CN114249784A

CN114249784A - 一种香豆素衍生物化合物ⅲ、提取方法及其用途

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Publication number: CN114249784A
Application number: CN202111341455.6A
Authority: CN
Inventors: 王洪伦; 邓楷; 胡娜
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: CN114249784B

Abstract

本发明公开了一种香豆素衍生物化合物Ⅲ、提取方法及其用途，其中，所述化合物的提取方法包括如下内容：(1)将黑果枸杞用有机溶剂浸泡过夜后进行超声提取，除杂、除醇后富集纯化，用2～6倍柱体积的洗脱剂洗脱；(2)将步骤(1)洗脱得到的物质进行半制备分离，得到组分F‑1；(3)将组分F‑1进行制备分离；(4)收集保留时间为0～5min的组分，利用葡聚糖凝胶柱进行再纯化，通过馏分收集器收集得到衍生物化合物Ⅲ。本发明对黑果枸杞香豆素衍生物化合物的提取方法进行研究，以期为进一步研究黑果枸杞香豆素衍生物化合物的药物作用提供参考，加大了黑果枸杞的利用和研究范围。本工艺简单可行，较好的参考价值。

Description

一种香豆素衍生物化合物Ⅲ、提取方法及其用途

技术领域

本发明涉及化合物的提取方法领域，具体涉及一种香豆素衍生物化合物Ⅲ、提取方法及其用途。

背景技术

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)系茄科(Solanceae)枸杞属(Lycium L.)植物，是西北干旱地区一种特有的多年生灌木野生植物，尤其以柴达木和塔里木盆地分布最广。黑果枸杞耐干旱，生长于盐碱土荒地或沙地，可作为水土保持的灌木植物。其果实味甘、性平，清心热。据《四部医典》中记载，藏医将其用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症；民间用作滋补强壮、明目及降压药。现代药理研究证明，黑果枸杞具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、神经保护等功效。植物成分研究表明，黑果枸杞富含酚类、花青素、多糖、酚酸、胡萝卜素、生物碱、脂肪酸、挥发油等物质。

另外，黑果枸杞中含有的丰富活性物质，仍有许多未被分离、鉴定，若能对黑果枸杞中新的化学成分及其药理作用进行深入、细微的研究与活性机制探讨，则有望开发出更多可治疗疾病且安全有效的天然植物来源药物。

发明内容

本发明提供一种从黑果枸杞中提取得到香豆素衍生物化合物Ⅲ、提取方法及其用途。

香豆素是一类含有苯并芘结构的衍生物，在合成化学中有着重要的作用。香豆素具有很好的抗氧化性，被广泛应用于食品、化妆品等领域。

本发明提供一种香豆素衍生物化合物Ⅲ，所述衍生物化合物的化学结构式如下所示：

本发明提供一种香豆素衍生物化合物Ⅲ的提取方法，包括如下内容：

(1)将黑果枸杞用有机溶剂浸泡过夜后进行超声提取，除杂、除醇后用大孔树脂富集纯化，用2～6倍柱体积的洗脱剂洗脱；

(2)将步骤(1)洗脱得到的物质进行半制备分离，得到组分F-1；所述半制备分离的条件包括：

色谱柱：C18；优选规格为10μm，250×20mm；

流动相：酸性水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；采用如下程序进行梯度洗脱：0～60min，10～25％流动相B；保留时间为5～15min的组分为组分F-1；

(3)将组分F-1进行制备分离，所述制备分离的条件包括：

流动相：酸性水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；采用如下程序进行等洗脱：洗脱时间为0～20min，12％流动相B；保留时间为0～5min；

(4)收集保留时间为0～5min的组分，利用葡聚糖凝胶柱进行再纯化，通过馏分收集器收集得到衍生物化合物Ⅲ，所述再纯化的条件为：

采用20％甲醇的0.3～1％酸性水溶液为流动相进行等度洗脱；流速：2mL/min；每收集27～35mL馏分切换收集管，收集89-93管为化合物Ⅲ。

进一步地，所述黑果枸杞为干果和/或鲜果。

进一步地，步骤(1)中的黑果枸杞：有机溶剂的料液比为1：15～30g/ml，优选为1：20g/ml；

所述溶剂为60～80％乙醇水溶液，优选70％乙醇水溶液。

进一步地，步骤(1)中的洗脱剂为纯水、有机溶剂；洗脱方法为：用4～6倍柱体积的纯水冲洗后，使用2～4倍柱体积的有机溶剂洗脱。

进一步地，所述有机溶剂为80～99％乙醇水溶液，优选95％乙醇水溶液。

进一步地，步骤(1)中超声提取的温度为45～60℃，时间为55～65min。

进一步地，步骤(2)、(3)中酸性水溶液选自三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液中的一种。

