CN114262326A - 小分子化合物wj644a及其在制备治疗前列腺癌疾病的药物中的应用 - Google Patents
小分子化合物wj644a及其在制备治疗前列腺癌疾病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
小分子化合物WJ644A及其在制备治疗前列腺癌疾病的药物中的。本发明公开了一种如式(I)所示的小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体，及其制备方法，及其在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用。本发明还提供了包括式(I)化合物的小分子未折叠蛋白反应激动剂或药物组合物及其应用。本发明为筛选前列腺癌的新药研发提供了重要参考，具有良好应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药及其制备和应用技术领域，具体涉及小分子化合物WJ644A及其在制备治疗前列腺癌疾病的药物中的应用。
背景技术
前列腺癌是全球最常见的男性泌尿系统恶性肿瘤，其发病率及死亡率长期占据男性癌症前两位。同时，前列腺癌前期症状不明显且潜伏期长，确诊时常进入晚期阶段。雄激素剥夺疗法是目前前列腺癌一线治疗方案，但80％患者会在三年内复发并进展为去势抵抗性前列腺癌。目前，针对去势抵抗性前列腺癌缺乏有效治疗手段，迫切需要针对该阶段前列腺癌进行有效靶点探寻及对应药物开发。
内质网(ER)在细胞的平衡和生存中起着关键的作用，例如调节蛋白质的合成和折叠、参与脂质的生物合成、调节细胞内钙的浓度和碳水化合物的代谢等。蛋白质运送到其最终位置前，都需要在内质网进行折叠、加工。如果细胞突然需要制造大量的新蛋白质，就会使内质网不堪重负，未折叠或者错误折叠的蛋白质将积累起来。细胞通过激活未折叠蛋白反应来增加内质网的折叠能力，以此清除产生的错误折叠或未折叠蛋白。当上述压力持续存在时，未折叠蛋白反应则会导致细胞死亡。最近的研究表明，未折叠蛋白反应与包括前列腺癌在内的多种肿瘤进展及不良预后密切相关，并且未折叠蛋白激动剂可显著克服多种肿瘤的耐药及转移。因此，靶向未折叠反应可作为前列腺癌治疗的潜在策略。
发明内容
本发明创新提出了一类新型的可用于制备治疗前列腺癌疾病的药物的小分子候选药物，并阐明其作用机制，为后续新药研发奠定基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
本发明提出了一种如式(I)所示的小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，所述式(I)WJ644A用于诱导前列腺癌细胞未折叠反应、自噬，并抑制前列腺癌细胞的增殖、生长等。
本发明提出了一种如式(I)所示的小分子化合物WJ644A，其结构式如下：
其中，式(I)所示WJ644A是一种小分子化合物。
其中，
R1为苯基、烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、烷氧基取代的苯基、烷基；
R2为烷基、羟烷基。
优选地，
R1为苯基、C1-10烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、C1-10烷氧基取代的苯基、C1-10烷基；
R2为C1-10烷基、羟C1-10烷基。
进一步优选地，
R1为苯基、甲基取代的苯基、氟取代的苯基、异丙基取代的苯基、甲氧基取代的苯基或正丁基；
R2为正丁基、正戊基、羟丙基、羟乙基、或正辛基。
进一步优选地，
R1为苯基、对甲基苯基、间氟苯基、对氟苯基、对异丙基苯基、对甲氧基苯基或正丁基；
R2为正丁基、正戊基、羟丙基、羟乙基、或正辛基。
进一步优选地，
R1为苯基、对甲基苯基、间氟苯基、对甲氧基苯基、对异丙基苯基；
R2为正丁基、正辛基。
进一步优选地，本发明通式(I)小分子化合物WJ644A，具体化合物有以下：
化合物Ia(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH3)、化合物Ib(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、化合物Ic(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、化合物Ie(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备、化合物If(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)。
本发明还提出了式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A诱导前列腺癌细胞的未折叠蛋白反应；优选地，未折叠蛋白反应的增强通过ATF6转录能力增强以及sXBP1活性增强反映。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A激活前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应相关基因表达；优选地，所述前列腺癌细胞为PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应相关蛋白及其磷酸化蛋白表达；优选地，所述前列腺癌细胞为PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞中IRE1α介导的XBP1的激活；优选地，所述前列腺癌细胞包括PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A显著抑制多株前列腺癌细胞增殖，且对正常细胞毒性较低；优选地，所述前列癌细胞包括DU145、PC3M、PC3、22RV1、LNCAP、VCAP；其中所述正常细胞包括RWPE1、LO2。