg氯甲酸苄酯，室温下反应24h，得到羟基活化的透明质酸；
步骤2，将活化后的透明质酸溶于50mL水中，加入172mg 4-氨基-TEMPO充分搅拌并置于室温下反应24h冻干即得到以氨基甲酸酯键为链接键、TEMPO修饰比例为10％的透明质酸Tempo-HA2，产物收率为92％。
实施例3
步骤1，将3.79g透明质酸(分子量100万)溶于50mL水中，加入168mg乙酸钠，剧烈搅拌下加入345mg氯甲酸苄酯，室温下反应24h，得到羟基活化的透明质酸；
步骤2，将活化后的透明质酸溶于50mL水中，加入345mg 4-氨基-TEMPO充分搅拌并置于室温下反应24h冻干即得到以氨基甲酸酯键为链接键、TEMPO修饰比例为20％的透明质酸Tempo-HA3，产物收率为90％。
实施例4-5
制备过程如实施例1所述，其中氯甲酸苄酯分别替换为氯甲酸异丙酯和氯甲酸乙酯，得到TEMPO修饰比例为5％的透明质酸Tempo-HA4和Tempo-HA5，产物收率分别为82、91％。
应用例1
以实施例2制备的透明质酸进行电子顺磁共振(EPR)实验，并以无修饰的透明质酸为对照组，检测两种样品中自由基含量，结果如图1。
具体实施方法为将TEMPO修饰比例为10％的透明质酸(Tempo-HA2，0.2g)以及透明质酸(HA，0.2g)装于顺磁石英管中(外径5mm，内径4mm)进行室温下的顺磁共振扫描。
从图1可以看出透明质酸修饰后有明显的自由基顺磁吸收峰，表明透明质酸被成功修饰。其他实施例均具有相同的顺磁吸收峰。
应用例2
选取实施例1-5的TEMPO修饰的透明质酸(Tempo-HA1-5)进行人表皮细胞毒性实验测试，并以无修饰透明质酸和TEMPO为对照实验，具体实施方法为取对数生长周期的细胞接种于96孔板中，5000细胞每孔，在37℃和5％CO2培养相中培养24h，之后加入浓度为10-5000μg/mL待测样品，继续培养48h，加入MTT试剂，进行吸光度检测，计算细胞存活率。
结果如图2-4，可以看出在不同修饰的透明质酸和不同的测试浓度下，所有情况下细胞存活率均大于80％，TEMPO修饰的透明质酸的毒性与无任何修饰的透明质酸的细胞毒性基本相当，仅具有很低的细胞毒性，而图4中单独的TEMPO，在浓度1000μg/mL时，其细胞存活率就低于80％，说明TEMPO与透明质酸的结合能够充分的降低TEMPO的毒性。
应用例3
选取应用实施例1-5的TEMPO修饰的透明质酸(Tempo-HA1-5)进行体外自由基DPPH·清除实验，并以透明质酸(HA)为对照，并分别计算自由基清除半抑制浓度IC50，结果如表1所示。结果显示TEMPO修饰的透明质酸清除自由基DPPH·的能力明显优于透明质酸。
表1
应用例4
选取实施例1-5的TEMPO修饰的透明质酸(Tempo-HA1-5)对经紫外线辐照的人表皮细胞增值活力的影响，并以透明质酸为对照，采用对数生长的Hacat细胞，在加入透明质酸和TEMPO修饰的透明质酸(Tempo-HA1-5)后，用60mJ/cm2的UVB照射，然后继续培养48h，用MTT检验细胞活性。结果如图5。结果显示TEMPO修饰的透明质酸细胞存活率明显优于透明质酸，表明该材料会减小紫外线的伤害。
应用例5
将实施例2的TEMPO修饰的透明质酸添加入甘油及水的混合溶液中，制备得到组合物1，并在甘油及水的混合溶液中加入同等质量的透明质酸，制备得到组合物2，组合物成分如表2。选取40人，每日早晚涂抹1低组合物于虎口，使用14天后对使用情况进行主观测评。结果使用组合物1的受试者感到保湿效果较好，6人反映虎口细纹变淡，无人反映刺激感；使用组合物2的受试者感到保湿效果好，2人反应虎口细纹变淡，无人反映刺激感。
表2
Claims (6)
1.一种TEMPO修饰透明质酸的制备方法，其特征在于，包括步骤：
步骤1，采用羟基活化试剂对透明质酸进行羟基活化；
步骤2，向活化后的透明质酸中加入4-氨基-TEMPO，反应后得到所述TEMPO修饰透明质酸；
所述羟基活化试剂包括醋酸钠和氯甲酸苄酯的混合物，或醋酸钠和氯甲酸异丙酯的混合物，其中氯甲酸苄酯或氯甲酸异丙酯与醋酸钠的摩尔比为1-5：1；
羟基活化试剂中氯甲酸苄酯或氯甲酸异丙酯用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-5％；
步骤2中，4-氨基-TEMPO的用量为透明质酸羟基摩尔量的1％-5％；
所述TEMPO修饰透明质酸结构如下所示：
其中x表示透明质酸中TEMPO修饰部分的占比，x为0.01-0.05；n表示透明质酸的链节数，所述透明质酸的分子量为100-500万。
2.根据权利要求1所述的TEMPO修饰透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤1中，羟基活化过程具体包括：向含透明质酸的溶液中加入醋酸钠，再加入氯甲酸苄酯、氯甲酸异丙酯中至少一种，搅拌反应。
3.根据权利要求1所述的TEMPO修饰透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤1中，羟基活化过程，当反应温度为40-60℃下，反应时间为2-10h；当反应温度为5-35℃，反应时间为12-48h。
4.根据权利要求1所述的TEMPO修饰透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤1和/或步骤2的反应试剂包括水、DMSO、DMF、丙酮、THF中至少一种。
5.根据权利要求1所述的TEMPO修饰透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤1和/或步骤2的反应试剂为水。
6.根据权利要求1所述的制备方法制得的TEMPO修饰透明质酸在化妆品领域中的应用。
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