进一步地，步骤(2)、(3)中的分离还包括以下条件中的至少一种：

流速：19～21mL/min；检测波长：275～285nm，进样量3～6mL。

本发明还提供了一种上述化合物Ⅲ在制备神经保护产品中的用途；

进一步地，所述化合物Ⅲ在制备预防和/或治疗氧化损伤、细胞凋亡的神经保护产品中的用途。

进一步地，所述化合物Ⅲ在制备预防和/或治疗人体或动物体中氧化损伤、细胞凋亡的神经保护产品中的用途。

进一步地，所述氧化损伤是由乳酸脱氢酶引起的神经细胞损伤。

本发明所述产品包括但不限于药物、功能性食品；进一步地，所述产品还包括药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

采用本发明化合物Ⅲ制备的产品可体内和/或体外实施。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明方法采用半制备型、制备型高效液相色谱，从黑果枸杞中分离制备出了一种全新的香豆素衍生物化合物Ⅲ，更加全面开发了黑果枸杞的活性物质，为进一步研究黑果枸杞香豆素衍生物化合物的药物作用提供了更多的参考依据，加大了黑果枸杞的利用和研究范围。

(2)本发明化合物Ⅲ可以显著减少氧化损伤模型细胞中的乳酸脱氢酶含量，对损伤细胞具有较好的保护作用，具有抗神经细胞的氧化应激损伤的作用，可用于在制备神经保护产品中的用途。

(3)本工艺简单可行，较好的参考价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明化合物Ⅲ的¹H NMR图谱；

图2为本发明化合物Ⅲ的¹³C NMR图谱；

图3为本发明化合物Ⅲ的HMBC图谱；

图4为本发明化合物Ⅲ的HSQC图谱；

图5为本发明化合物Ⅲ的HRESIMS数据图；

图6为本发明化合物Ⅲ的UV图谱；

图7为本发明化合物Ⅲ的IR图谱；

图8为本发明化合物Ⅲ的CD数据图；

图9为本发明化合物Ⅲ的细胞活力检测；

图10为本发明化合物Ⅲ对氧化损伤模型细胞中的LDH的影响。

其中图9、10中，*代表与模型组或者DMSO组相比，p＜0.05显著，**代表p＜0.01极显著，#代表和空白组比，#＜0.05显著。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.材料与试剂

黑果枸杞鲜果于2019年10月采摘自青海省都兰县(东经96.43°，北纬36.44°，海拔3000米)，采摘后经中国科学院西北高原生物研究所高庆波研究员鉴定为黑果枸杞(LR)，标本存放于中国科学院西北高原生物研究所藏药研究重点实验室。将鲜果置于40℃烘箱内低温烘干4天后得到黑果枸杞干果，并于-20℃储存备用。

乙腈：色谱纯，上海展云化工有限公司；AB-8大孔树脂，河北宝恩生物科技有限公司；三氟乙酸：分析纯，天津大茂化学试剂厂；无水乙醇，浙江中星化工试剂有限公司；氘代甲醇、氘代三氟乙酸，色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司。高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素，美国康宁公司；CCK-8试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

2.仪器与设备

半制备型高效液相色谱仪：NP7000，江苏汉邦科技有限公司；高效液相色谱系统：Agilent 1100，美国惠普公司；核磁共振仪：DRX-400，德国布鲁克科技有限公司；酶标仪：Varioskan Flash，赛默飞世尔科技公司；旋转蒸发仪：N-1300，东京理化器械株式会社；管式离心机：GF105，辽阳天圣达制药机械有限公司；恒温二氧化碳培养箱：ICP500，德国Memmert公司；双人单面净化工作台：SW-CJ-1C，上海沪净医疗器械有限公司；超低温冰箱：DW-86L578J，青岛海尔股份有限公司；电子分析天平：AB104-N，瑞士METTLER TOLEDO公司；恒温摇床：THZ-100，上海一恒科学仪器有限公司；Sephadex LH-20，美国通用公司。

