CN114231423B - 重金属Zn抗性构树内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2株具有重金属抗性和促生作用的内生真菌，它们是保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156的铅锌逆境构树内生真菌，它们对于生态修复和中药材生态种植有重要意义。

Description

重金属Zn抗性构树内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及具有重金属抗性和促生作用的构树内生真菌及其应用。

背景技术

构树Broussonetia papyrifera(L.)Vent是重要的经济树种，也是重要的药用植物，具有很强的逆境适应性。植物内生真菌(Endophytic fungi)广泛存在于高等植物的各组织和器官中，它不仅与宿主植物形成紧密的共生关系，同时它也能产生活性代谢成分，促进植物生长，提高宿主植物在重金属胁迫下的逆境适应能力。

植物内生真菌对生物多样性和生态系统平衡具有重要作用，内生真菌丰富的多样性以及次生代谢产物的化学多样性也为药物研发、植物病害的生物防治提供重要途径。真菌的多样性除与寄主有关外，还与环境密切相关，从具有特殊进化历程、生存策略的植物中极有可能获得功能特殊的新颖内生真菌类群。在重金属胁迫环境下，其内生真菌可能会发生菌群结构的改变，并产生次生代谢成分的变化，从中有望发现一些具有特殊用途的功能菌株。

重金属锌污染土壤的植物修复目前存在效率不高，植物抗性不强等问题。通过挖掘重金属抗性菌株，是开发环境友好的植物-内生真菌联合生态修复技术的关键基础。

中药材生态种植关乎生态环境保护和中药产业可持续发展。由于化肥、农药和生长调节剂的不当使用，影响土壤生态环境和中药材品质和产量。中药材的生态种植的突破瓶颈在于杜绝滥用化肥、农药。通过挖掘特殊生境构树的促生功能内生真菌，满足现代农业新型菌肥，减少农药化肥使用，解决中药材生态种植瓶颈。

目前未见如本申请的重金属Zn抗性构树内生真菌燕麦镰刀菌Fusariumavenaceum和葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供新的构树内生真菌和它们的用途。

本发明的第一方面，提供了两种植物内生真菌，是从桑科构树属植物构树(Broussonetiapapyrifera(L.)Vent)活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，所述构树内生真菌的保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156。

本发明的第二方面，提供了所述构树内生真菌的用途：

保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156的构树内生真菌提高植物对重金属Zn抗性的用途。

保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156的构树内生真菌修复土壤重金属Zn污染的用途。

保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156的构树内生真菌在生态修复中的用途。

保藏号为CCTCC NO:M 2021155或CCTCC NO:M 2021156的构树内生真菌在中药材种植中的用途。

本发明优点在于：

本发明以锌胁迫下特殊生境构树中挖掘具有重金属抗性和促生作用的内生真菌，解决内生真菌-植物联合修复的关键瓶颈问题，为中药材生态种植的提供现代新型菌肥，对于生态环境保护具有重要意义。