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞发生空泡化；优选地，所述前列腺癌细胞为PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞中LC3蛋白聚集；优选地，LC3蛋白为自噬相关蛋白；优选地，所述前列腺癌细胞为PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞自噬；优选地，所述前列腺癌细胞包括PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A促进前列腺癌细胞中自噬相关蛋白的表达；优选地，所述前列腺癌细胞为PC3细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A能够在小鼠皮下荷瘤模型中抑制前列腺癌生长；优选地，所述前列腺癌细胞包括PC3、PC3M细胞。
本发明中，所述式(I)小分子化合物WJ644A的水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体等具有与式(I)小分子化合物WJ644A相同的效果。
本发明还提出了式(I)小分子化合物WJ644A在制备在体外促进前列腺癌细胞发生未折叠蛋白反应并诱导前列腺癌细胞发生自噬的药物中的应用及方法。
本发明还提出了式(I)小分子化合物WJ644A在制备在体内抑制前列腺癌细胞生长的药物中的应用及方法。
本发明还提出了一种药物组合物，包括所述式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明还提出了式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体、以及含有式(I)WJ644A的药物组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。其中，所述恶性肿瘤包括实体瘤，其中，所述实体瘤有前列腺癌、胰腺癌等。
在具体实施方案中，在体外，所述化合物WJ644A诱导前列腺癌细胞未折叠蛋白反应及自噬，从而抑制前列腺癌细胞增殖。在体内，所述化合物W J644A可显著抑制前列腺癌的生长。
本发明还提供了一种小分子未折叠蛋白反应活动剂，其包括式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
本发明还公开了式(I)小分子化合物WJ644A的制备方法，包括步骤：(1)原料小檗碱与丙酮在氢氧化钠的作用下生成二氢小檗碱化合物；(2)前述制得的二氢小檗碱化合物与溴代化合物在乙腈溶剂中反应得到13-取代小檗碱衍生物；(3)前述制得的13-取代小檗碱衍生物与胺在乙醇溶剂中反应得到式(I)所示的9-取代氨基-13-烃基双取代小檗碱衍生物；
所述反应路线如下：
其中，R1为苯基、对甲基苯基、间氟苯基、对氟苯基、对异丙基苯基、对甲氧基苯基或正丁基；R2为正丁基、正戊基、羟丙基、羟乙基、或正辛基。
其中，步骤(1)中，所述丙酮与小檗碱的当量比为4～6:1；步骤(2)中，所述二氢小檗碱化合物(式(i)化合物)与溴代化合物的当量比为1:1.2～1.8；步骤(3)中，所述13-取代小檗碱衍生物(式(ii)化合物)与胺的当量比为1:35～45。
其中，步骤(3)中，所述13-取代小檗碱衍生物(式(ii)化合物)与胺的反应中溶剂为无水乙醇。
本发明的有益效果包括：本发明筛选新型小分子未折叠蛋白反应激动剂，在细胞水平上，WJ644A通过激活未折叠蛋白反应，促进前列腺癌细胞自噬性死亡和细胞空泡状死亡，并且对正常细胞毒性低。动物实验表明WJ644A显著抑制前列腺癌的生长。本发明在未折叠蛋白反应激动剂治疗前列腺癌方面取得的新突破，成功填补了国内该领域的空白，具有很大的开发前景。本发明为筛选前列腺癌的新药研发提供了重要参考，具有良好的应用前景。
附图说明
图1所示为靶向未折叠蛋白反应高通量筛选体系建立。
图(1A)表示在ATF6报告基因体系中，随着毒胡萝卜素浓度增加，荧光素酶报告基因的表达逐渐加强；
图(1B)表示在ATF6报告基因体系中，随着衣霉素浓度增加，荧光素酶报告基因的表达逐渐加强；
图(1C)表示在ATF6报告基因体系中，随着式(1)WJ644A浓度增加，荧光表达逐渐加强；
图(1D)表示在XBP1报告基因体系中，随着毒胡萝卜素浓度增加，荧光素酶报告基因的表达逐渐加强；
图(1E)表示在XBP1报告基因体系中，随着衣霉素浓度增加，荧光素酶报告基因的表达逐渐加强；
图(1F)表示在XBP1报告基因体系中，随着式(1)WJ644A浓度增加，荧光素酶报告基因的表达逐渐加强。
图2所示为式(I)WJ644A对前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应相关基因蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响。
图(2A)表示式(I)WJ644A激活前列腺癌细胞PC3中ATF6、EIF2AL3、ATF4、IL8、XBP1、IRE1α、DDIT3基因的表达；
图(2B)表示式(I)WJ644A呈浓度梯度的激活前列腺癌PC3细胞中p-PERK、PERK、GRP78、p-IRE1α、IRE1α蛋白的表达；
图(2C)表示式(I)WJ644A呈时间梯度的激活前列腺癌PC3细胞中p-PERK、PERK、GRP78、p-IRE1α、IRE1α蛋白的表达；
图(2D)表示式(I)WJ644A呈浓度梯度的激活前列腺癌细胞PC3中IRE1α介导的XBP1的切割；