3.方法

3.1黑果枸杞的提取纯化

8.0kg黑果枸杞干果以料液比(1：20g/ml)的70％乙醇浸泡过夜，50℃超声波辅助提取60min，管式离心机离心去除杂质后，旋转蒸发仪以50℃去除提取液中的醇，随后使用AB-8大孔树脂富集纯化，以5倍柱体积的纯水冲洗以便洗脱吸附在树脂上的蛋白质和糖类，随后使用3倍柱体积的95％乙醇溶液洗脱，旋转蒸发仪50℃浓缩洗脱液。得到的黑果枸杞花提取物粉末403.7g，经pH示差法计算，花青素含量为363.19±3.06mg/g(以锦葵色素计)。

3.2化合物Ⅲ的纯化分离

将20.7g提取物粉末溶于0.1％盐酸甲醇溶液，使其终浓度为5.0mg/mL。使用半制备型HPLC分离，制备条件如下：色谱柱：Xaqua C18，10μm，250×20mm；流动相：A：0.6％三氟乙酸水溶液，B：乙腈，0-60min，10-25％B；流速：20mL/min；检测：280nm，进样量5.0mL。收集5-15分钟洗脱液作为F-1，将F-1利用旋转蒸发仪除去溶剂得到粉末(92.2mg)。

将F-1重新溶于0.1％盐酸甲醇溶液，使其终浓度为10mg/mL，通过制备性高效液相色谱等度洗脱重新分离，流动相：A：0.6％三氟乙酸水溶液，B：乙腈，0-20分钟，12％B；流速：20mL/min，上扬量为5mL。收集0-5min的峰并蒸发干溶剂得到粉末(43.5mg)。

将0-5min收集的粉末重新溶于0.1％盐酸甲醇溶液，使其终浓度为5mg/mL，利用Sephadex LH-20(1000×30mm)进行再纯化。首先使用20％甲醇/0.6％三氟乙酸水溶液平衡。上样量为8mL，用与平衡相同的流动相进行等度洗脱，流速：2mL/min，洗脱时间为1800min；自动馏分收集器每30mL切换到新的收集管。通过自动馏分收集器收集，89-93管为该化合物(7.2mg)。

3.3化合物Ⅲ的结构鉴定

核磁共振(¹H NMR at 600MHz)，(¹³C NMR at 151MHz)，HMBC，HSQC所用样品溶剂为氘代甲醇。高分辨ESI质谱条件：质谱采用正离子扫描模式，扫描范围为m/z 100-1700，氮气流速为8L/min；氮气温度为350℃；雾化气压力为34psi；毛细管电压为3500V；碰撞电压为175V。碰撞能为10eV－50eV。紫外光谱扫描所用溶剂为甲醇。红外光谱扫描为KBr压片。旋光度检测所用溶剂为甲醇。红外光谱扫描为KBr压片。旋光度检测所用溶剂为甲醇。

将本发明分离得到的化合物Ⅲ通过¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC、HSQC、HRESIMS、UV、IR、CD等有机波谱分析方法进行结构解析，结果如下：

化合物Ⅲ呈现黄色粉末形式，结构解析如下：HRESIMS m/z：833.2113[M+Na]⁺(calcd for C₃₆H₄₂O₂₁，810.2219)；¹H NMR(600MHz，Methanol-d₄)δ_H：7.70(1H，s，H-4)，7.60(1H，d，J＝16.0Hz，H-β)，7.49(2H，d，J＝8.5Hz，H-2″″，6″″)，6.81(2H，d，J＝8.5Hz，H-3″″，5″″)，6.61(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.37(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.34(1H，d，J＝16.0Hz，H-α)，5.07(1H，d，J＝7.5Hz，Glu-1′)，4.95(1H，d，J＝7.5Hz，Glu-1″)，4.74(1H，d，J＝2.0Hz，Rha-1″′)，0.98(3H，s，Rha-6″′)；¹³C NMR(151MHz，Methanol-d₄)δ_C：169.1(C-γ)，161.4(C-7)，161.3(C-4″″)，160.4(C-2)，155.5(C-10)，153.4(C-5)，146.9(C-β)，139.1(C-3)，131.3(C-2″″，6″″)，127.3(C-1″″)，117.2(C-4)，116.8(C-3″″，5″″)，115.2(C-α)，104.5(C-9)，102.8(Glu-1″)，101.8(Glu-1′)，101.7(Rha-1′)，101.2(C-8)，97.6(C-6)，78.4(Glu-3″)，78.1(Glu-3′)，77.5(Glu-5′)，77.0(Glu-5″)，75.4(Glu-2′)，74.9(Rha-4″′)，74.5(Glu-2″)，72.2(Rha-3″′)，71.4(Rha-2″′)，71.1(Glu-4″)，70.3(Glu-4′)，67.7(Rha-5″′)，67.0(Glu-6′)，62.3(Glu-6″)，17.83(Rha-6″′).UV(CH₃OH)：λ_max202nm，IR(KBr)：v_max3411，2979，2922，1702，1624，1514，1469，1446，1390，1374，1331，1267，1170，1074，1037，984，921，891，864，832，CD：-126.21°。相关图谱见图1～8。