附图说明

图1：抗性菌株的相对生长率。

图2：抗性菌株吸附Zn前后的形态特征(ACE处理前，BDF处理后)。

图3：抗性菌株吸附Zn前后的光学显微镜观察。

图4：抗性菌株的基因序列。

图5：菌株燕麦镰刀菌C-J1的系统发育树。

图6：菌株葡萄座腔菌P-L12的系统发育树。

图7：抗性菌株在MNN培养液中的干燥前后的形态。

图8：初始浓度对抗性菌株菌丝Zn吸附量的影响。

图9：菌丝加入量对抗性菌株菌丝Zn吸附量的影响。

图10：吸附时间抗性菌株菌丝Zn吸附量的影响。

图11：菌株葡萄座腔菌P-L12 Zn吸附前后的扫描电镜。

图12：菌株燕麦镰刀菌C-J1 Zn吸附前后的扫描电镜。

图13：菌株葡萄座腔菌P-L12 Zn吸附前后的透射电镜。

图14：菌株燕麦镰刀菌C-J1 Zn吸附前后的透射电镜。

图15：Zn对抗性菌株可溶性蛋白含量的影响。

图16：Zn对抗性菌株SOD活性的影响。

图17：Zn对抗性菌株POD活性的影响。

图18：Zn对抗性菌株CAT活性含量的影响。

图19：Zn对抗性菌株GSH含量的影响。

图20：Zn对抗性菌株APX酶活性的影响。

图21：Zn对抗性菌株MDA含量的影响。

图22：燕麦镰刀菌C-J1和葡萄座腔菌P-L12对拟南芥主根长度的影响。

图23：燕麦镰刀菌C-J1和葡萄座腔菌P-L12对拟南芥侧根数的影响。

图24：燕麦镰刀菌C-J1和葡萄座腔菌P-L12对拟南芥植株鲜重生物量的影响。

具体实施方式

本发明的内生真菌是从江苏南京市栖霞铅锌矿区中生长的构树不同组织中分离得到的菌株。下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1

构树植物的根、茎、叶和果实采集后24小时内进行表面消毒(三步消毒法)处理，构树根和茎的表面消毒方法为75％EtOH 1min，2.5％NaClO 5min，75％EtOH 0.5min；叶片的表面消毒方法为75％EtOH 1min，2.5％NaClO 3min，75％EtOH 0.5min。用无菌蒸馏水清洗后使用无菌滤纸将表面水分吸干。用无菌刀片切成大小均一组织块后接种在不同的分离培养基上。28℃暗培养，每日观察组织周围菌落的生长，待培养基上的组织块内部有菌丝出现时，及时将其挑出，培养在新的培养基中，多次纯化分离菌株，直至分离的菌落的形态保持一致且菌落边缘整齐。

将分离的菌株接种到PDA培养基，28℃培养7d，观察菌落生长特征，对菌株进行初步鉴定。

用PDA培养基接种选出的耐性菌株，然后用镊子将灭菌后的盖玻片45°角插入(插片法)培养皿内，28℃培养，待菌丝生长布满盖玻片，取出，利用光学显微镜进行菌株孢子梗及孢子形态的观察经过不断分离纯化培养至单一菌落。根据菌丝的形态和群落的培养特征将单一菌落的内生真菌划分为不同的形态型。最终得到本发明的内生真菌菌株P-L12、C-J1。

采用CTAB法提取构树内生真菌DNA，采用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，SEQ ID NO:1)与ITS4(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAAGG-3’，SEQ ID NO:2)进行PCR扩增，回收PCR产物，使用测序仪对纯化后的PCR产物进行DNA序列的测定。

以每株菌株的ITS序列为靶序列，在BLAST上进行DNA序列的相似性搜索，并以相似性较高的序列作为参考进行同源性较高序列的搜索，通过下载菌株同源性较高的序列，选择1-2个具有代表性的菌株序列，在MEGA7中通过ClustalW对下载的序列进行多重分析比对后，采用邻接法(Neighbor-Joinning)建立系统发育树，确定菌株的分类。结果见表1，P-L12同葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea同源性达100％，C-J1同燕麦镰刀菌Fusariumavenaceum同源性达99.81％。C-J1和P-L12已于2021年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，C-J1保藏编号为CCTCC NO:M 2021156，名称为“燕麦镰刀菌C-J1”，P-L12保藏编号为CCTCC NO:M 2021155，名称为“葡萄座腔菌P-L12”。

