CN114236134A - 一种综合生物毒性的检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种综合生物毒性的检测方法和应用，涉及水质分析技术领域。本发明的待测水体中生物的循环外泌体作为生物标志物在综合生物毒性检测中的应用，解决了单纯化学分析方法的不足，能反映多种污染物的综合生物毒性效应，实现对水体或水产品的综合生物毒性效应的分析。

Description

一种综合生物毒性的检测方法和应用

技术领域

本发明涉及水质分析技术领域，特别是涉及一种综合生物毒性的检测方法和应用。

背景技术

多年以来，随着经济的迅猛发展，环境污染对人群健康和生态安全带来的风险形势严峻。

在环境监测过程中，一般采用理化分析法对水质参数直接进行监测，如采用原子荧光光谱法测定砷、汞、镉等金属含量，采用玻璃电极法测定PH值，采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮含量，采用电化学探头法测定溶解氧，采用酸性高锰酸钾滴定法测定化学需氧量，采用稀释接种法测定五日生化需氧量等等。

但由于历史、认知及科技发展水平等的局限性，现行水质标准的综合指标(如BOD、COD 等)和单一化合物指标(如Hg、Cd等)存在较大的局限性。综合指标不能表征污染物的类别及健康风险；单一化合物指标即使达到水质标准，也能通过复杂的联合作用放大毒性效应。目前，生物毒性试验在水质分析领域倍受关注。生物毒性试验能表征多种环境化学物的联合毒性效应。通过生物毒性试验可以掌握多种污染物对水质及水产品的综合影响，是水质安全性分析的重要技术手段。然而，当前，由于缺乏有效的外源化学物毒性效应的生物标志物，特别是多种环境化学物联合毒性效应的生物标志物，很大程度上限制了生物毒性试验的广泛应用。迄今为止，生物毒性试验可分为急性毒性试验和慢性毒性试验两类。急性毒性通常用来分析高浓度污染物对水生生物的短期毒性效应。常用的急性毒性试验方法包括鱼类急性毒性试验、蚤类急性毒性试验、藻类急性毒性试验和发光细菌急性毒性试验等。然而，水生生物在水环境中因急性毒性而死亡的情况并不常见，而对其生长、繁殖和生理生化功能影响最大的是低浓度化学物质的慢性毒性。但传统的慢性毒性试验费时费力、成本高、影响因素多、实用性差。

发明内容

针对上述内容，本发明提供待测水体中生物的循环外泌体作为生物标志物在综合生物毒性检测中的应用，该应用采用循环外泌体作为生物标志物，解决了单纯化学分析方法的不足，能反映多种污染物的综合生物毒性效应，实现对水体或水产品的综合生物毒性效应的分析。

为了达到上述目的，本发明提供了待测水体中生物的循环外泌体作为生物标志物在综合生物毒性检测中的应用。

细胞通过合成、分泌、传递、识别一系列信号分子，如：细胞因子、神经递质、激素等等来做出对外部环境刺激的适应性反应，以维持自身的稳定性。而外泌体是一种细胞衍生的纳米级(30-120nm)磷脂双分子层囊泡，富含多种生物活性分子，包括DNA、mRNA、非编码RNA(ncRNAs)、蛋白质和脂类，广泛分布于血液、尿液、唾液、母乳和脑脊液中。它们在细胞间通讯、抗原呈递、增殖、凋亡、炎症、肿瘤转移及应激反应等方面发挥重要作用，与疾病的发生、发展、药物敏感性及预后关系密切。不同组织细胞来源的外泌体在数量、内含物构成及功能上具有自身的特异性。外泌体相关的各种指标被推荐为各种病理生理变化的潜在生物标志物，并且几乎所有的真核生物细胞均能合成和分泌外泌体。而其中的鱼类与水环境接触密切，对水环境中的各种有毒有害物质的综合生物毒性反应敏感。本发明人发现野生鱼类循环外泌体水平与DNA损伤效应、染色体损伤效应及氧化损伤效应等呈现良好的平行关系，是一种能反应水体或水产品的综合生物毒性效应(涵盖DNA损伤效应、染色体损伤效应及氧化损伤效应等)的良好的生物标志，适用于水体或水产品的生物监测、水体或水产品安全风险评价及预警。