图(2E)表示式(I)WJ644A呈时间梯度的激活前列腺癌细胞PC3中IRE1α介导的XBP1的切割。
图3所示为式(I)WJ644A抑制前列腺癌细胞的增殖，并诱导细胞发生胞质空泡化。
图(3A)表示式(I)WJ644A呈浓度梯度的抑制前列腺癌细胞的增殖，并对正常细胞毒性较低；
图(3B)表示式(I)WJ644A呈时间梯度的诱导前列腺癌细胞PC3的胞质空泡化。
图4所示为式(I)WJ644A诱导前列腺癌细胞发生自噬。
图(4A)表示式(I)WJ644A处理后，导致自噬相关蛋白LC3的聚集；
图(4B)表示式(I)WJ644A处理后，导致PC3细胞发生自噬；
图(4C)表示式(I)WJ644A呈时间梯度地促进前列腺癌细胞PC3中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达；
图(4D)表示式(I)WJ644A呈浓度梯度地促进前列腺癌细胞PC3中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达，同时抑制P62的表达。
图5所示为式(I)WJ644A在体内抑制前列腺癌肿瘤生长。
图(5A)表示在PC3肿瘤移植模型中,小鼠处死后，剥离的皮下肿瘤白光图；
图(5B)表示在PC3肿瘤移植模型中,小鼠给药期间的肿瘤体积统计图；
图(5C)表示在PC3肿瘤移植模型中,小鼠处死后，剥离的皮下肿瘤重量统计图；
图(5D)表示在PC3M肿瘤移植模型中,小鼠处死后，剥离的皮下肿瘤白光图；
图(5E)表示在PC3M肿瘤移植模型中,小鼠给药期间的肿瘤体积统计图；；
图(5F)表示在PC3M肿瘤移植模型中,小鼠处死后，剥离的皮下肿瘤重量统计图；
图(5G)表示在PC3肿瘤移植模型中，给药期间的小鼠体重统计图；
图(5H)表示在PC3M肿瘤移植模型中，给药期间的小鼠体重统计图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1-6：化合物的制备
式(I)小分子化合物WJ644A
实施例1化合物Ia(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH3)、实施例2化合物Ib(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、实施例3化合物Ic(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、实施例4化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、实施例5化合物Ie(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、实施例6化合物If(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备
具体制备方法如下：
(1)实施例1化合物Ia(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将盐酸小檗碱(5.0g，13.5mmol)溶于5N NaOH(23mL)，边搅拌边逐滴加入丙酮(5mL)，滴完后室温搅拌1h，过滤得到的固体用80％甲醇溶液洗涤(10ml×3)，得到黄色固体i 4.15g，产率为83％。
将化合物i(4.0g,10.2mmol)溶于乙睛(50ml)，加入NaI(1.87g,12.5mmol)，对异丙基苄溴(3.25g,15.3mmol)，在80℃温度下回流4h。浓缩后柱层析分离(三氯甲烷/甲醇＝12/1)得黄色化合物ii(R1＝4-iPrC6H5)3.80g，产率为75％。
化合物ii(547mg,1mmol)溶于正戊胺(40mmol)，110℃加热4h，通过LC-MS检测反应结束，冷却反应液后，加入50mL石油醚打浆，得到的红色固体再柱层析分离(CHCl3/MeOH，200/1-100/1v/v)得红色化合物Ia(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH3)240mg,产率37％,mp:204.4-206.3℃；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.80(s,1H),7.70(d,J＝9.1Hz,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),7.22(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝8.1Hz,2H),7.03(s,1H),6.99(s,1H),5.99(s,2H),4.83-4.81(s,2H),4.65(s,2H),3.99(s,3H),3.66(t,J＝7.2Hz,2H),3.18-3.14(m,2H),2.91-2.86(m,1H),1.79-1.65(m,2H),1.45-1.34(m,4H),1.25(s,3H),1.23(s,3H),0.93(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ151.33,149.47,148.92,148.62,147.07,140.22,137.64,137.40,134.84,134.57,131.92,129.30(2C),128.39(2C),123.70,122.01,118.70,117.03,109.97,109.41,103.63,58.61,57.44,51.24,36.93,35.13,32.15,30.33,29.52,24.56(2C),23.70,14.57.HRMS(ESI):calcd for C34H39N2O3[M-Br]+,523.2955；found 523.2961.