表1构树内生真菌的分离鉴定及ITS基因序列同源性相似度

表2分离菌株的种属分类

我们在考察构树不同部位表面消毒剂和消毒方案的基础上，对南京栖霞矿区生长的构树分不同季节采集样品，分别采用常规培养及平板灌注法进行菌株的分离培养，共分离出187株内生真菌。采用载玻片培养法经水琼脂培养基以促进产孢，依据菌落生长形态、分生孢子形状以及分生孢子梗等形态学鉴别方法鉴定内生真菌，并结合内生真菌rDNA-ITS测序，经Blast序列比对，MEGA进化树分析，对分离出的内生真菌进行分类鉴定。研究结果表明重金属胁迫下构树不同季节均呈现具有丰富的内生真菌多样性。构树丰富的内生真菌资源是特境微生物资源的重要宝库，不仅可作为天然产物的新来源，也可以作为抗逆菌株，促进中药材的生态种植物，利用构树的适生性，进一步提高逆境适应能力，用于荒漠、废弃地的生态修复及中药种植具有很大的应用潜力，值得后续进一步研究。

实施例2

Zn²⁺培养基配制方法：

准备NaOH、硫酸锌母液、MS培养基，将三者进行高温高压灭菌，灭菌完成后，待培养基温度降至70℃时添加NaOH溶液调节培养基PH，然后再添加Zn²⁺调节至所需浓度。为避免金属离子形成局部沉淀，而培养基未冷却时较浓稠不能及时使沉淀分散水解，由Ksp＝C² _(OH+)C_(Zn2+)可知应先添加NaOH调节pH再添加金属离子，可最大程度降低沉淀形成。

将实验前期分离出的单一菌落葡萄座腔菌P-L12、燕麦镰刀菌C-J1在无菌条件下分别接种含10mmol/L Zn²⁺的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃培养7d后测量菌株的生长直径，测定其MTI数值，计算公式如下：

为了进一步检测抗性菌株葡萄座腔菌P-L12、燕麦镰刀菌C-J1耐Zn(Ⅱ)的能力，对两个菌株的Zn耐受性菌株进行MICs的测定。在250mL的锥形瓶内加入150mL含Zn²⁺浓度梯度500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、5000mg/L的MNN培养液，121℃高温灭菌30min。采用无菌打孔器从PDA培养基打取直径为0.45cm的菌块4片，在28℃，120r/min摇床内振荡培养7d，收集过滤菌丝，65℃烘干，记录菌丝的湿重(FW)和干重(DW)，计算它们的相对生长率，进而确定耐性菌株的最小抑制浓度(MICs)。

将菌株分别接种到含Zn和不含Zn的PDA培养基上，28℃培养7d，观察菌株的菌落的生长形态变化，对菌株进行初步分析。用PDA培养基接种选出的耐性菌株，然后用镊子将灭菌后的盖玻片45度插入培养皿内，28℃培养，待菌丝生长布满盖玻片，取出，利用光学显微镜进行菌株孢子梗及孢子形态的观察。

在GenBank数据库中用Blast功能查找出与形态型菌株的ITS和5.8S基因序列相近的同源序列2-3条，作为参考序列，用于系统发育分析。同时在Genebank数据库中下载与该形态菌株的基因序列所在的其它科的菌株的目的基因序列用于系统发育分析。ClustalW程序先对5.8S基因和ITS区序列进行匹配排序，然后用N-J法分析构建发育树。其中树的每一结点则表示一个分类学单元，进化分支则定义了分类单元之间的关系。我们可以通过系统发育树推断进化关系，从而判断实验序列与已知的参考序列可否被认定为来源于同一物种。

在浓度(10mmol/L)Zn²⁺离子金属培养基中对抗性菌株葡萄座腔菌P-L12、燕麦镰刀菌C-J1测定菌株耐性指数MTI。

表3高浓度(10mmol/L)抗性菌株的MTI

通过对抗性菌株葡萄座腔菌P-L12、燕麦镰刀菌C-J1进行进一步的MNN液体发酵培养，得到两菌株的干重(DW)和湿重(FW)，计算出各菌株的相对生长率，从而确定出两个菌株的MCIs(见图1)。由图可知，在不同Zn浓度条件下，菌株的生长情况并不一致。对菌株葡萄座腔菌P-L12，随着Zn²⁺浓度逐渐升高，该菌株的相对生长率先升高后降低，当Zn²⁺浓度为3000mg/L时，其相对生长率达到最大，为58.61％；菌株燕麦镰刀菌C-J1随着Zn²⁺浓度逐渐升高，该菌株的相对生长率先升高后降低，当Zn²⁺浓度为3000mg/L时，其相对生长率达到最大，为63.01％。

