CN114231621A - Lancl2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

Lancl2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114231621A
CN114231621A CN202011474840.3A CN202011474840A CN114231621A CN 114231621 A CN114231621 A CN 114231621A CN 202011474840 A CN202011474840 A CN 202011474840A CN 114231621 A CN114231621 A CN 114231621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lancl2
lung cancer
cells
substance
cancer cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011474840.3A
Other languages
English (en)
Inventor
楼煜清
韩宝惠
张岩巍
徐建林
陆俊
钟华
张伟
张雪艳
王慧敏
顾平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Chest Hospital
Original Assignee
Shanghai Chest Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Chest Hospital filed Critical Shanghai Chest Hospital
Publication of CN114231621A publication Critical patent/CN114231621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断和治疗肺癌的基因标志物，尤其涉及LANCL2在制备治疗肺癌的药物中的应用及其试剂盒。本发明还提供了相应的试剂盒和使用方法。本发明的LANCL2可以作为肺癌诊断或者治疗的基因标志物，可以作为筛选肺癌相关药物或者联合药物的标志物。本发明为肺癌的诊断和治疗提供了新的方法和途径。

Description

LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断和治疗肺癌的基因标志物，尤其涉及LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用及其试剂盒。
背景技术
肺癌，英文名lung cancer，通常是指原发于气管、支气管和肺的恶性肿瘤。肺癌为支气管源性癌，包括鳞癌、腺癌、小细胞癌和大细胞癌几种主要类型。因绝大多数起源于支气管黏膜上皮，源于支气管腺体或肺泡上皮细胞者较少。肺癌的发病率和死亡率正在迅速上升，在欧美工业发达国家和我国的一些工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。
实践显示，有关肺癌若不及时的控制，将对患者的生命产生极大的威胁。若肺癌细胞占据肺部的大部分，会对患者的呼吸产生巨大影响。可以导致支气管阻塞，原本正常肺泡囊腔消失，影响氧气与二氧化碳的交换，病人会因此感到胸闷、气短。严重到一定程度，肺癌可导致患者出现胸痛，也可能出现胸水。胸水多了压迫肺脏，增加了患者的呼吸难度，相当难治。此外，支气管中的神经相当的敏感，癌症刺激到支气管，导致患者经常性的咳嗽。每个人都有这样的生活经验，支气管内掉进一颗饭粒，咳几声，将饭粒咳出来了，就不会再咳了。然而支气管内长出的癌块不会被咳出，这样就可发生一阵阵剧烈的干咳，不容易停止。甚至有时候出现咳血的现象。
化疗是目前肺癌治疗的有效措施。化疗联合靶向可显著延长EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者OS(Lou Y#,Xu J#,Zhang Y,Lu J,Chu T,Zhang X,Wang H,Zhong H,ZhangW*,Han B*.Chemotherapy plus EGFR-TKI as first-line treatment provides bettersurvival for advanced EGFR positive lung adenocarcinoma patients:updated dataand exploratory in vitro study.Targeted Oncology.2020；15(2):175-184.)
