CN114223667A - 含氮双膦酸盐在抑制卵菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含氮双膦酸盐在抑制卵菌中的应用。本发明首次发现含氮双膦酸盐具有抑制卵菌的活性，帕米膦酸二钠盐能够显著降低大豆疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉菌丝的生长，并具有抑制大豆疫霉产孢、致病的能力，对部分卵菌具有广谱抑菌作用，可作为潜在的抑制剂用于大豆疫霉及其它卵菌的防控。吡咯类杀菌剂作用于羊毛甾醇14α‑去甲基化酶，抑制甾醇的合成达到杀菌目的。霜霉目卵菌缺少吡咯类杀菌剂作用靶标，对此类杀菌剂不敏感。本发明发现的含氮双膦酸盐作用于甾醇合成上游甲羟戊酸途径，抑制异戊二烯类物质的合成，起到抑制卵菌的作用，从理论上扩大了防控卵菌的可用靶标和化学药剂。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防治领域，具体地说，涉及含氮双膦酸盐在抑制卵菌中的应用。
背景技术
卵菌(oomycete)属于茸鞭生物界(Stramenopila)、卵菌门(Oomycota)，是一类数量庞大的真核微生物。卵菌形态与真菌相似，呈丝状生长；生活史中无性繁殖产生孢子囊和游动孢子，有性生殖产生卵孢子。卵菌细胞壁主要成分为纤维素、营养体为二倍体、减数分裂在配子囊配合时进行、赖氨酸通过二氨基庚二酸合成途径合成、线粒体为管状嵴、细胞膜不含麦角固醇，其生理生化与真菌存在显著区别。分子水平系统发育分析发现卵菌与硅藻、褐藻等植物的亲缘关系较近，而与真菌的亲缘关系较远。大部分霜霉目卵菌是重要的植物病原菌，能够侵染数百种植物，导致农业、林业生产的严重经济损失。例如，大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起大豆根腐病。目前，该病害在中国黑龙江省、美国、巴西、阿根廷等主要的大豆生产地发生严重，发病后一般导致30％～50％的减产，严重情况下甚至绝收，每年全世界导致的经济损失达20亿美元。致病疫霉(Phytophthora infestans)引起马铃薯晚疫病，该病害1845年首次在爱尔兰爆发，并导致了爱尔兰饥荒。目前，马铃薯晚疫病仍然是马铃薯生产中的毁灭性病害，每年造成的经济损失达50亿美元。辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、终极腐霉(Pythium ultiminum)导致辣椒、南瓜、黄瓜等蔬菜作物病害，损失十分严重。由于卵菌缺乏甾醇合成途径大部分基因，以羊毛甾醇14α-去甲基化酶为作用靶标的吡咯类杀菌剂对卵菌无效。甲霜灵类杀菌剂使用超过30年，并由于使用不规范，导致抗药性风险持续上升，发掘防治卵菌病害的靶标及化学药剂，制定植物卵菌病害的长期防控策略尤为重要。
含氮双膦酸盐(nitrogen-containing bisphosphonates,N-BPs)用于治疗破骨细胞过度骨吸收导致的人类骨骼疾病，已经使用50余年。帕米膦酸二钠盐(pamidronate)作用于甲羟戊酸合成途径(mevalonate pathway,MVA pathway)，阻止下游异戊二烯的合成。目前，未见将帕米膦酸二钠盐应用于卵菌及其所致植物病害防治的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供含氮双膦酸盐在抑制卵菌中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供含氮双膦酸盐在抑制卵菌及其所致植物病害中的应用。
优选地，所述含氮双膦酸盐为帕米膦酸盐，更优选帕米膦酸二钠盐。
帕米膦酸二钠盐的结构如下：
化学名称:disodium；[3-amino-1-hydroxy-1-[hydroxy(oxido)phosphoryl]propyl]-hydroxyphosphinate
本发明中，所述卵菌包括但不限于大豆疫霉(Phytophthora sojae)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、终极腐霉(Pythium ultimum)等。
进一步地，所述应用包括：
1)降低卵菌的菌丝生长速度；
2)抑制卵菌孢子囊的产生；
3)降低卵菌卵孢子的产量；
4)抑制卵菌游动孢子的致病能力；
5)抑制大豆疫霉根腐病。
本发明还提供含氮双膦酸盐在制备卵菌抑制剂和用于防治植物卵菌病害的药剂中的应用。
所述植物卵菌病害包括但不限于大豆疫霉根腐病。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次发现含氮双膦酸盐具有抑制卵菌的活性，帕米膦酸二钠盐能够显著降低大豆疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉菌丝的生长，并具有抑制大豆疫霉产孢、致病的能力，对部分卵菌具有广谱抑菌作用，可作为潜在的抑制剂用于大豆疫霉及其它卵菌的防控。帕米膦酸二钠盐作用于甲羟戊酸途径，抑制下游类异戊二烯合成。卵菌中甲羟戊酸途径保守，在霜霉目和水霉目卵菌中均存在，以该途径为防控靶标及有效抑制剂的筛选结果，弥补生产中吡咯类杀菌剂的不足，扩大了防控卵菌的可用靶标和杀菌剂范围。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉菌落和生长速率。