(2)实施例2化合物Ib(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将本发明实施例1中原料正戊胺换为正己胺，参照本发明实施例1的实验方法得到化合物Ib，三步反应总产率为29％，红色固体Ib(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH3)mp:215.2-217.3℃；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.81(s,1H),7.70(d,J＝9.1Hz,1H),7.40(d,J＝9.0Hz,1H),7.21(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝7.9Hz,2H),7.03(s,1H),6.99(s,1H),5.98(s,2H),4.83–4.77(m,2H),4.65(s,2H),3.98(s,3H),3.67(t,J＝7.1Hz,2H),3.17(t,J＝8.6Hz,2H),2.94-2.83(m,1H),1.77-1.66(m,2H),1.50-1.39(m,2H),1.37-1.29(m,4H),1.24(s,3H),1.22(s,3H),0.90(t,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CD3OD)δ151.18,149.28,148.79,148.49,146.99,140.11,137.54,137.26,134.73,134.43,131.76,129.22(2C),128.29(2C),123.56,121.90,118.53,116.84,109.86,109.31,103.52,58.51,57.35,51.08,36.84,35.02,32.81,32.33,29.41,27.67,24.47(2C),23.73,14.45.HRMS(ESI):calcd for C35H41N2O3[M-Br]+；537.3112；found 537.3095.
(3)实施例3化合物Ic(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将本发明实施例1中原料正戊胺换为正庚胺，参照本发明实施例1的实验方法得到化合物Ic，三步反应总产率为40％，红色固体Ic(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，mp:228.1-230.4℃.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),7.19(d,J＝7.8Hz,2H),7.07(d,J＝8.9Hz,1H),7.00(d,J＝7.8Hz,2H),6.96(s,1H),6.83(s,1H),6.55(br s,1H),5.99(s,2H),5.10(br s,2H),4.52(s,2H),3.90(s,3H),3.86-3.81(m,2H),3.12-3.09(m,2H),2.93-2.86(m,1H),1.84-1.71(m,2H),1.46-1.35(m,2H),1.35-1.27(m,6H),1.25(s,3H),1.24(s,3H),0.86(t,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ148.51,146.56,146.06,145.49,144.60,138.74,134.38,134.30,132.33,131.87,128.47,126.74(2C),126.34(2C),122.27,119.46,115.22,111.98,107.99,107.39,100.87,55.74,55.69,46.87,35.06,32.63,30.82,30.53,28.12,27.86,25.93,22.91(2C),21.62,13.10.ESI-HRMS(m/z):[M-Br]+calcd.for C36H43N2O3,551.3268；found 551.3264.