吉非替尼及培美曲塞是临床常用的化疗药物。不同肺腺癌细胞系对吉非替尼及培美曲塞的药敏特性不同。肺腺癌细胞系：PC-9(EGFR Exon19 del)、A549(EGFR基因野生型)和HCC827(EGFR Exon19 del)，采用不同浓度梯度的吉非替尼(0-100uM)和培美曲塞(0-25,000nM)处理细胞48小时或72小时，之后通过MTT实验分析细胞的增殖情况并计算药物的IC50，吉非替尼和培美曲塞在PC-9和HCC827细胞中的IC50比较均衡(Lou Y#,Xu J#,ZhangY,Lu J,Chu T,Zhang X,Wang H,Zhong H,Zhang W*,Han B*.Chemotherapy plus EGFR-TKI as first-line treatment provides better survival for advanced EGFRpositive lung adenocarcinoma patients:updated data and exploratory in vitrostudy.Targeted Oncology.2020；15(2):175-184.)。吉非替尼与培美曲塞之间存在药物相互作用。在PC-9细胞中验证吉非替尼与培美曲塞之间协同作用的真实性，与单一的吉非替尼/培美曲塞处理相比，双药联用处理PC-9细胞能更好的抑制细胞增殖，采用CalcuSyn1计算联合指数(CI)后发现CI<0.9，这提示吉非替尼与培美曲塞之间存在明显的协同作用(LouY#,Xu J#,Zhang Y,Lu J,Chu T,Zhang X,Wang H,Zhong H,Zhang W*,Han B*.Chemotherapy plus EGFR-TKI as first-line treatment provides better survivalfor advanced EGFR positive lung adenocarcinoma patients:updated data andexploratory in vitro study.Targeted Oncology.2020；15(2):175-184.)。
吉非替尼、培美曲塞及两者联用处理肺腺癌细胞系PC-9后基因表达谱的改变及关键通路的变化。单一的吉非替尼/培美曲塞及双药联合分别处理PC-9细胞，之后通过基因表达谱芯片分析基因表达的变化情况。研究表明，与单一药物处理相比，有507种基因的表达在双药联合处理后发生明显变化，其中205种基因表达发生特异性减少，302种基因的表达发生特异性的增加，通过IPA分析相关信号通路的改变，发现，双药联用之后变化最为显著的经典信号通路有端粒信号，MAPK信号，IGF-1信号，SAPK/JNK信号及PI3K/Akt信号，与吉非替尼单独处理相比，双药联用能够明显抑制细胞周期相关通路，同时激活细胞凋亡通路；此外包括TGF-β信号,SAPK/JNK信号,LPS-/UVA-诱导的MAPK信号,端粒酶信号及AMPK信号在内的多种信号通路能够被双药联用抑制(Lou Y#,Xu J#,Zhang Y,Lu J,Chu T,Zhang X,WangH,Zhong H,Zhang W*,Han B*.Chemotherapy plus EGFR-TKI as first-line treatmentprovides better survival for advanced EGFR positive lung adenocarcinomapatients:updated data and exploratory in vitro study.Targeted Oncology.2020；15(2):175-184.)。
但是，在众多差异基因中哪些与肺癌真正相关，目前尚不明确。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供涉及一种诊断和治疗肺癌的基因标志物，尤其涉及LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用及其试剂盒。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供LANCL2的新用途，尤其是及LANCL2作为标志物在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用及其试剂盒。
本发明提供了LANCL2的应用，即LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用。
所述的LANCL2(LanC like 2)包括LANCL2基因及其编码序列，LANCL2基因的表达产物及其编码序列，LANCL2基因及其表达产物的活性片段或者衍生物。
例如，所述LANCL2的序列如下所示：
GGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCGAGACCATGTCAAAGAGGCTGAAGCTCCACCTGGGAGGGGAGGCAGAAATGGAGGAACGGGCGTTCGTCAACCCCTTCCCGGACTACGAGGCCGCCGCCGGGGCGCTGCTCGCCTCCGGAGCGGCCGAAGAGACAGGCTGTGTTCGTCCCCCGGCGACCACGGATGAGCCCGGCCTCCCTTTTCATCAGGATGGCAAAATTATCCACAACTTCATAAGACGGATCCAGACCAAAATTAAAGATCTTCTGCAGCAAATGGAAGAAGGGCTGAAGACGGCTGATCCCCATGACTGCTCTGCTTATACTGGCTGGACAGGCATAGCCCTTTTGTACCTGCAGTTGTACCGGGTCACATGTGACCAAACCTACCTGCTCCGATCCCCTGGATTACGTAAAAAGAACACTTCGGAACTCGAATGGCCGCAGGGTCACCTTCCTCTGTGGGGATGCTGGCCCCCTGGCTGTTGGAGCTGTGATTTATCACAAACTCAGAAGTGACTGTGAGTCCCAGGAATGTGTCACAAAACTTTTGCAGCTCCAGAGATCGGTTGTCTGCCAAGAATCAGACCTTCCTGATGAGCTGCTTTATGGACGGGCAGGTTATCTGTATGCCTACTGTACCTGAACACAGAGATAGGTCCAGGCACCGTGTGTGAGTCAGCTATTAAAGAGGTAGTCAATGCTATTATTGAATCGGGTAAGACTTTGTCAAGGGAAGAAAGAAAAACGGAGCGCTGCCCGCTGTTGTACCAGTGGCACCGGAAGCAGTAGTTGGAGCAGCCCATGGCATGGCTGGAATTTACTATATGTTAATGCAGCCGGCAGCAAAAGTGGACCAGAAACCTTGACAGAAATGGTGAAACCCAGTATTGATTATGTGCGCCACAAAAATTCCGATCTGGGAATTACCCATCATCATTAAGCAATGAAACAGACCGGCTGGTGCACTGGTGCCACGGCGCCCCGGGGGTCATCCACATGCTCATGCAGGCGTACAAGGTCTTTAAGGAGGAGAAGTACTTGAAAGAGGCCATGGAGTGTAGCGATGTGATTTGGCAGCGAGGTTTGCTGCGGAAGGGCTACGGGATATGCCATGGGACTGCTGGCAACGGCTATTCCTTCCTGTCCCTTTACCGTCTCACGCAGGATAAGAAGTACCTCTACCGAGCTTGCAAGTTTGCAGAGTGGTGTCTAGATTACGGAGCACACGGGTGCCGCATTCCTGACAGACCCTATTCGCTCTTTGAAGGCATGGCTGGCGCTATTCACTTCTCTCTGATGTCCTGGGACCAGAGACATCACGGTTTCCAGCATTTGAACTTGACTCTTCGAAGAGGGACGGTATGGACTACAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAGCTAGCCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGC(SEQ ID NO 1)。
本发明中的LANCL2表达产物可以是编码序列与SEQ ID NO 1序列同源度70％以上、并且具有G蛋白配体活性的蛋白或者其活性多肽，较好的，其同源度达到80％以上，更好的其同源度达到90％以上。
较好的，所述的LANCL2是肺癌的药物靶点。
较好的，所述的LANCL2是肺癌药物筛选的标志物；所述的肺癌药物筛选的方法包括以下步骤：
(1)收集或者制备含有肺癌细胞的生物液体样本；
(2)检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性；
(3)在含有肺癌细胞的生物液体样本中加入待评估物质；
(4)在与所述的待评估物质孵育后，检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性；
(5)比较加入所述的待评估物质前后，含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性的变化；
(6)加入所述的待评估物质后，含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性下降，所述的待评估物质作为药物候选物。
更好的，所述的肺癌药物筛选的方法还包括：
在加入所述的待评估物质后，检测所述的生物液体样本中肺癌细胞的致癌活性；
如果所述的肺癌细胞的致癌活性下降，所述的待评估物质作为药物候选物。
较好的，所述的待评估物质是含有核酸、多肽、小分子化合物的物质；或者偶联核酸、多肽、小分子化合物的物质。
较好的，所述的LANCL2是诊断肺癌的标志物：所述的应用包括以下步骤：
收集待检测生物样本，检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性。
较好的，所述的治疗肺癌的药物选自小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌或者大细胞癌。
例如，本发明的一个优选实施例中，所述的肺癌细胞是肺腺癌细胞。例如PC-9或者HCC827细胞。
腺癌是腺上皮恶性肿瘤，可以有腺泡、乳头、细支气管肺泡或实性生长方式。它常伴有黏液产生，检测黏液需要特殊的染色，尤其在分化差的肿瘤。黏液的检测有时能够鉴别实性腺癌与其他形态表现一样的大细胞癌。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移,淋巴转移则发生较晚。
本发明还提供了一种检测或者治疗肺癌的试剂盒，所述的试剂盒含有LANCL2基因或者其表达产物的活性片段。
较好的，所述的试剂盒还含有检测试剂，包括检测LANCL2基因或者其表达产物的活性片段的试剂。
本发明的检测试剂盒还可以含有阴性对照、阳性对照、说明书、盛放生物样本的容器，或者制作标准曲线的试剂和设备，等等。
本发明的药物试剂盒还可以含有治疗肺癌常用的化疗药物，例如吉非替尼与培美曲塞。
较好的，本发明的LANCL2的抑制剂可以与吉非替尼、培美曲塞联合，作为治疗肺癌的药物组合物，或者制成药物试剂盒。
本发明提供了LANCL2在制备治疗和诊断肺癌药物中的新用途。本发明的LANCL2可以作为肺癌诊断或者治疗的基因标志物，可以作为筛选肺癌相关药物或者联合药物的标志物。本发明为肺癌的诊断和治疗提供了新的方法和途径。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是候选基因筛选和鉴定，其中，
针对双药处理后基因表达明显减少的候选基因设计shRNA，并构建包装慢病毒感染肺腺癌细胞系用于高内涵筛选，通过MTT实验分析细胞增殖的变化，(a-b)第一轮高内涵筛选，LANCL2基因敲减后细胞的增殖明显受到抑制。
图2是LANCL2与EGFR及患者预后的相关性分析，其中，
(a)TCGA-LUAD数据库(n＝566)肺腺癌肿瘤组织样本及正常肺组织样本中LANCL2mRNA的表达水平，
(b)基因表达相关性分析，与LANCL2表达相关性最显著的25个基因，
(c)突变共现分析，
(d)LANCL2与EGFR在mRNA水平的表达相关性，
(e-f)KM生存分析，LANCL2突变(e)及LANCL2在mRNA水平的表达(f)与患者预后的关系。
图3是LANCL2特异性敲减影响PC-9的增殖与存活，其中，
(a)实时定量PCR分析LANCL2在PC-9、HCC827和A549中的表达水平，显示LANCL2在HCC827(EGFR Exon19 del)和PC-9(EGFR Exon19 del)细胞中的表达明显高于其在A549(EGFR野生型)中的表达，