图2为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下辣椒疫霉菌落和生长速率。
图3为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下终极腐霉菌落和生长速率。
图4为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉孢子囊形态和产量。
图5为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉卵孢子形态和产量。
图6为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉游动孢子休止率。
图7为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉菌丝和游动孢子致病能力。
图8为本发明较佳实施例中不同浓度帕米膦酸二钠盐处理下大豆疫霉根腐病的发病率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的帕米膦酸盐溶液的配制方法为：称取帕米膦酸二钠盐，使用无菌水溶解，终浓度为20mg/ml，使用时培养基中加入母液至终浓度。
帕米膦酸二钠盐购自北京索莱宝科技有限公司。
大豆疫霉为(基因组测序)标准菌株P6497，由南京农业大学提供。参见Tyler,B.,et al.(2006)."Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins andmechanisms of pathogenesis."Science 313(5791):1261.
辣椒疫霉为(基因组测序)标准菌株LT263，由南京农业大学提供。参见Cui,C.,etal.(2019)."Draft Assembly of Phytophthora capsici from Long-Read SequencingUncovers Complexity."Mol Plant Microbe Interact 32(12):1559-1563.
终极腐霉为(基因组测序)标准菌株DAOM BR144，由南京农业大学提供。参见Levesque,C.A.,et al.(2010)."Genome sequence of the necrotrophic plantpathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms andeffector repertoire."Genome Biol 11(7):R73.
实施例1帕米膦酸盐溶液抑菌实验
1、抑制大豆疫霉菌、辣椒疫霉和终极腐霉菌丝生长
向V8培养基中分别添加终浓度为0.2、0.4、0.8mg/ml的帕米膦酸二钠盐，在培养基中心接种直径5mm大豆疫霉P6497菌饼，25℃黑暗培养3d。经计算，对照平板上大豆疫霉菌丝生长速度为5.46mm/d，在0.2、0.4、0.8mg/ml的帕米膦酸二钠盐处理下，生长速度分别为4.44mm/d，3.03mm/d和2.49mm/d。培养基中添加不同浓度的帕米膦酸二钠盐，显著降低了大豆疫霉的菌丝生长速度(图1)。
终浓度0.2、0.4、0.8mg/ml帕米膦酸二钠盐处理下，辣椒疫霉LT263菌丝生长受到不同的影响。经计算，对照平板上辣椒疫霉菌丝生长速度为6.22mm/d，在0.2、0.4、0.8mg/ml的帕米膦酸二钠盐处理下，生长速度分别为5.42mm/d，4.88mm/d和3.72mm/d。培养基中添加不同浓度的帕米膦酸二钠盐，显著降低了辣椒疫霉的菌丝生长速度(图2)。
终浓度0.8、1.2、1.6mg/ml帕米膦酸二钠盐处理下，终极腐霉DAOM BR144菌丝生长受到不同的影响。经计算，对照平板上终极腐霉菌丝生长速度为33.3mm/d，在0.8、1.2、1.6mg/ml的帕米膦酸二钠盐处理下，生长速度分别为26.7mm/d，11.2mm/d和5.1mm/d。培养基中添加不同浓度的帕米膦酸二钠盐，显著降低了终极腐霉的菌丝生长速度(图3)。
根据抑菌实验计算帕米磷酸二钠盐对大豆疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉的毒力方程及致死中浓度，结果见表1。
表1
2、抑制大豆疫霉孢子囊的产生
将帕米膦酸二钠盐溶于水中，分别配制浓度为0.2、0.4、0.8mg/ml的帕米膦酸二钠盐溶液，刺激大豆疫霉菌丝产生孢子囊。结果显示，使用纯水诱导大豆疫霉产生孢子囊时，平均产生133个孢子囊；使用0.2mg/ml帕米膦酸二钠盐溶液诱导，平均产生孢子囊25个；使用0.4mg/ml帕米膦酸二钠盐溶液诱导，平均产生孢子囊6个；而使用0.8mg/ml帕米膦酸二钠盐溶液诱导，平均产生孢子囊2个。孢子囊的形态无明显变化(图4)。