表4抗性菌株的MICs

由图2可知，在含重金属培养基上的菌株均较不含重金属培养基上的菌株生长较慢，且菌落的形态特征发生较明显的改变。菌株葡萄座腔菌P-L12在不含Zn培养基上成环纹状，边缘较整齐，菌丝颜色为深灰和浅灰相间(如图2A)，在含Zn培养基上菌丝边缘颜色较里面深，且菌丝边缘成树枝状(如图2B)；菌株燕麦镰刀菌C-J1在不含Zn培养基上颜色为浅黄色，培养基的颜色由无色透明变为淡黄色透明状，菌落整齐，表面较光滑，菌落中间上部有圆球状小水珠(如图2C)，在含Zn的培养基上菌落边缘花纹状，表面有竖纹，菌落两轮环纹颜色较明显，外轮为橘黄色，内轮为白色，最中间部分为黄色的圆圈(如图2D)。

通过光学电子显微镜观察两株抗性菌株孢子形态(如图3)。对于菌株葡萄座腔菌P-L12，在不含Zn培养基上生长的菌丝弯曲环绕，分生孢子顶端呈毛笔头状，孢子为短棒状，其间有横隔(如图3A)，在含Zn培养基上生长的菌丝孢子较不含Zn培养基上的光滑，且孢子为长棒状，间有横隔，颜色比不含Zn的较浅(如图3B)；菌株燕麦镰刀菌C-J1在不含Zn的培养基上分生孢子较发达，不具横隔(如图3C)，在含Zn培养基上孢子聚集成团状，且部分孢子成“8”字型(如图3D)。

对抗性菌株葡萄座腔菌P-L12、燕麦镰刀菌C-J1进行ITS序列扩增，通过PCR扩增反应体系，以ITS1和ITS4为引物来扩增目的基因片段，然后对目的基因的琼脂凝胶电泳进行检测从而确认PCR扩增片段，回收PCR产物进行目的抗性菌株基因的测序，结果如图4。

经过测序，得到二株抗性菌株的ITS基因序列分别为：菌株燕麦镰刀菌C-J1的ITS基因序列为526bp，葡萄座腔菌P-L12的ITS基因序列为424bp，分别对它们的序列在NCBI的BLAST中进行DNA碱基序列相似性搜索并进行比对，分别选取与菌株燕麦镰刀菌C-J1、葡萄座腔菌P-L12基因序列同源相似性较高的序列15、12个，通过MEGA7软件来构建系统发育树(如图5，6)。结果显示，菌株燕麦镰刀菌C-J1与Fusarium avenaceum(FJ602989.1)在树的同一枝上，且两株菌的ITS基因序列同源性为99.62％；菌株葡萄座腔菌P-L12单独成枝，但它的末枝端与菌株Botryosphaeria dothidea(HM461911.1)和菌株Botryosphaeriadothidea(MG827237.1)的末枝相连，且与它们的ITS基因序列同源性分别为99.53％和99.76％。

实施例3

从重金属胁迫居群构树中分得并经筛选具有高抗锌活性的两株内生真菌：燕麦镰刀菌C-J1；葡萄座腔菌P-L12。

培养基采用MNN液体培养基，其成分为：NaCl，0.025g/L；葡萄糖，10.0g/L；KH₂PO₄，0.5g/L；麦芽浸粉，3.0g/L；VB₁，0.1mg/L；CaCl₂，0.05g/L；(NH₄)₂HPO₄，0.25g/L，FeCl₃，0.012g/L，MgSO₄·7H₂O，0.15g/L；pH 5.7±0.1。