(b-c)PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2 shRNA的敲减效率显示，慢病毒介导的shRNA技术能显著抑制PC-9中LANCL2在mRNA和蛋白水平的表达，
(d)PC-9细胞中特异性敲减LANCL2后通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化，
(e)PC-9细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞周期改变，LANCL2特异性敲减则主要导致细胞G1期阻滞，
(f)PC-9细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞凋亡的变化显示，LANCL2基因特异性敲减明显促进细胞凋亡，
(g)PC-9细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过Caspase3/7活性检测分析细胞凋亡。
图4是LANCL2特异性敲减影响HCC827的增殖与存活，其中，
(a-b)HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2shRNA的敲减效率显示，慢病毒介导的shRNA技术能显著抑制HCC827中LANCL2在mRNA和蛋白水平的表达，
(c)HCC827细胞中特异性敲减LANCL2后通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化，
(d)HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞周期改变，LANCL2特异性敲减则主要导致细胞G1期阻滞，
(e)HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞凋亡的变化显示，LANCL2基因特异性敲减明显促进细胞凋亡，
(f)HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过Caspase3/7活性检测分析细胞凋亡。
图5是LANCL2拯救实验对PC-9增殖与存活的影响，其中，
(a-b)PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中LANCL2的表达效果显示，LANCL2敲减组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显降低，而LANCL2拯救组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加，
(c)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞增殖的变化：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减对细胞增殖的抑制效果，
(d)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞周期改变：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减导致的细胞G1期阻滞，
(e)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞凋亡的变化：LANCL2过表达能够明显抑制LANCL2特异性敲减导致的细胞凋亡。
图6是LANCL2拯救实验对HCC827增殖与存活的影响，其中，
(a-b)HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中LANCL2的表达效果显示，LANCL2敲减组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显降低，而LANCL2拯救组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加，
(c)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞增殖的变化：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减对细胞增殖的抑制效果，
(d)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞周期改变：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减导致的细胞G1期阻滞，
(e)LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞凋亡的变化：LANCL2过表达能够明显抑制LANCL2特异性敲减导致的细胞凋亡。
图7是小鼠异位移植瘤模型中LANCL2对肿瘤生长的调控，其中，
(a)小鼠异位移植瘤模型中不同组处理对肿瘤体积的影响，
(b)小鼠异位移植瘤模型中不同组处理对肿瘤大小的影响，
(c)小鼠异位移植瘤模型中不同组处理对肿瘤重量的影响。
图8是LANCL2过表达可解除双药处理对PC-9细胞增殖及存活的抑制，其中，
(a-b)PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2的过表达效果，
(c)PC-9细胞分单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组处理后，各组细胞通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化，
(d)各组细胞通过FACS检测分析细胞周期改变，
(e)各组细胞通过FACS检测分析细胞凋亡。
图9是LANCL2特异性敲减后PC-9细胞的基因表达谱分析，其中，
(a-b)HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2的过表达效果，
(c)HCC827细胞分单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组处理后，各组细胞通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化，
(d)各组细胞通过FACS检测分析细胞周期改变，
(e)各组细胞通过FACS检测分析细胞凋亡。
图10是LANCL2特异性敲减后PC-9细胞的基因表达谱分析，其中，