3、降低大豆疫霉卵孢子的产量
向V8培养基中添加帕米膦酸二钠盐，终浓度为0.2、0.4、0.8mg/ml，在培养基中心接种直径5mm大豆疫霉菌饼，25℃黑暗培养30d，统计卵孢子的产量。对照组(培养基中不添加帕米膦酸二钠盐)大豆疫霉产生卵孢子的平均数量为933个；在含有0.2mg/ml帕米膦酸二钠盐的V8培养基中，产生平均卵孢子的数量为104个；在含有0.4mg/ml帕米膦酸二钠盐的V8培养基中，产生平均卵孢子的数量为50个；在含有0.8mg/ml帕米膦酸二钠盐的V8培养基中，完全不能产生卵孢子(图5)。
4、促进大豆疫霉游动孢子的休止
制备新鲜的大豆疫霉游动孢子悬浮液，向游动孢子悬浮液中添加帕米膦酸二钠盐，终浓度为25、50、100、200μg/ml，静置1h后统计游动孢子的休止率。结果显示，对照组游动孢子休止率为32.9％；25μg/ml浓度处理下，游动孢子休止率为36.3％；在50和100μg/ml浓度处理下，休止率为68.2％和70.1％；在200μg/ml浓度处理下，休止率上升至97.8％(图6)。
5、抑制大豆疫霉致病能力
大豆疫霉接种至含有终浓度为0.2、0.4、0.8mg/ml帕米磷酸二钠盐的V8平板上，生长5天后，在菌落边缘取直径5mm的菌丝块，接种至大豆黄化苗下胚轴；另取经过0.2、0.4、0.8mg/ml帕米膦酸二钠盐处理的5μL游动孢子悬浮液，接种至大豆黄化苗下胚轴，25℃黑暗培养48h，统计病斑长度。使用菌丝块接种，对照处理病斑平均长度为52mm；0.2mg/ml浓度处理下病斑平均长度为42mm；0.4mg/ml浓度处理下病斑平均长度为31mm；0.8mg/ml浓度处理下病斑平均长度为4.6mm。使用游动孢子接种，对照处理病斑平均长度为42.8mm；0.2mg/ml浓度处理下病斑平均长度为38.6mm；0.4mg/ml浓度处理下，病斑平均长度为1.6mm；0.8mg/ml浓度处理下，病斑平均长度为2mm(图7)。
实施例2帕米膦酸盐降低大豆疫霉根腐病发病率
大豆疫霉P6497接种至含有终浓度为0.2、0.4、0.8mg/ml帕米磷酸二钠盐的V8平板上，生长5天后，在菌落边缘取直径5mm的菌丝块。播种大豆感病品种合丰47，25℃，16h光照/8h黑暗条件下，生长2周至第一对真叶展开。在大豆幼苗的下胚轴用手术刀纵切一道伤口，将经过不同浓度帕米膦酸二钠盐处理的大豆疫霉菌丝块接种至伤口，喷水保湿24h后，转入正常的条件，培养3天后统计发病。结果表明，对照处理(浓度0mg/ml)的大豆全部发病且倒伏，发病率为100％；0.2mg/ml浓度处理下发病率降至60％；0.4、0.8mg/ml浓度处理下发病率为0(图8)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.含氮双膦酸盐在抑制卵菌及其所致植物病害中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含氮双膦酸盐为帕米膦酸盐。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含氮双膦酸盐为帕米膦酸二钠盐。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卵菌选自大豆疫霉(Phytophthorasojae)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、终极腐霉(Pythium ultimum)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
1)降低卵菌的菌丝生长速度；
2)抑制卵菌孢子囊的产生；
3)降低卵菌卵孢子的产量；
4)抑制卵菌游动孢子的致病能力；
5)抑制大豆疫霉根腐病。
6.含氮双膦酸盐在制备卵菌抑制剂和用于防治植物卵菌病害的药剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含氮双膦酸盐为帕米膦酸盐。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含氮双膦酸盐为帕米膦酸二钠盐。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述卵菌选自大豆疫霉(Phytophthorasojae)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、终极腐霉(Pythium ultimum)。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物卵菌病害为大豆疫霉根腐病。
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