(4)实施例4化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将本发明实施例1中原料正戊胺换为正辛胺，参照本发明实施例1的实验方法得到化合物Id，三步反应总产率为40％，红色固体Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，mp:225.3-227.3℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),7.18(d,J＝7.8Hz,2H),7.07(d,J＝8.9Hz,1H),7.00(d,J＝7.8Hz,2H),6.96(s,1H),6.83(s,1H),6.55(br s,1H),5.98(s,2H),5.10(br s,2H),4.52(s,2H),3.90(s,3H),3.86-3.81(m,2H),3.12-3.09(m,2H),2.93-2.86(m,1H),1.85-1.70(m,2H),1.44-1.38(m,2H),1.34-1.27(m,8H),1.25(s,3H),1.23(s,3H),0.85(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ149.56,147.60,147.11,146.54,145.64,139.80,135.42,135.36,133.41,132.91,129.51,127.77(2C),127.37(2C),123.39,120.51,116.29,113.02,109.04,108.42,101.90,56.78,56.74,47.89,36.10,33.66,31.86,31.55,29.44,29.31,28.91,27.01,23.93(2C),22.67,14.13.HRMS(ESI):calcd for C37H45N2O3[M-Br]+,565.3425；found 565.3432.
(5)实施例5化合物Ie(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将本发明实施例1中原料正戊胺换为正壬胺，参照本发明实施例1的实验方法得到化合物Id，三步反应总产率为44％，红色固体Ie(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，mp:220.0-222.2℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),7.42(d,J＝8.9Hz,1H),7.20(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝8.9Hz,1H),7.02(d,J＝7.9Hz,2H),6.98(s,1H),6.85(s,1H),6.55(br s,1H),6.00(s,2H),5.11(br s,2H),4.53(s,2H),3.91(s,3H),3.88-3.82(m,2H),3.14-3.11(m,2H),2.97-2.83(m,1H),1.80-1.75(m,2H),1.45-1.38(m,2H),1.36-1.20(m,16H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ149.63,147.68,147.19,146.60,145.74,139.91,135.51,135.42,133.48,132.99,129.56,127.85(2C),127.46(2C),123.46,120.59,116.36,113.05,109.12,108.50,101.98,56.85,56.81,47.94,36.18,33.75,31.99,31.65,29.70,29.58,29.40,28.99,27.10,24.02(2C),22.78,14.22.HRMS(ESI):calcd for C38H47N2O3[M-Br]+,579.3581；found 579.3595.
(6)实施例6化合物If(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)的制备。
将本发明实施例1中原料正戊胺换为正癸胺，参照本发明实施例1的实验方法得到化合物Id，三步反应总产率为41％，红色固体If(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)mp:217.3-219.4℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.87(s,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),7.19(d,J＝7.9Hz,2H),7.07(d,J＝8.9Hz,1H),7.00(d,J＝7.8Hz,2H),6.96(s,1H),6.83(s,1H),6.54(br s,1H),5.98(s,2H),5.10(br s,2H),4.52(s,2H),3.90(s,3H),3.88-3.83(m,2H),3.14-3.11(m,2H),2.94-2.87(s,1H),1.84-1.71(m,2H),1.47-1.16(m,18H),0.86(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ149.64,147.68,147.19,146.60,145.75,139.93,135.52,135.42,133.49,133.00,129.56,127.86(2C),127.47(2C),123.47,120.60,116.35,113.04,109.13,108.51,101.98,56.82(2C),47.92,36.19,33.76,32.02,31.66,29.76,29.71,29.59,29.44,29.00,27.11,24.03(2C),22.79,14.23.HRMS(ESI):calcd for C39H49N2O3[M-Br]+,593.3738；found 593.3756.