LANCL2敲减后，PC-9中有496种基因表达明显上调，另有839种基因的表达明显下调(筛选标准为FDR<0.05且倍数改变>2)(图a-b)；
对表达发生明显改变的基因进行IPA分析后发现LANCL2与EGFR、APP及Akt之间存在密切联系(图c-e)。
图11是LANCL2敲减后潜在靶基因蛋白表达的改变，其中，
通过Western Blot实验证实，LANCL2敲减后BMPR2、WNT5A和NOTCH2蛋白的表达水平明显降低，而DUSP1表达明显增加。
图12是LANCL2突变的示意图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1筛选候选基因
针对双药处理后基因表达明显减少的候选基因设计shRNA，并构建包装慢病毒感染肺腺癌细胞系用于高内涵筛选，通过MTT实验分析细胞增殖的变化。第一轮高内涵筛选，LANCL2基因敲减后细胞的增殖明显受到抑制。对LANCL2基因进行实时定量PCR分析，以验证双药联合处理导致基因表达发生特异性增加/减少的可靠性。随后在肺腺癌细胞系中进行高内涵筛选。通过慢病毒介导的RNAi技术特异性敲减候选基因，之后通过MTT实验分析细胞的增殖变化，发现LANCL2对细胞增殖的抑制最为明显。提示LANCL2可能是介导双药协同的重要靶点。
实施例2 LANCL2与EGFR及患者预后的相关性分析
在TCGA-LUAD数据库(n＝566)肺腺癌肿瘤组织样本及正常肺组织样本中分析LANCL2mRNA的表达水平。基因表达相关性分析表明，与LANCL2表达相关性最显著的有25个基因，而且LANCL2与EGFR在mRNA水平的表达呈相关性。KM生存分析表明，LANCL2突变、LANCL2在mRNA水平的表达与患者预后相关。
实施例3 LANCL2特异性敲减影响PC-9的增殖与存活
实时定量PCR分析LANCL2在PC-9、HCC827和A549中的表达水平，显示LANCL2在HCC827(EGFR Exon19 del)和PC-9(EGFR Exon19 del)细胞中的表达明显高于其在A549(EGFR野生型)中的表达。PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2 shRNA的敲减效率显示，慢病毒介导的shRNA技术能显著抑制PC-9中LANCL2在mRNA和蛋白水平的表达。PC-9细胞中特异性敲减LANCL2后通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化。PC-9细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞周期改变，LANCL2特异性敲减则主要导致细胞G1期阻滞。PC-9细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞凋亡的变化显示，LANCL2基因特异性敲减明显促进细胞凋亡。PC-9细胞感染LANCL2shRNA慢病毒后，通过Caspase3/7活性检测分析细胞凋亡。
实施例4 LANCL2特异性敲减影响HCC827的增殖与存活
HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2 shRNA的敲减效率显示，慢病毒介导的shRNA技术能显著抑制HCC827中LANCL2在mRNA和蛋白水平的表达。HCC827细胞中特异性敲减LANCL2后通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化。HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞周期改变，LANCL2特异性敲减则主要导致细胞G1期阻滞。HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过FACS检测分析细胞凋亡的变化显示，LANCL2基因特异性敲减明显促进细胞凋亡。HCC827细胞感染LANCL2 shRNA慢病毒后，通过Caspase3/7活性检测分析细胞凋亡。
实施例5 LANCL2拯救实验对PC-9增殖与存活的影响
为进一步证实LANCL2对肺腺癌增殖及存活的影响，我们设计一系列基因拯救实验(gene recovery)加以研究，实验分为三个实验组：阴性对照组，LANCL2敲减组和LANCL2拯救组(LANCL2敲减+过表达)。为保障拯救效果，我们在LANCL2过表达载体中引入同义突变(图12)以破坏LANCL2 shRNA的结合位点，以保证LANCL2的shRNA只抑制内源基因的表达而不干扰抑制LANCL2过表达载体的效果。
PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中LANCL2的表达效果显示，LANCL2敲减组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显降低，而LANCL2拯救组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞增殖的变化：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减对细胞增殖的抑制效果。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞周期改变：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减导致的细胞G1期阻滞。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞凋亡的变化：LANCL2过表达能够明显抑制LANCL2特异性敲减导致的细胞凋亡。
实施例6 LANCL2拯救实验对HCC827增殖与存活的影响
HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中LANCL2的表达效果显示，LANCL2敲减组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显降低，而LANCL2拯救组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞增殖的变化：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减对细胞增殖的抑制效果。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞周期改变：LANCL2过表达能够明显改善LANCL2特异性敲减导致的细胞G1期阻滞。LANCL2敲减组和LANCL2拯救组中细胞凋亡的变化：LANCL2过表达能够明显抑制LANCL2特异性敲减导致的细胞凋亡。