化合物Ⅲ命名为：3-羟基香豆素-3-O-(trans-p-香豆酰鼠李葡萄糖苷)-5-O-葡萄糖苷，化学结构式如下所示：

3.4化合物Ⅲ的细胞活力测定

将SH-SY5Y细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育12h后，换成含有化合物的DMEM培养基(含2％FBS)继续4h。培养至特定时间后，将原来的培养液弃掉，每孔加入100μL含2％FBS的DMEM培养基。随后每孔加入10μL CCK溶液，置于细胞培养箱中孵育2h。最后在37℃水平摇床上继续孵育10min，测定波长450nm处的吸光度值。细胞活力计算公式如下：

式中：

V——细胞活力；

A₃——含有细胞、药物和CCK溶液的孔；

A₄——不含药物，含有细胞和CCK溶液的孔；

A₀——不含细胞，含有培养基和CCK溶液的孔。

细胞活力检测结果如下图9所示，与DMSO组相比，结果表明该化合物处于1-100μM的浓度下对SH-SY5Y神经细胞没有细胞毒性，有神经细胞增殖作用。

3.5SH-SY5Y细胞损伤模型的乳酸脱氢酶(LDH)的测定

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以5×10⁴个/mL的密度铺于6孔板，在含10％FBS的DMEM培养基中，每孔3mL，培养48h。加入400μM的H₂O₂与40μM的化合物共孵育4h。用1mL PBS清洗1遍，加入300μL胰蛋白酶消化，用PBS吹打细胞，于5000rpm、25℃离心5min。加入PBS重悬细胞沉淀，超声破碎得到细胞悬液。LDH的测定按照试剂盒说明书操作。

LDH是乳酸脱氢酶，当发生细胞损伤时会出现LDH水平升高的现象。如图10所示，与Control组(空白组)、模型组(0.082±0.00U/gprot)相比，化合物用药组(0.070±0.00U/gprot)可以显著减少氧化损伤模型细胞中的乳酸脱氢酶含量，对损伤细胞具有一定的保护作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种香豆素衍生物化合物Ⅲ，其特征在于，所述衍生物化合物的化学结构式如下所示：

2.权利要求1所述香豆素衍生物化合物Ⅲ的提取方法，其特征在于，包括如下内容：

色谱柱：C18；优选规格为10μm，250×20mm；

(3)将组分F-1进行制备分离，所述制备分离的条件包括：

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的黑果枸杞：有机溶剂的料液比为1：15～30g/ml，优选为1：20g/ml；

所述溶剂为60～80％乙醇水溶液，优选70％乙醇水溶液。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的洗脱剂为纯水、有机溶剂；洗脱方法为：用4～6倍柱体积的纯水冲洗后，使用2～4倍柱体积的有机溶剂洗脱。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述有机溶剂为80～99％乙醇水溶液，优选95％乙醇水溶液。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中超声提取的温度为45～60℃，时间为55～65min。

7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)、(3)中酸性水溶液选自三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液中的一种。

8.根据权利要求2～7任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)、(3)中的分离还包括以下条件中的至少一种：

流速：19～21mL/min；检测波长：275～285nm，进样量3～6mL。

9.权利要求1所述的化合物Ⅲ在制备神经保护产品中的用途；

进一步地，所述化合物Ⅲ在制备预防和/或治疗氧化损伤、细胞凋亡的神经保护产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述氧化损伤是由乳酸脱氢酶引起的神经细胞损伤。