在其中一个实施例中，所述应用包括检测水体或水产品的综合生物毒性。

在其中一个实施例中，所述检测方法在水体或水产品的低浓度污染物的综合生物毒性分析中的应用。

本发明还提供了一种综合生物毒性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：在待测水体采集预定鱼种的样本，采血，分离得到待测循环外泌体，对所述待测循环外泌体进行定量检测，将所述待测循环外泌体的含量与对应阈值进行比较判断，即得综合生物毒性结果。

通过上述方法能采集到待测水体和参照水体中鱼样本的循环外泌体，并对其定量分析。

在其中一个实施例中，所述判断规则为：当所述待测循环外泌体的含量高于对应阈值时，则判断为所述待测水体和待测水体中的水产品存在综合生物毒性。

以参照水体中鱼样本的循环外泌体含量为参考值，当待测水体中鱼样本的循环外泌体含量＞参考值时，为阳性，判断待测水体中存在综合生物毒性；当待测水体中鱼样本的循环外泌体含量≤参考值时，为阴性，判断待测水体中的综合生物毒性在人体可接受范围值之内。

在其中一个实施例中，所述阈值通过以下方法获得：定量检测参照水体中预定鱼种的循环外泌体的含量。

在其中一个实施例中，所述参照水体为清洁水体。

在其中一个实施例中，所述预定鱼种选自以下鱼种中的至少1种：鲫鱼、鲮鱼、罗非鱼。

上述鱼种为多数水域中的优势鱼种，能够较好地体现水体中综合生物毒性的危害程度。

在其中一个实施例中，所述分离包括以下步骤：将所述血液离心得到血浆，通过差异梯度超速离心法从所述血浆中分离得到待测循环外泌体。

在其中一个实施例中，所述离心的离心温度为4℃，离心力为2000×g-2500×g，离心时间为15-20min。

通过上述操作，能从血液中分离得到血浆。

在其中一个实施例中，所述差异梯度超速离心法包括以下步骤：采用300×g-350×g的离心力离心所述血浆10-15min，取上清液，采用2000×g-2500×g的离心力离心10-15min，取上清液，采用100000×g-120000×g的离心力离心60-70min，取沉淀物，重悬，过滤，取滤液，采用100000×g-120000×g的离心力离心60-70min。

通过上述操作，能从血浆中分离得到循环外泌体。

在其中一个实施例中，所述定量分析的方法为BCA蛋白质分析法。

上述方法能够通过对蛋白进行浓度测定，进而定量分析循环外泌体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种待测水体中生物的循环外泌体作为生物标志物在综合生物毒性检测中的应用，该应用采用循环外泌体作为生物标志物，解决了单纯化学分析方法的不足，能反映多种污染物的综合生物毒性效应，实现对水体或水产品的综合生物毒性效应的分析，反应水质安全的风险程度。

附图说明

图1为实施例2鱼血中的循环外泌体的电镜图；

图2为实施例2中BCA蛋白定量分析鱼血外泌体蛋白水平的结果图；

图3为实验例中鱼血彗星尾部DNA含量的结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

定义：

本发明所述的综合生物毒性：是指多种有毒有害因素共同作用于生物机体所产生的总体生物毒性效应。

循环外泌体：是指循环血液中的外泌体。

来源：

设备：透射电子显微镜(Hitahc-HT7800)；

材料：氧化损伤分析试剂盒(北京索莱宝公司)。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。

实施例1

一种综合生物毒性的检测方法。

采血：根据水质采样技术指导(GB 12998-98)以及河流、水库水环境的具体特点，选取采样点。在每个采样点分别采集5-7条不同种类的鱼样本。鱼样本是通过捕鱼或渔网获得的，采集的鱼标本用之前生存的水源进行养殖，并立即送回实验室，未进行任何干预。然后进行采血，用医用纱布将鱼表面的水和粘液擦拭干净。然后用手术刀切掉鱼腹部中线的肌肉，露出鱼的心脏，用含有少量0.1％肝素钠注射器从主动脉球部采集鱼血。