实施例7小鼠异位移植瘤模型中LANCL2对肿瘤生长的调控
在小鼠异位移植瘤模型中对LANCL2与肺腺癌发生发展的关系进行了分析。按照阴性对照组、LANCL2敲减组和LANCL2拯救组对肺腺癌细胞系PC-9进行分组处理。各组细胞经体外培养扩增后，通过皮下接种构建肺腺癌的小鼠异位移植瘤模型并对肿瘤的生长进行实时观测。结果显示LANCL2敲减组的肿瘤生长速度明显减慢，皮下接种六周后，肿瘤的体积、大小和重量明显低于对照组；与敲减组相比，LANCL2拯救组则能解除LANCL2敲减对肿瘤生长的抑制。
实施例8 LANCL2过表达可解除双药处理对PC-9细胞增殖及存活的抑制
PC-9细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2的过表达效果。PC-9细胞分单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组处理后，各组细胞通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化。
本发明人对PC-9按照单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组进行处理并检测细胞的生长和存活情况。首先对LANCL2的过表达情况进行分析。实时定量PCR检测和Western Blot的结果显示，双药+LANCL2过表达组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加(图8a-b)。功能研究指出，LANCL2过表达能够逆转双药处理对细胞增殖的抑制效果(图8c)。细胞周期分析发现LANCL2过表达还能逆转双药处理导致的细胞G1期阻滞(图8d)。凋亡实验证实，LANCL2过表达能够明显抑制双药处理导致的细胞凋亡(图8e)。
实施例9 LANCL2特异性敲减后PC-9细胞的基因表达谱分析
HCC827细胞中，通过实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LANCL2的过表达效果。HCC827细胞分单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组处理后，各组细胞通过CCK-8实验检测细胞增殖的变化。
为验证LANCL2在吉非替尼与培美曲塞双药协同抑制肺腺癌细胞增殖及存活中的重要性，我们对HCC827按照单药处理组(吉非替尼药物处理)、双药处理组(吉非替尼+培美曲塞处理)和双药+LANCL2过表达组进行处理并检测细胞的生长和存活情况。首先对LANCL2的过表达情况进行分析。实时定量PCR检测和Western Blot的结果显示，双药+LANCL2过表达组中LANCL2的表达在mRNA和蛋白水平均有明显增加(图9a-b)。功能研究指出，LANCL2过表达能够逆转双药处理对细胞增殖的抑制效果(图9c)。细胞周期分析发现LANCL2过表达还能逆转双药处理导致的细胞G1期阻滞(图9d)。凋亡实验证实，LANCL2过表达能够明显抑制双药处理导致的细胞凋亡(图9e)。
实施例10 LANCL2特异性敲减后PC-9细胞的基因表达谱分析
采用基因表达谱芯片的策略，对LANCL2基因特异性敲减后PC-9细胞的基因表达谱进行了系统分析。结果显示LANCL2敲减后，PC-9中有496种基因表达明显上调，另有839种基因的表达明显下调(筛选标准为FDR<0.05且倍数改变>2)(图10a-b)。对表达发生明显改变的基因进行IPA分析后发现LANCL2与EGFR、APP及Akt之间存在密切联系(图10c-e)。
实施例11 LANCL2敲减后潜在靶基因蛋白表达的改变
通过Western Blot实验证实，LANCL2敲减后BMPR2、WNT5A和NOTCH2蛋白的表达水平明显降低，而DUSP1表达明显增加(如图11)。已知BMP-BMPR2通路会经由下游的PI3K/Akt通路活化导致携带有EGFR敏感突变的肺癌患者耐受EGFR-TKIs。提示LANCL2对肺腺癌细胞增殖的调控能力或与Akt信号通路关系密切。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 上海市胸科医院
<120> LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用
<130> 20200906
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1575
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggccgttttt ggcttttttg ttagacgaag cttgggctgc aggtcgactc tagaggatcc 60
ccgggtaccg gtcgccacca tgggcgagac catgtcaaag aggctgaagc tccacctggg 120
aggggaggca gaaatggagg aacgggcgtt cgtcaacccc ttcccggact acgaggccgc 180
cgccggggcg ctgctcgcct ccggagcggc cgaagagaca ggctgtgttc gtcccccggc 240
gaccacggat gagcccggcc tcccttttca tcaggatggc aaaattatcc acaacttcat 300
aagacggatc cagaccaaaa ttaaagatct tctgcagcaa atggaagaag ggctgaagac 360
ggctgatccc catgactgct ctgcttatac tggctggaca ggcatagccc ttttgtacct 420
gcagttgtac cgggtcacat gtgaccaaac ctacctgctc cgatcccctg gattacgtaa 480
aaagaacact tcggaactcg aatggccgca gggtcacctt cctctgtggg gatgctggcc 540