实施例7：WJ644A基于细胞的高通量筛选体系建立。
技术方法
(1)荧光素酶报告基因筛选模型
将多重重复的ATF6反应元件序列，与荧光素酶基因构建融合质粒，同时构建IRE1α/XBP1荧光素酶报告基因质粒。在HEK293T细胞中，共转ATF6荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶质粒，或者共转IRE1α/XBP1荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶质粒，转染后24小时，将毒胡萝卜素(Ca2+-ATPase抑制剂)或者衣霉素按不同浓度梯度加入，处理24小时，检测荧光表达以验证构建体系的正确性和有效性。之后，同等条件转染后，加入本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)处理24小时，检测荧光素酶报告基因的表达情况。
实验结果如图1所示，毒胡萝卜素、衣霉素以及本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)在上述两个荧光素酶报告基因体系中，均可以浓度梯度地激活荧光素酶报告基因地表达。
实施例8：式(I)WJ644A在前列腺癌细胞内激活未折叠蛋白反应以及未折叠蛋白反应相关蛋白的表达。
技术方法
(1)细胞的培养
本实验前列腺癌细胞系DU145、PC3M、PC3、22RV1、LNCAP、VCAP，人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和人正常肝细胞系LO2，均取自美国标准保藏中心，细胞放置在37℃、5％CO2的恒温培养箱中。
DU145在Eagle’s Minimum Essential培养基中培养，PC3在F-12K培养基中培养，22RV1和LNCAP在RPMI-1640培养基中培养，VCAP和LO2在Dulbecco’sModified Eagle’sMedium(DMEM)中培养，RWPE-1在无血清培养基(K-SFM)中培养，加入0.05mg/ml BPE和5ng/ml EGF。所有培养基均含有10％-15％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。
(2)荧光定量PCR
在PC3细胞中，按照浓度梯度加入本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，处理24小时后，使用TRIzol提取细胞中总RNA，并根据cDNA逆转录试剂盒说明，将1000ng的RNA逆转录合成cDNA。使用特异性引物(ATF6、EIF2AK3、ATF4、IL8、XBP1、IRE1α和DDIT3)和β-actin(内参)进行荧光定量PCR。
(3)免疫印迹(Western Blot)
在PC3细胞中，按照浓度梯度加入本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，处理24小时后，使用含1mM的苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解细胞。在定量、煮沸变性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳将裂解物分离，转移到硝化纤维素膜上，BSA封闭后，使用特异性抗体进行一抗过夜孵育。第二天，二抗孵育后用LI-COR Odyssey红外成像系统检测细胞中蛋白表达情况。
实验结果如图2所示，本发明实施例制备的WJ644A激活前列腺癌细胞PC3中未折叠蛋白反应相关基因mRNA水平的表达(图A)。并且，本发明实施例制备的WJ644A可以呈浓度梯度和时间梯度地促进未折叠蛋白反应相关蛋白及其磷酸化蛋白表达(图B)。同时，诱导IRE1α介导的XBP1切割，显著增加活性状态的sXBP1。(图D、E)。
实施例9：式(I)WJ644A显著抑制前列腺癌细胞增殖，并且诱导细胞胞质空泡化。
技术方法
(1)MTS法测定细胞增殖实验
MTS检测通过比色法测定活细胞数量，以确认细胞增殖的方法。MTS可与活细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，被还原成橙黄色甲瓒染料，在490nm处测量的吸光值(甲瓒含量)与活细胞的数量呈正比，从而反映细胞活力情况。运用MTS实验评价化合物WJ644A对前列腺癌细胞增殖的影响，判断其对前列腺癌细胞增殖的抑制率。将前列腺癌细胞或正常细胞接种于96孔板过夜，WJ644A细胞贴壁后，加入WJ644A处理24-96h后取出在显微镜下观察细胞状态，并在避光条件下，加入MTS孵育，用酶标仪490nm处测定读取光吸收值，实验重复三次，IC50用GraphPad5 Prism软件计算得到。
实验结果如图3所示，从图(A)可以看出本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)浓度梯度依赖地显著抑制前列腺癌细胞DU145、PC3M、PC3、22RV1、LNCAP和VCAP细胞的增殖活性，而对人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和人正常肝细胞系LO2毒性较小。并且本发明实施例制备的化合物WJ644A处理后的前列腺癌细胞的胞质内出现特殊的空泡形状，空泡数量随着处理时间延长逐渐增多(图B)。
实施例10：式(I)WJ644A促进前列腺癌细胞的自噬。
技术方法
(1)免疫印迹(Western Blot)
具体技术方法同实施例3(3)。
(2)免疫荧光
使用LipofectamineTM2000转染试剂，在PC3细胞中转染GFP-LC3质粒，并与本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)孵育24小时，随后细胞经4％PFA固定及PBS洗涤。最后使用荧光显微镜获得免疫荧光图像。