在250mL的锥形瓶中分别配制含10mM Zn和不含Zn的MNN液体培养基100mL，在121℃下灭菌20min后备用。用打孔器(直径6mm)从PDA平板上打取菌片。在摇床中120rpm，28℃下恒温条件下培养7d。蒸馏水多次冲洗，真空泵抽滤得到菌丝，4℃条件下保存作为下步实验的吸附剂。

在250mL锥形瓶中加入100mL的溶液和0.5g菌丝体，用1mol/L的Zn溶液调节培养液中Zn的初始浓度分别为5，10，50，100，200mmol/L。用1mol/L的NaOH或HNO₃溶液调节pH值为5.5±0.2，然后在28℃的恒温培养箱中120rpm振荡180min测定滤液中Zn的浓度。

在250mL锥形瓶中加入100mL含10mmol/L的Zn溶液，再分别将不同质量的菌丝体0.5，1.0，2.0，3.0g加入锥形瓶内。用1mol/L的NaOH或HNO₃溶液调节pH值为5.5±0.2，28℃的恒温培养箱中120rpm振荡180min后测定Zn的浓度。

在250mL锥形瓶中加入100mL含Zn浓度为10mmol/L的溶液和0.5g菌丝体，用1mol/L的NaOH或HNO₃溶液调节pH值为5.5±0.2，然后在28℃的恒温培养箱中120rpm振荡15，30，60，120，180min，分别取出上清进行Zn浓度的测定。

吸附试验结束后，从不同的样品中吸取1ml溶液测定Zn的浓度，通过Zn的初始浓度计算菌丝对Zn的吸附量，计算公式如下：

其中，q表示Zn的吸附量(mg/g)，C₀表示Zn的初始浓度(mg/L)，C_e表示反应后Zn的浓度(mg/L)，m表示菌丝体的质量(g)，V表示反应液的体积(L)。

取在含Zn和不含Zn的MNN培养液中发酵的菌丝，用ddH₂O反复多次冲洗菌丝表面的培养液，2.5％的戊二醛固定后再用1％锇酸固定，乙醇梯度脱水后用乙酸异戊酯进行处理，在临界点喷金后用扫描电镜进行抗性菌株菌丝表面形态特征的观察。

取在含10mM Zn和不含Zn的MNN培养液中发酵的菌丝，用ddH₂O反复多次冲洗菌丝表面的培养液，后立刻将菌丝体放入福尔马林中保存，用树脂进行包埋，切片后用透射电镜对抗性菌株菌丝的内部结构进行观察。

取在含10mM Zn和不含Zn的MNN培养液中发酵的菌丝，用ddH₂O清洗菌丝表面的培养液后，65℃烘箱中烘干后研磨成细粉状，用Bruker红外光谱仪进行抗性菌株的红外光谱分析。

用Microsoft office Excel 2016进行原始数据统计，用SPSS 25进行方差分析，GraphPad Prism 9作吸附曲线。

在MNN液体发酵培养过程中发现，菌株葡萄座腔菌P-L12和燕麦镰刀菌C-J1菌丝的颜色和培养液的颜色会发生相应的变化。对于菌株葡萄座腔菌P-L12，其菌丝颜色由白色逐渐转变为墨黑色，同时培养液的颜色也由淡黄色变为墨黑色，菌丝逐渐凝聚为多个小圆球状；对菌株燕麦镰刀菌C-J1，菌丝由初始的淡橘色逐渐变为紫红色，凝聚成小球状分布在菌液中，菌液的颜色由最初的淡黄色转变为深紫红色，其发酵产物干燥前后的颜色如图7。

通过对两株菌在MNN液体中的生长(湿重和干重)研究发现，燕麦镰刀菌C-J1较葡萄座腔菌P-L12生长快，它们在MNN中生长10d后的湿重(FW)分别为213.954g(燕麦镰刀菌C-J1)、141.1805g(葡萄座腔菌P-L12)，待65℃烘干后，它们的干重(DW)分别为85.653g(燕麦镰刀菌C-J1)、56.33g(葡萄座腔菌P-L12)。

由图8可知，各菌株间菌丝体的加入量对Zn吸附量差异明显。当菌株菌丝的加入量为1.0g时，菌株燕麦镰刀菌C-J1对Zn的吸附量最高，为144.0758mg/g；而菌株葡萄座腔菌P-L12 Zn的吸附量随菌丝的加入量增加而增加。

由图9可知，随着Zn的初始浓度的不断增加，抗性菌株菌丝对Zn的吸附量逐渐增加，当Zn的初始浓度为100mg/L，两株菌株菌丝的吸附量均达到最大，分别为：燕麦镰刀菌C-J1为280.133mg/g，葡萄座腔菌P-L12为277.948mg/g。

由图10可知，各菌丝Zn吸附量随着时间的不断延长而变化，菌株燕麦镰刀菌C-J1随着时间的延长菌株Zn吸附量先增加后降低，当吸附时间为180min时Zn吸附量达到最大，为180.3263mg/g；菌株葡萄座腔菌P-L12随着吸附时间的增加Zn吸附量也逐渐增加，但各时间段的吸附量变化不很明显，当吸附时间为180min时该菌丝对Zn吸附量达到最高，为146.7349mg/g。

用扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)分别观察了两株抗性菌株吸附Zn前后的变化。菌株葡萄座腔菌P-L12(图11)其菌丝在吸附Zn前后形态变化较明显，在Zn吸附前，其菌丝表面较光滑，而在Zn吸附后，菌丝出现皱缩现象，这可能是Zn胁迫对菌丝产生了胁迫作用；菌株燕麦镰刀菌C-J1(图12)Zn吸附前菌株菌丝表面有毛状附着物，Zn吸附后毛状附着物减少，且部分菌丝的直径有所增加。

采用透射电镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)对抗性菌株Zn吸附前后的内部结构进行了观察。菌株葡萄座腔菌P-L12(图13)在Zn吸附前，各细胞排列较紧密，细胞多为不规则形状，而在Zn吸附后，各细胞间间隙增大，散在排列，且细胞多为圆形或椭圆形，同时细胞内黑色物质明显增多，这可能是由于细胞壁对Zn产生了吸附，使得Zn在细胞中积累导致；菌株燕麦镰刀菌C-J1(图14)在Zn吸附前，菌株的细胞聚集在一起，细胞间间隙不明显，可看见细胞中颜色较胞壁深，在Zn吸附后细胞间间隙明显，且部分细胞壁的颜色较胞内深，初步推断可能细胞壁上的某个基团对Zn有吸附作用所致。

通过FTIR分析抗性菌株在吸附Zn前后菌丝细胞中吸附基团的变化。分析结果显示，菌株燕麦镰刀菌C-J1在Zn吸附前，菌丝在3306.04cm^-1处的宽吸收峰为-NH的伸缩振动峰和-OH基团的吸收峰，在3009.29cm^-1、2925.31和2854.86cm^-1处的吸收峰为-CH₂和-CH₃基团，在1746.41和1655.40cm^-1处的强吸收峰为-C＝O基团，可能为酰胺，在1153.38和1079.84cm^-1处出现的吸收峰为P＝O的伸缩振动，1035.03cm^-1处为P-O-C基团的伸缩振动，对应C-OH和P＝O。在Zn吸附后，3320.80cm^-1处出现的宽吸收为-NH或-OH的吸收峰，相比于吸附前，吸附后在3000cm^-1处仅产生了两个吸收峰，且在1600-1700cm^-1左右产生的-C＝O基团的峰特征不明显，说明酰胺基团对Zn吸附产生了一定的作用；同时，吸附后在960.04cm^-1出现的吸收峰则说明了羧基对吸附也产生了一定的作用。由此可初步推断出，菌株燕麦镰刀菌C-J1在Zn吸附前后可能含有的基团有羟基、胺基、羧基和磷酸基团等。

菌株葡萄座腔菌P-L12在葡萄座腔菌P-L12吸附前，在3280.44cm^-1处出现的宽吸收峰为-NH基团或-OH基团的吸收峰，在2926.51和2854.71cm^-1处的强吸收为-CH₂和-CH₃基团，在1745.29和1651.86cm^-1处的吸收峰-C＝O基团，在1131.78和1056.61cm^-1处的吸收峰说明可能含有C-OH基团和P＝O。在Zn吸附后，在3306cm^-1出现的宽吸收提示含有-NH和-OH基团，较吸附前，在1748和1655cm^-1处出现的强吸收说明-C＝O基团在吸附前后起了一定的作用，同时在吸附前960.04cm^-1处的吸收峰羧基在Zn吸附后，羧基作用不明显。因此可推断出，菌株葡萄座腔菌P-L12可能含有胺基、羟基、羧基和磷酰基等。

本试验对筛选的二株具有重金属抗性菌株的菌丝进行Zn吸附研究，研究发现，在两株抗性菌株细胞中分别存在对Zn具有吸附作用的官能团-OH、-COOH、-NH、-C＝O和磷酸基团，对Zn具有良好的吸附能力。

实施例4

燕麦镰刀菌C-J1；葡萄座腔菌P-L12。

培养基采用PDA培养基和MNN培养基。采用250mL的锥形瓶，分别装入100mL的MMN液体培养基，添加10mmol/L的Zn母液(ZnSO₄·7H₂O)。121℃灭菌30min后，将各供试菌株用无菌打孔器制成6mm的菌块，放入培养瓶内，28℃，120rpm培养7d后，收集菌丝，抽滤去除水分，得到新鲜菌丝，放入-20℃冰箱备用。

采用南京生物工程研究所生产的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行测定。

按照南京建成生物工程研究所生产的过氧化物酶(POD)测定试剂盒的说明操作。

根据羟胺法，采用南京建成生物工程研究所生产的SOD测定试剂盒进行SOD活性的测定。

采用南京建成生物工程研究所生产的过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒进行CAT活性的测定。

按照南京建成生物工程研究所的抗坏血酸过氧化物酶(APX)测定试剂盒的说明书操作。

按照南京建成生物工程研究所的谷胱甘肽(GSH)(除蛋白法)测定试剂盒的说明书操作。

根据硫代巴比妥酸(TBA)法，采用南京建成生物工程研究所生产的丙二醛(MDA)测定试剂盒测定菌株中MDA的含量。

用GraphPad Prim 8软件计算平均值及标准偏差，并进行绘图，用SPSS 20.0对数据进行差异性检验分析。

微生物在适应重金属污染胁迫的过程中，其蛋白质的合成会受到影响，以此来适应新的环境。本研究发现，Zn两株抗性菌株均表现为含Zn组可溶性蛋白含量较空白组可溶性蛋白的含量低。由图15可知，对菌株燕麦镰刀菌C-J1，含Zn组中可溶性蛋白含量为0.5433mgprot/ml，较空白组降低了7.9％；对菌株葡萄座腔菌P-L12，含Zn组中可溶性蛋白含量为0.4576mgprot/ml，较空白组降低了20.3％。

由图16可知，Zn处理条件下，各菌株间差异不显著。对菌株燕麦镰刀菌C-J1，其在Zn处理条件下SOD酶的活性为89.6549U/mgprot，较空白组增加了127％；对菌株葡萄座腔菌P-L12，其在Zn处理下SOD酶活性为76.6905U/mgprot，较空白组增加了37％。

由图17可知，Zn处理条件下，各菌株间POD酶活性差异不显著。菌株燕麦镰刀菌C-J1在Zn处理下POD酶活性为2.3925U/mgprot，较空白组增加了52％；菌株葡萄座腔菌P-L12在Zn条件下POD酶活性为2.2920U/mgprot，较不含Zn组增加了45％。

由图18可知，对于菌株燕麦镰刀菌C-J1，Zn处理组CAT酶活性为13.0719U/mgprot，较空白增加了69％；对菌株葡萄座腔菌P-L12，Zn处理组CAT酶活性为7.0173U/mgprot，较未加Zn组增加了26％。

由图19所示，加Zn处理下，各菌株间GSH含量差异不显著。加Zn处理组中，菌株燕麦镰刀菌C-J1的GSH的含量为68.4745μmol/gprot，比空白组增加了19％；在菌株葡萄座腔菌P-L12中，Zn处理组GSH的含量为66.553μmol/gprot，较空白组增加了39％。

由图20可知，Zn处理条件下各菌株间差异不显著，菌株燕麦镰刀菌C-J1 Zn处理组APX酶活性为0.1308U/mgprot，较空白组增加了54％；菌株葡萄座腔菌P-L12含Zn组APX酶活性为0.1915U/mgprot，比空白组增加了21％。

由图21所示，在Zn处理条件下，菌株燕麦镰刀菌C-J1其MDA的含量在Zn处理下为4.5989nmol/mgprot，比空白组增加69％；菌株葡萄座腔菌P-L12在Zn处理下MDA的含量为6.1626nmol/mgprot，较空白组增加了355％，远远高于空白组中的含量。

实施例5

在超净工作台中，将保存在斜面的燕麦镰刀菌C-J1；葡萄座腔菌P-L12菌株用接种环转接至新鲜的PDA培养基平板，在28℃条件下培养一个星期。

以马铃薯葡萄糖水26g：去离子水1000mL的配比配制液体培养基，搅拌均匀后，分装在250mL三角瓶中，每瓶装量为150mL，饱和蒸汽灭菌(0.1MPa，121℃，30min)，备用。在超净工作台中，用打孔器在平板平面上取若干块大小相同的圆形菌块，并将菌块接种至灭过菌的三角瓶中发酵，每瓶投入6个菌块。将三角瓶放在摇床中，28℃、200rpm振荡培养14d。

发酵培养14d后，将相同菌种发酵液合并，121℃高温灭菌30min，使之失去活力，滤液减压浓缩，冷冻干燥得菌株诱导子，配成不同浓度的MS诱导子培养基。

将拟南芥种子消毒后接种至MS培养基上。置于4℃冰箱春化3天后，取出在22±2℃，16h光照8h黑暗的光照培养箱中培养。选取长势一致的4d苗挑至含葡萄座腔菌P-L12和燕麦镰刀菌C-J1诱导子0.5g/L，2.5g/L的MS培养皿(高浓度H，低浓度L)，每皿4苗。25±2℃，16h光照8h黑暗的光照培养箱中培养，7d后统计主根长(mm)、侧根数，14d后收获植株称取鲜重计算生物量(mg)。

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较。取3次重复平均值。

结果表明，由图22-24所示，菌株燕麦镰刀菌C-J1诱导子和菌株葡萄座腔菌P-L12诱导子2.5mg/mL时能显著增加拟南芥侧根数，增加植株鲜重生物量。与空白组相比，葡萄座腔菌P-L12-H诱导子(2.5mg/mL)增加生物量达65.2％(P<0.001)，显示对拟南芥具有很好的促进生长作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> 重金属Zn抗性构树内生真菌及其应用

<130> /

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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Claims (3)

1.一种构树内生真菌，其特征在于，所述构树内生真菌的保藏号为CCTCC NO: M2021155或CCTCC NO: M 2021156。

2.权利要求1所述的构树内生真菌修复土壤重金属Zn污染的用途。

3.权利要求1所述的构树内生真菌在重金属Zn污染生态修复中的用途。