分离循环外泌体：将采集到的鱼血转移到1.5ml试管中，在室温下静置20min，然后在 4℃下以2000×g，离心15min，获得血浆样品，用锡纸覆盖并冷藏保存。然后用PBS按体积比1:1稀释1ml血浆。将混合物在4℃，300×g离心10min，以去除细胞。吸取上清液，再次在4℃，2000×g,离心10min，清除细胞碎片。然后将上层清液在超高速离心机，4℃下， 100000×g，离心60min，吸去多余的上清液，加入PBS重悬外泌体颗粒用0.22μm过滤器过滤大于200nm的颗粒物，将过滤后的外泌体颗粒重新加入18ml的离心管再次进行120000×g，离心70min。最后，用150μl PBS重新悬浮外泌体颗粒，-80℃保存。

表征：通过差异梯度超速离心法从血液样品中分离出循环外泌体后，运用透射电镜(TEM)及特异性标记(CD63、CD81)识别技术对循环外泌体进行表征。将10μl外泌体溶液添加到碳涂层铜网格中以沉淀1min，多余的溶液用滤纸吸收。用10μl 3％磷钨酸溶液(pH值7.0)对制备的样品进行1min的负染，然后再次用滤纸去除多余的溶液，并在室温下干燥20min。使用在80Kv下运行的透射电子显微镜检查外泌体的形态特征所示。

定量分析：运用BCA蛋白质分析法对循环外泌体进行定量分析，具体操作步骤如下。

1、蛋白标准品的稀释：根据BCA蛋白定量试剂盒所给的缓冲稀释剂按照所给配置表进行稀释；

2、配置BCA工作液：根据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50：1配置适量 BCA工作液，并充分混匀；

3、分别将20μl新鲜配置的BCA标准液和待测循环外泌体样品加入96孔板中；

4、每孔加入200μl BCA工作液，并充分混匀；

5、加盖，37℃孵育30min后冷却至室温；

6、将96孔板放入酶标仪于波长562nm处测定吸光度值(OD值)，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度，表征外泌体的含量，作为水质综合毒性的生物标志。

实施例2

本发明人于2020年7月至2021年4月，对A水库进行了实地调查，根据A水库水环境的具体特点，本次野外调查共选取6个采样点。同时，根据检测目的选择参照水体，在本实施例中，选择清洁水体作为参照水体，所述清洁水体为B水库上游的清洁饮用水源，选取6 个采样点。B水库根据水质评价标准，属于Ⅱ类。在每个样本点，通过捕鱼或渔网共采集了三种鱼(鲫鱼、露斯塔野鲮、吉富品系罗非鱼)5-7条。从A水库采集的鱼样本用A水库水源进行养殖，从B水库采集的鱼样本用B水库水源进行养殖，并立即送回实验室，未进行任何干预。

在2013年以前，上述A水库的水环境受到6大污染源的严重侵蚀，根据《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)，其库区水环境质量属于地表水Ⅳ类。到目前为止，虽然水库周围的污染源得到了一定程度的控制，但库区底泥等介质中原有的污染物仍然存在，水环境没有得到有效的恢复。根据现有的数据，其中许多种类的化学污染物的癌症风险显著超过美国环境保护署建议的最大可接受风险水平。污染物包括但不限于砷(As)、锌(Zn)、锰(Mn)、铜(Cu)和甲基汞(MeHg)。