实验结果如图4所示，本发明实施例制备的化合物WJ644A显著诱导LC3蛋白发生聚集，表明本发明实施例制备的化合物WJ644A处理显著增强细胞内自噬水平(图A、B)。并且，经本发明实施例制备的化合物WJ644A处理后，LC3二型条带和Beclin-1的表达显著增加，表明本发明实施例制备的化合物WJ644A显著激活前列腺癌细胞发生自噬(图C、D)
实施例11：式(I)WJ644A能抑制前列腺癌肿瘤生长。
技术方法
(1)裸鼠皮下荷瘤实验
实验小鼠为，雄性、6-8周龄的BALB/c裸小鼠，小鼠来自华东师范大学动物中心。所有动物实验方案均经华东师范大学生物医学研究所动物研究委员会批准。用PC3和PC3M细胞建立异种移植瘤模型，PC3细胞注射量为5X106/只，PC3M细胞注射量为2X106/只。当肿瘤生长至100mm3时，将小鼠随机分为两组，对照组和本发明实施例4制备的化合物Id(R1＝4-iPrC6H5，R2＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)组(2毫克/千克)，给药方式是腹腔注射。每3-6天测定肿瘤体积和小鼠体重，按照公式体积＝长×宽2×0.52，计算肿瘤体积，同时测量小鼠重量，观测化合物安全性。连续给药3-4周后处死小鼠，剥离肿瘤，称重并拍照。实验结果如图5所示，在PC3异种移植模型中，本发明实施例制备的化合物WJ644A(2毫克/千克)可以显著抑制胰腺癌肿瘤的生长(图A、B、C)，并且，在更为恶性的PC3M异种移植模型中，本发明实施例制备的化合物WJ644A对肿瘤生长也有明显的抑制作用(图D、E、F)。同时，本发明实施例制备的化合物WJ644A有较好的安全性，连续给药3-4周，对小鼠体重几乎没有影响(图G、H)。
Claims (11)
1.一种小分子化合物WJ644A，其特征在于，其具有如下结构通式(I)：
其中，R1为苯基、烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、烷氧基取代的苯基、烷基；
R2为烷基、羟烷基。
2.如权利要求1所述的小分子化合物WJ644A，其特征在于，
R1为苯基、C1-10烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、C1-10烷氧基取代的苯基、C1-10烷基；R2为C1-10烷基、羟C1-10烷基。
3.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1中所述的式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
4.一种小分子未折叠蛋白反应激动剂，其特征在于，其包含如权利要求1中所述的式(I)小分子化合物WJ644A。
5.如权利要求1所述的式(I)小分子化合物WJ644A或药学上可接受的盐、或如权利要求3所述的药物组合物、或如权利要求4所述的小分子未折叠蛋白反应激动剂在制备治疗恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括血液瘤和实体瘤；其中，所述血液瘤包括白血病、淋巴瘤，所述实体瘤包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于促进前列腺癌细胞的未折叠蛋白反应，促进前列腺癌细胞自噬，抑制前列腺癌的增殖、生长。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述式(I)小分子化合物WJ644A激活未折叠蛋白反应，促进ATF6转录活性；
所述式(I)小分子化合物WJ644A激活未折叠蛋白反应，增强核酸酶IRE1α活性，切割XBP1 mRNA得到有活性的切割型XBP1；
所述式(I)小分子化合物WJ644A刺激前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应相关基因表达；
和/或，所述式(I)WJ644A小分子化合物促进前列腺癌细胞中未折叠蛋白反应相关蛋白及其磷酸化蛋白表达。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述式(I)小分子化合物WJ644A显著抑制多株前列腺癌细胞增殖，并对正常细胞毒性较低。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述式(I)WJ644A小分子化合物显著诱导前列腺癌细胞株发生胞质空泡化；和/或，所述式(I)WJ644A小分子化合物显著诱导前列腺癌细胞株发生自噬。
11.如权利要求1所述的式(I)小分子化合物WJ644A的制备方法，其特征在于，包括步骤：原料小檗碱与丙酮在氢氧化钠的作用下生成二氢小檗碱化合物；前述制得的二氢小檗碱化合物与溴代化合物在乙腈溶剂中反应得到13-取代小檗碱衍生物；前述制得的13-取代小檗碱衍生物与胺在乙醇溶剂中反应得到式(I)所示的9-取代氨基-13-烃基双取代小檗碱衍生物；
所述反应路线如下：
其中，R1为苯基、烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、烷氧基取代的苯基、烷基；R2为烷基、羟烷基。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114751901A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-07-15 | 南京中医药大学 | 9-n-胺烷基-13-烷基（-8,9-环化）小檗碱衍生物及其制备方法和用途 |
| CN114751901B (zh) * | 2022-05-13 | 2023-10-27 | 南京中医药大学 | 9-n-胺烷基-13-烷基（-8,9-环化）小檗碱衍生物及其制备方法和用途 |
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