ccctggctgt tggagctgtg atttatcaca aactcagaag tgactgtgag tcccaggaat 600
gtgtcacaaa acttttgcag ctccagagat cggttgtctg ccaagaatca gaccttcctg 660
atgagctgct ttatggacgg gcaggttatc tgtatgccta ctgtacctga acacagagat 720
aggtccaggc accgtgtgtg agtcagctat taaagaggta gtcaatgcta ttattgaatc 780
gggtaagact ttgtcaaggg aagaaagaaa aacggagcgc tgcccgctgt tgtaccagtg 840
gcaccggaag cagtagttgg agcagcccat ggcatggctg gaatttacta tatgttaatg 900
cagccggcag caaaagtgga ccagaaacct tgacagaaat ggtgaaaccc agtattgatt 960
atgtgcgcca caaaaattcc gatctgggaa ttacccatca tcattaagca atgaaacaga 1020
ccggctggtg cactggtgcc acggcgcccc gggggtcatc cacatgctca tgcaggcgta 1080
caaggtcttt aaggaggaga agtacttgaa agaggccatg gagtgtagcg atgtgatttg 1140
gcagcgaggt ttgctgcgga agggctacgg gatatgccat gggactgctg gcaacggcta 1200
ttccttcctg tccctttacc gtctcacgca ggataagaag tacctctacc gagcttgcaa 1260
gtttgcagag tggtgtctag attacggagc acacgggtgc cgcattcctg acagacccta 1320
ttcgctcttt gaaggcatgg ctggcgctat tcacttctct ctgatgtcct gggaccagag 1380
acatcacggt ttccagcatt tgaacttgac tcttcgaaga gggacggtat ggactacagg 1440
atgacgatga caaggattac aaagacgacg atgataagga ctataaggat gatgacgaca 1500
aatgagctag cctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 1560
caggcagaag tatgc 1575

Claims (9)

1.LANCL2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的LANCL2是肺癌的药物靶点。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LANCL2是肺癌药物筛选的标志物；
所述的肺癌药物筛选的方法包括以下步骤：
(1)收集或者制备含有肺癌细胞的生物液体样本；
(2)检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性；
(3)在含有肺癌细胞的生物液体样本中加入待评估物质；
(4)在含有肺癌细胞的生物液体样本与所述的待评估物质孵育后，检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性；
(5)比较加入所述的待评估物质前后，含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性的变化；
(6)加入所述的待评估物质后，含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性下降，所述的待评估物质作为药物候选物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肺癌药物筛选的方法还包括：
在加入所述的待评估物质后，检测所述的生物液体样本中肺癌细胞的致癌活性；
如果所述的肺癌细胞的致癌活性下降，所述的待评估物质作为药物候选物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或者治疗肺癌的药物是含有核酸、多肽、小分子化合物的物质；或者偶联核酸、多肽、小分子化合物的物质。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的LANCL2是肺癌的诊断标志物：
所述的应用包括以下步骤：
收集待检测生物样本，
检测含有肺癌细胞的生物液体样本中LANCL2的含量或者活性。
7.根据权利要求1至6之一所述的应用，其特征在于，所述的肺癌选自小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌或者大细胞癌。
8.一种用于检测或者治疗肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有LANCL2基因或者其表达产物的活性片段。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测试剂，包括检测LANCL2基因或者其表达产物的活性片段的试剂。
CN202011474840.3A 2020-09-09 2020-12-14 Lancl2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用 Pending CN114231621A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010941208 2020-09-09
CN2020109412089 2020-09-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114231621A true CN114231621A (zh) 2022-03-25

Family