采用实施例1中的检测方法提取了鱼血中的循环外泌体，并对其进行电镜表征及BCA蛋白定量分析。

结果显示：电镜表征如图1所示，BCA蛋白定量分析如图2所示，结果表明，与B水库的对照组相比，A水库的3种鱼的循环外泌体显著增加。

实验例

检测A水库、B水库鱼样本血细胞染色体损伤、DNA损伤及肝组织氧化损伤(SOD活性、GSH和MDA含量)。

1、检测方法。

①染色体及DNA损伤检测方法：使用1％肝素钠润洗的1ml一次性注射器进行心脏穿刺采血1ml置于抗凝离心管中。取200μl抗凝血加入磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至5倍后进行常规涂片。血涂片经99.5％甲醇固定后使用瑞氏-吉姆萨染液进行染色。显微镜油镜下(100×)计数4000个完整清晰的单个有核血细胞，计算微核率(‰)。剩余的血细胞立即以100g/min 离心5min，弃上清液，加入PBS溶液重悬备用。运用单细胞凝胶电泳(SCGE)实验分析血细胞的DNA损伤程度。使用CASP-2.0软件对实验结果分析测量，计算彗星尾部DNA含量(TailDNA％)。

②氧化损伤检测：本实验例采用了氧化损伤分析试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，对鱼样本肝组织的SOD活性、GSH以及MDA含量进行了分析。首先，每条鱼样本分别称取3次0.1g内脏组织，PBS清洗2次后，分别加入1ml提取液进行冰浴匀浆，8000g/min 4℃离心10min，抽取组织上清液使用SOD、GSH以及MDA试剂盒检测SOD活性、GSH以及 MDA含量的水平。

2、检测结果：如图3和下表所示。

表1水库3种野生鱼类血细胞微核形成率(均数±标准差)

注：*表示P<0.05，即水库A与对照组水库B的鱼类比较时，结果具有统计学显著性差异。

表2水库3种野生鱼类肝组织的氧化损伤情况(均数±标准差)

注：*表示P<0.05，即水库A与对照组水库B的鱼类比较时，结果具有统计学显著性差异。

结果显示：A水库鱼类样品中染色体损伤、DNA损伤及氧化损伤与B水库存在显著差异， A水库的鱼表现出明显的染色体损伤、DNA损伤和氧化损伤。可见，实施例2中所有样本中循环外泌体水平的升高与染色体损伤、DNA损伤和氧化损伤完全一致，很好地反映了鱼所受到的损伤，这意味着循环外泌体水平是鱼类受损伤的潜在生物标志物。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.待测水体中生物的循环外泌体作为生物标志物在综合生物毒性检测中的应用。

2.一种综合生物毒性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：在待测水体采集预定鱼种的样本，采血，分离得到待测循环外泌体，对所述待测循环外泌体进行定量检测，将所述待测循环外泌体的含量与对应阈值进行比较判断，即得综合生物毒性结果。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述判断规则为：当所述待测循环外泌体的含量高于对应阈值时，则判断为所述待测水体和待测水体中的水产品存在综合生物毒性。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述阈值通过以下方法获得：定量检测参照水体中预定鱼种的循环外泌体的含量。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述预定鱼种选自以下鱼种中的至少1种：鲫鱼、鲮鱼、罗非鱼。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述分离包括以下步骤：将所述血液离心得到血浆，通过差异梯度超速离心法从所述血浆中分离得到待测循环外泌体。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述离心的离心温度为4℃，离心力为2000×g-2500×g，离心时间为15-20min。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述差异梯度超速离心法包括以下步骤：采用300×g-350×g的离心力离心所述血浆10-15min，取上清液，采用2000×g-2500×g的离心力离心10-15min，取上清液，采用100000×g-120000×g的离心力离心60-70min，取沉淀物，重悬，过滤，取滤液，采用100000×g-120000×g的离心力离心60-70min。

9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述定量分析的方法为BCA蛋白质分析法。

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