ID=80742937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011474840.3A Pending CN114231621A (zh) 2020-09-09 2020-12-14 Lancl2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114231621A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070128636A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-07 Baker Joffre B Predictors Of Patient Response To Treatment With EGFR Inhibitors
CN101283106A (zh) * 2005-07-27 2008-10-08 肿瘤疗法科学股份有限公司 小细胞肺癌的诊断方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101283106A (zh) * 2005-07-27 2008-10-08 肿瘤疗法科学股份有限公司 小细胞肺癌的诊断方法
US20070128636A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-07 Baker Joffre B Predictors Of Patient Response To Treatment With EGFR Inhibitors

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. CXCR4/SDF-1 axis is involved in lymph node metastasis of gastric carcinoma
Zhao et al. S100A14 promotes the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma
Li et al. LncRNA SNHG1 promotes liver cancer development through inhibiting p53 expression via binding to DNMT1.
Ma et al. ITIH4, as an inflammation biomarker, mainly increases in bacterial bloodstream infection
CN111304326B (zh) 检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用
Wei et al. P53 function is compromised by inhibitor 2 of phosphatase 2A in sonic hedgehog medulloblastoma
Ikeguchi et al. Changes in Levels of Expression of p53 and the Product of the bcl-2 in Lines of Gastric Cancer Cells during Cisplatin-lnduced Apoptosis
Liu et al. USP51/ZEB1/ACTA2 axis promotes mesenchymal phenotype in gastric cancer and is associated with low cohesion characteristics
JP7390002B2 (ja) 頭頸部がんの検出を補助する方法
CN114231621A (zh) Lancl2在制备诊断或者治疗肺癌的药物中的应用
CN113528528B (zh) 一种促进耐伊马替尼慢性髓细胞白血病细胞K562/G01凋亡shRNA及其应用
Zhang et al. Comprehensive analysis of the novel omicron receptor AXL in cancers
CN105203763B (zh) 一种口腔癌特异性检测的试剂盒
Jiang et al. TRIM65 knockout inhibits the development of HCC by polarization tumor-associated macrophages towards M1 phenotype via JAK1/STAT1 signaling pathway
CN109908160B (zh) 黄夹次乙苷作为抗肿瘤药物的应用
Sui et al. Identification of ERCC8 as a novel cisplatin-resistant gene in esophageal cancer based on genome-scale CRISPR/Cas9 screening
CN114042160B (zh) Ctd-2256p15.2及其编码微肽作为靶点在开发肿瘤治疗药物中的应用
Han et al. Single-Cell Expression Landscape of SARS-CoV-2 Receptor ACE2 and Host Proteases in Normal and Malignant Lung Tissues from Pulmonary Adenocarcinoma Patients. Cancers (Basel) 2021; 13 (6): 1250
CN110042160B (zh) 一种消化系统恶性肿瘤标志物及其制备抑制消化系统恶性肿瘤药物的方法
CN114099681B (zh) Akt/stat3作为免疫检查点抑制剂的靶点的用途
WO2021043340A2 (zh) 一种肿瘤标志物aquaporin 2蛋白及其应用
CN107723369B (zh) Setd1b蛋白及其编码基因在肝癌诊断治疗中的应用
Yu et al. A novel defined apoptosis-related gene signature as a prognostic tool in lung adenocarcinoma
Altamemi et al. EXPRESSION LEVELS OF miRNA-155 IN HODGKIN LYMPHOMA PATIENTS.
CN105842444A (zh) 一种子宫内膜癌特异性检测的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination