CN114217071A - 一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒 - Google Patents

一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明公开的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，包括第一试剂R1和第二试剂R2；R1包括Hepes‑NaOH缓冲液、NaCl、聚乙二醇12000、吐温‑20、去铁胺、兔多克隆抗体阻断剂；R2包括缓冲液、吐温‑20、200nm羧基胶乳、350nm羧基胶乳、保护剂、FER兔多克隆抗体。本发明可实现FER检测范围1.5‑2200ng/ml的线性范围；2ng/ml重复性CV<10％；临床样本测试结果与罗氏铁蛋白测试结果相关性系数>0.95。

Description

一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒。
背景技术
铁蛋白是铁贮存于人体的主要形式之一。具有结合铁和贮备铁能力，以维持体内铁的供应和血红蛋白的相对稳定。血清铁蛋白测定是检查体内铁缺乏的最灵敏的指标，用于诊断缺铁性贫血、肝病等，也是恶性肿瘤的标志物之一。
缺铁性贫血是临床上较为常见的贫血，其主要原因是铁的缺乏。近年来研究发现，铁蛋白是缺铁性贫血的一个特异性指标，缺铁性贫血的发生可分为三个阶段，第一阶段是缺铁期，贮存铁减少，血清铁蛋白开始下降，其它铁生化指标无变化；第二阶段是铁不足的红细胞生成期，贮存铁耗尽，血清铁蛋白降低，转铁蛋白、血清铁降低，红细胞形态正常；第三阶段是缺铁性贫血期。除上述各指标改变外，伴有低色素小红细胞改变。由于血清铁测定误差较大，一日之内不同时间测定同一个体差异较大，且易受机体生理情况的影响；而血清铁蛋白一日间波动较少，特别是在储存铁耗尽前或贫血发生前，其浓度即已降低，比血清铁和转铁蛋白的浓度更能反映体内储存铁的情况。因此，血清铁蛋白测定被许多临床专家称为是诊断缺铁性贫血最可靠和最敏感的指标，特别是可及早诊断体内铁缺乏使之得到早期治疗。
血清铁蛋白的正常值分为男性：15-200μg/L；女性：12-150μg/L；新生儿：25-200μg/L；目前大多以成人血清FER浓度<15ng/ml作为缺铁指标。但是缺铁性贫血及严重失血患者的FER浓度通常低于10ng/ml，甚至低于5ng/ml；而且据相关研究表明：“选取的研究对象若以14ng/ml作为诊断临界点，敏感度只有41.6％，特异度达96.2％，虽然有较高的特异度，但如此低的灵敏度，限制了在临床中的应用；若选取36ng/ml作为诊断临界点，灵敏度从41.6％上升到85.1％，但特异度却从96.2％下降到80.1％”(参见实用医学杂志2008年第24卷第23期《血清铁蛋白测定对缺铁性贫血的诊断价值探讨》)。因此，无论是选取14ng/ml还是以36ng/ml作为诊断临界点，都会造成一定比例的漏检。究其原因是市面上现有厂家的试剂低端灵敏度不足，无法准确检测出样本中含量较低的血清铁蛋白。
目前市面上常用的铁蛋白检测方法学和平台主要有发光免疫分析、特定蛋白检测以及纯投射生化检测。其中，德赛的纯透射生化铁蛋白检测，检测范围低限仅能达到16μg/L；西门子和贝克曼的特定蛋白仪铁蛋白检测，检测范围低限虽然能达到10μg/L，但检测高限只有450-600μg/L，对于急性炎症、肾病，甚至恶性肿瘤患者来说远远不够；另外罗氏的发光免疫法铁蛋白检测，灵敏度检测范围低限能达到0.5μg/L，但发光检测速度太慢，成本太高。
透散射一体检测法是2020年新兴的、在原有胶乳免疫比浊法基础上升级而来的新方法学，该方法学的实现需要硬件基础和试剂基础两部分支撑。
硬件设备方面，日本Hitachi高新公司于2013年开发的透散射一体仪器(如日立3500等)，在2015年面市且于2019年2月获得NMPA医疗器械注册证。透散射一体机在传统生化分析仪透射检测的基础上，增加了散射光检测模块，同一个检测，在0.7s内完成透射光和散射光检测，分别计算信号值，然后通过软件融合二者的结果。IVD领域的常识是散射检测灵敏度高，但是检测范围很窄，无法区分高值；透射检测灵敏度低，低值检测重复性差，但检测范围广，能有效区分高值；透散射一体法通过结果融合，低浓度区域使用散射结果，高浓度区域使用透射结果，继承了透射和散射免疫比浊的优点，规避了缺点，可以得到高灵敏度，高线性范围的检测。透散射一体法仅通过透散射一体机硬件能力和软件算法，平均能够提升4倍灵敏度。
试剂技术方面，配套透散射一体机的胶乳比浊透散射一体法检测试剂直到2020年下半年才逐渐出现。胶乳比浊试剂能够用于透散射一体机的前提是：1、对于同一样本，在透散射重合区(融合区)，透射和散射检测结果一致，即偏差小于10％；2、由于微球，试剂配方等多方面问题，并不是所有的胶乳比浊试剂在日立透散射一体机上均能获得灵敏度提升，配方不适合的试剂，甚至会出现灵敏度下降导致测定重复性(精密度)降低；3、散射检测HOOK效应比透射更加严重，原本在透射上不能解决HOOK效应问题的试剂，强行应用到透散射一体法上的话，将导致更多被低估和假阴性结果。
传统的透射比浊试剂产品应用到透散射一体机上，会出现透射结果与散射结果不一致情况；从而无法达到临床需求。基于透射平台开发的胶乳比浊试剂直接应用到透散射一体法上会有很多新问题。柏荣诊断和Hitachi高新公司的研发人员共同发现，传统透射平台试剂在增敏剂种类和浓度选择，以及表面活性剂选择方面没有问题的原料，直接应用到散射平台上，则会导致非特异性信号值出现，从而造成散射结果和透射结果不一致。
因此，提供一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，包括第一试剂R1和第二试剂R2；
所述第一试剂R1包括如下浓度的组分：100mM Hepes-NaOH缓冲液pH 6.8-7.5，NaCl 600-2000mM，聚乙二醇120002g/L，吐温-2016ml/L，去铁胺8-15g/L，兔多克隆抗体阻断剂20-40ml/L；
所述第二试剂R2包括如下浓度的组分：50-200mM缓冲液pH 7.0-7.6，吐温-204-16ml/L，200nm羧基胶乳1.6-2.4g/L，350nm羧基胶乳1.0-1.8g/L，保护剂10-90g/L，FER兔多克隆抗体20-40mg/L。
进一步，所述第一试剂R1和所述第二试剂R2还包括防腐剂，所述防腐剂为1g/L叠氮钠或0.5ml/L PC300。
进一步，所述第二试剂R2中，所述缓冲液为BES-NaOH缓冲液，磷酸盐缓冲液或甘氨酸-Tris缓冲液。
进一步，所述第二试剂R2中，所述保护剂为10-30g/L蔗糖、10-30g/L海藻糖、10-30g/L果糖中的至少一种。
进一步，所述200nm羧基胶乳和350nm羧基胶乳按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合。
进一步，所述第二试剂R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理；即R2是通过添加氨基酸支架进行增敏处理过的。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
透散射一体法硬件检测速度等同于传统生化分析仪，相较于化学发光法，检测速度快；相较于荧光和胶体金层析以及微流控方法，检测重复性更好；另外，该机器可以配套检验流水线使用，利于实验室自动化。
研究人员发现，由于铁蛋白是一个特殊的空心球状颗粒，由分别为19KD铁蛋白轻链(L)和21KD的铁蛋白重链(H)两种亚基复合而成。H亚基含有一个氧化Fe2+的氧化中心，L亚基负责铁蛋白空腔形成。本发明试剂盒采用的是多克隆抗体检测FER，FER多克隆抗体识别的抗原决定簇主要位于L亚基上。让L亚基更充分暴露在外表面，更有利于其与R2中的铁蛋白多克隆抗体结合，从而更有效的提高亲和力，使试剂灵敏度更高，特异性更好。
因此研究人员推断，在试剂1中加入能够充分暴露铁蛋白L亚基的物质，能够有效提升多克隆抗体FER试剂的检测灵敏度和特异性。本发明试剂盒选用治疗贫血常用药去铁胺的分析纯工业用品，添加到试剂1中，配合柏荣诊断灵敏度的专利技术2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》和2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》的技术，在适用于透散射一体法的特定表面活性剂和增敏剂配方下，有效提高使用多克隆抗体进行FER透散射一体法检测的灵敏度，灵敏度相较对照进一步提升40％-75％，能够达到临床使用中2ng/ml精密度CV<10％的要求，且透射和散射结果一致(偏差小于10％)。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，检测限低于1.5ng/ml，2ng/ml检测精密度CV小于10％；透射与散射结果偏差小于10％；且能保证临床结果与化学发光法相关性系数大于0.95。本发明相较于罗氏发光免疫检测速度快，罗氏发光免疫检测40-60min出结果，本发明采用透散射一体机的检测方法仅需10-15min即可出结果；且本发明方法通量大(透散射一体法800-5400test/h VS发光免疫200-400test/h)，可以流水线自动化，成本低(透散射一体法仅需罗氏发光免疫检测法成本的20-25％)，本发明试剂盒能够替代进口罗氏试剂盒，满足临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为对比例1与罗氏铁蛋白相关性；
图2附图为对比例2与罗氏铁蛋白相关性；
图3附图为本发明实施例1与罗氏铁蛋白相关性；
图4附图为本发明实施例2与罗氏铁蛋白相关性；
图5附图为本发明实施例3与罗氏铁蛋白相关性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对比例1
第一试剂R1含有如下浓度的组分：
100mM Hepes-NaOH缓冲液，pH7.0
NaCl 1800mM
聚乙二醇120006g/L
吐温-205ml/L
去铁胺不添加
兔多克隆抗体阻断剂40ml/L(菲鹏生物E-015)
防腐剂0.5ml/L PC300
对应的R2含有如下浓度的组分：
50mM PBS pH7.4
吐温-2016ml/L
200nm羧基胶乳2.4g/L
350nm羧基胶乳1.8g/L
保护剂(蔗糖30g/L，海藻糖10g/L，果糖10g/L)
FER兔多克隆抗体40mg/L(成都汇瑞新源生物)
防腐剂0.5ml/L PC300
其中，羧基胶乳均按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合；R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理；具体步骤如下：
先按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合：
步骤一、分别使用500ml的自产200nm和350nm胶乳溶液，包括10％质量浓度的粒径为200nm和350nm的胶乳，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包加入蒸馏水分别进行错流过滤，完成8倍换液。
步骤二、将步骤一得到的胶乳溶液分别加入到两个容量为1000ml的四口反应釜中，分别加入1.5g氯化锂和0.4g十二烷基苯磺酸钠，反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，260rpm机械搅拌10min。然后分别通入氩气去除氧气5min后，分别加入0.15g过硫酸钾，二次引发微球胶乳内部的收敛聚合反应，继续在50℃的恒温中，260rpm机械搅拌下反应10h。
步骤三、将完成收敛聚合反应后的两种胶乳溶液分别加入50mM浓度、pH5.0的MES-NaOH溶液，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包进行错流过滤，完成16倍换液。
收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳的粒径D为200nm和350nm，因此换液后的胶乳溶液中胶乳的粒径D2＝0.78D＝156nm(前200)和273nm(前350)。
然后R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理；
配制300mM的尿素水溶液100ml，室温备用。
配制支架溶解液：100mMpH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM过硫酸钾溶液：即使用支架溶解液200ml溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：50mM pH7.4 PBS缓冲液，含16ml/L吐温-20，蔗糖30g/L，海藻糖10g/L，果糖10g/L，0.05％v/V防腐剂PC300，室温备用。
汇瑞新源FER多克隆抗体(14mg/ml)，离心方式换液(下述胶乳微球均为前一步骤已经二次收敛聚合过的胶乳微球)
(1)胶乳清洗：使用100mM的MES-NaOH缓冲液，pH5.5，离心换液胶乳微球2次；各取10ml，10％质量浓度的上述二次收敛聚合后的胶乳微球156nm(前200)和273nm(前350)，即两种胶乳各1g，22000rpm离心15min，去上清，使用10ml上述MES-NaOH缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，30mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的MES-NaOH缓冲液溶解后，各取1ml加入10ml已清洗的两种微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后的两种胶乳以22000rpm离心15min，去上清，加入20ml 100mM/L pH7.5的PBS缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取汇瑞新源FER抗体两份，加入到上述用PBS缓冲液复溶的已活化的两种胶乳溶液中，其中156nm(前200)加入1.2ml FER抗体(2.4g胶乳VS 40mg FER抗体)；273nm(前350)加入1.59ml FER抗体，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联(终体积156nm20ml，273nm 20.6ml)；
(5)R2改造：
1)取完成抗体偶联的两种胶乳各4ml，分别加入300mM尿素溶液各200μl，使得其尿素浓度在15mM；
2)两种胶乳分别22000rpm 15min离心，去2ml上清，即“换液50％”；
3)将X序列为EDED的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于35ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为156nm(前200)：1.2*14*4/20＝3.36mg、273nm(前350):1.59*14*4/20.6＝4.32mg；
分别向两种胶乳中加入溶解有氨基酸支架的溶液2ml，复溶，可以计算得抗体与支架的用量为1mg抗体对应156nm(前200)0.017mg、273nm(前350)0.0132mg氨基酸支架；
4)分别加入50mM过硫酸钾溶液0.6ml，即过硫酸钾摩尔量约为步骤1)中尿素量的50％。
5)37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
两种胶乳22000rpm离心15min后去全部上清，分别加入封闭清洗液156nm(前200)42ml(胶乳终浓度约4.8g/L)、273nm(前350)54ml(胶乳终浓度约3.6g/L)复溶，两种胶乳按体积1:1混合后室温混匀2小时备用(终浓度200nm羧基胶乳2.4g/L，350nm羧基胶乳1.8g/L)，即为成品R2。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
定标后测试2ng/ml精密度，测定40例罗氏铁蛋白检测试剂盒(电化学发光法)(以下简称罗氏铁蛋白)测值的临床样本，比较透散射融合区透散射结果差异。结果见表1-表5和图1。
表1
Figure BDA0003387099370000071
注：所用校准品为FER抗原配置成0.0ng/ml；30.0ng/ml；200.0ng/ml；500.0ng/ml；1000ng/ml；1500.0ng/ml；2200.0ng/ml浓度的标准品。空白：试剂空白(Reagentblank)。下同。
表2
Figure BDA0003387099370000072
表3
2ng/ml精密度
1.6
2.5
2.4
1.5
2.4
2.3
2
2.4
1.4
2.1
mean 2.06
STDEV 0.416867
CV 20.24％
表4
Figure BDA0003387099370000073
Figure BDA0003387099370000081
检测试剂盒空白限，确定本试剂最低检测限(LLD)＝0.355+3*0.499＝1.852ng/mL。
表5
Figure BDA0003387099370000082
Figure BDA0003387099370000091
注：散射20°检测范围为2.0-50.0ng/ml，超过500.0ng/ml报告>test，透射检测范围为35.0ng/ml-2200.0ng/ml，小于35.0ng/ml报告<test；透散射重叠区(融合区)为35.0-50.0ng/ml，软件输出设置小于50.0ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50.0ng/ml的样本报告透射结果。
结果显示，对比例1中2.0ng/ml处精密度CV 20.24％；试剂盒的最低检测限为1.85ng/ml；透散射重叠区样本透射与散射结果较多样本偏差>10％；最高偏差高达26.30％；临床结果与罗氏铁蛋白测得的结果相关性系数0.9193<0.95；难以达到临床使用标准。
对比例2
第一试剂R1含有如下浓度的组分：
100mM Hepes-NaOH缓冲液，pH7.0
NaCl 1800mM
聚乙二醇120002g/L
吐温-2016ml/L
去铁胺5g/L
兔多克隆抗体阻断剂40ml/L(菲鹏生物E-015)
防腐剂0.5ml/L PC300
对应的R2含有如下浓度的组分：
50mM PBS pH7.4
吐温-2016ml/L
200nm羧基胶乳2.4g/L
350nm羧基胶乳1.8g/L
保护剂(蔗糖30g/L，海藻糖10g/L，果糖10g/L)
FER兔多克隆抗体40mg/L(成都汇瑞新源生物)
防腐剂0.5ml/L PC300
其中，羧基胶乳胶乳均按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合；R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理。具体处理过程参见对比例1。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
定标后测试2.0ng/ml精密度，测定40例罗氏铁蛋白测值的临床样本，比较透散射融合区透散射结果差异。结果见表6-表10和图2。
表6
Figure BDA0003387099370000101
表7
Figure BDA0003387099370000102
表8
2ng/ml精密度
1.8
2.4
2.3
1.7
2.5
2.3
2.2
2.2
2.3
1.6
mean 2.13
STDEV 0.312872
CV 14.69％
表9
Figure BDA0003387099370000111
检测试剂盒空白限，确定本试剂最低检测限(LLD)＝0.185+3*0.339＝1.20ng/mL。
表10
Figure BDA0003387099370000112
Figure BDA0003387099370000121
注：散射20°检测范围为2.0-50.0ng/ml，超过500.0ng/ml报告>test，透射检测范围为35.0ng/ml-2200.0ng/ml，小于35.0ng/ml报告<test；透散射重叠区(融合区)为35.0-50.0ng/ml，软件输出设置小于50.0ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50.0ng/ml的样本报告透射结果。
结果显示，对比例2中30.0ng/ml处灵敏度(Δ散射光强度)362VS 252提升了43.7％；试剂盒的最低检测限降低至1.20ng/ml；透散射重叠区样本的透射与散射结果偏差都在10％以内；临床结果与罗氏铁蛋白测得的结果相关性系数0.974>0.95；能够满足临床使用标准；但是2.0ng/ml处精密度CV只有14.69％＞10％。
实施例1
第一试剂R1含有如下浓度的组分：
100mM Hepes-NaOH缓冲液，pH7.0
NaCl 1800mM
聚乙二醇120002g/L
吐温-2016ml/L
去铁胺10g/L
兔多克隆抗体阻断剂40ml/L(菲鹏生物E-015)
防腐剂0.5ml/L PC300
对应的R2含有如下浓度的组分：
50mM PBS pH7.4
吐温-2016ml/L
200nm羧基胶乳2.4g/L
350nm羧基胶乳1.8g/L
保护剂(蔗糖30g/L，海藻糖10g/L，果糖10g/L)
FER兔多克隆抗体40mg/L(成都汇瑞新源生物)
防腐剂0.5ml/L PC300
其中，羧基胶乳胶乳均按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合；R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理。具体处理过程参见对比例1。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
定标后测试2.0ng/ml精密度，测定40例罗氏铁蛋白测值的临床样本，比较透散射融合区透散射结果差异。结果见表11-表16和图3。
表11
Figure BDA0003387099370000131
表12
Figure BDA0003387099370000132
表13
Figure BDA0003387099370000133
Figure BDA0003387099370000141
表14
Figure BDA0003387099370000142
检测试剂盒空白限，确定本试剂最低检测限(LLD)＝0.075+3*0.192＝0.65ng/mL。
表15
Figure BDA0003387099370000143
Figure BDA0003387099370000151
注：散射20°检测范围为2.0-50.0ng/ml，超过500.0ng/ml报告>test，透射检测范围为35.0ng/ml-2200.0ng/ml，小于35.0ng/ml报告<test；透散射重叠区(融合区)为35.0-50.0ng/ml，软件输出设置小于50.0ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50.0ng/ml的样本报告透射结果。
结果显示，实施例1中30.0ng/ml处灵敏度(Δ散射光强度)440VS 252提升了74.6％；试剂盒的最低检测限降低至0.65ng/ml；透散射重叠区样本的透射与散射结果偏差都在10％以内；临床结果与罗氏铁蛋白测得的结果相关性系数0.9888>0.95；完全满足临床使用标准；且2.0ng/ml处精密度CV为8.56％＜10％。
实施例2
第一试剂R1含有如下浓度的组分：
100mM Hepes-NaOH缓冲液，pH6.8
NaCl 1500mM
聚乙二醇120002g/L
吐温-2016ml/L
去铁胺15g/L
兔多克隆抗体阻断剂20ml/L(菲鹏生物E-015)
防腐剂0.5ml/L PC300
对应的R2含有如下浓度的组分：
100mM BES-NaOH缓冲液pH7.0
吐温-2010ml/L
200nm羧基胶乳1.6g/L
350nm羧基胶乳1.0g/L
保护剂(蔗糖20g/L，海藻糖20g/L，果糖20g/L)
FER兔多克隆抗体20mg/L(成都汇瑞新源生物)
防腐剂0.5ml/L PC300
其中，羧基胶乳胶乳均按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合；R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理。具体步骤如下：
先按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合：
步骤一、分别使用500ml的自产200nm和350nm胶乳溶液，包括10％质量浓度的粒径为200nm和350nm的胶乳，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包加入蒸馏水分别进行错流过滤，完成8倍换液。
步骤二、将步骤一得到的胶乳溶液分别加入到两个容量为1000ml的四口反应釜中，分别加入1.5g氯化锂和0.4g十二烷基苯磺酸钠，反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，260rpm机械搅拌10min。然后分别通入氩气去除氧气5min后，分别加入0.15g过硫酸钾，二次引发微球胶乳内部的收敛聚合反应，继续在50℃的恒温中，260rpm机械搅拌下反应10h。
步骤三、将完成收敛聚合反应后的两种胶乳溶液分别加入50mM浓度、pH5.0的MES-NaOH溶液，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包进行错流过滤，完成16倍换液。
收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳的粒径D为200nm和350nm，因此换液后的胶乳溶液中胶乳的粒径D2＝0.78D＝156nm(前200)和273nm(前350)。
然后R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理；
配制300mM的尿素水溶液100ml，室温备用。
配制支架溶解液：100mMpH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM过硫酸钾溶液：即使用支架溶解液200ml溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：100mMpH7.0 BES-NaOH缓冲液，含10ml/L吐温-20，蔗糖20g/L，海藻糖20g/L，果糖20g/L，0.05％v/V防腐剂PC300，室温备用。
汇瑞新源FER多克隆抗体(14mg/ml)，离心方式换液(下述胶乳微球均为前一步骤已经二次收敛聚合过的胶乳微球)
(1)胶乳清洗：使用100mM的MES-NaOH缓冲液，pH5.5，离心换液胶乳微球2次；各取10ml，10％质量浓度的上述二次收敛聚合后的胶乳微球156nm(前200)和273nm(前350)，即两种胶乳各1g，22000rpm离心15min，去上清，使用10ml上述MES-NaOH缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，30mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的MES-NaOH缓冲液溶解后，各取1ml加入10ml已清洗的两种微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后的两种胶乳以22000rpm离心15min，去上清，加入20ml 100mM/L pH7.5的PBS缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取汇瑞新源FER抗体两份，加入到上述用PBS缓冲液复溶的已活化的两种胶乳溶液中，其中156nm(前200)加入0.9ml FER抗体(1.6g胶乳VS 20mg FER抗体)；273nm(前350)加入1.43ml FER抗体，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联(终体积156nm20ml，273nm 20.4ml)；
(5)R2改造：
1)取完成抗体偶联的两种胶乳各4ml，分别加入300mM尿素溶液各200μl，使得其尿素浓度在15mM；
2)两种胶乳分别22000rpm 15min离心，去2ml上清，即“换液50％”；
3)将X序列为EDED的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于45ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为156nm(前200)：0.9*14*4/20＝2.52mg、273nm(前350):1.43*14*4/20.4＝3.93mg；
分别向两种胶乳中加入溶解有氨基酸支架的溶液2ml，复溶，可以计算得抗体与支架的用量为1mg抗体对应156nm(前200)0.0176mg、273nm(前350)0.0113mg氨基酸支架；
4)分别加入50mM过硫酸钾溶液0.6ml，即过硫酸钾摩尔量约为步骤1)中尿素量的50％。
5)37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
两种胶乳22000rpm离心15min后去全部上清，分别加入封闭清洗液156nm(前200)62.5ml(胶乳终浓度约3.2g/L)、273nm(前350)98ml(胶乳终浓度约2.0g/L)复溶，两种胶乳按体积1:1混合后室温混匀2小时备用(终浓度200nm羧基胶乳1.6g/L，350nm羧基胶乳1.0g/L)，即为成品R2。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
定标后测试2.0ng/ml精密度，测定40例罗氏铁蛋白测值的临床样本，比较透散射融合区透散射结果差异。结果见表16-表20和图4。
表16
Figure BDA0003387099370000181
表17
Figure BDA0003387099370000182
表18
Figure BDA0003387099370000183
Figure BDA0003387099370000191
表19
Figure BDA0003387099370000192
检测试剂盒空白限，确定本试剂最低检测限(LLD)＝0.12+3*0.267＝0.92ng/mL。
表20
Figure BDA0003387099370000193
Figure BDA0003387099370000201
注：散射20°检测范围为2.0-50.0ng/ml，超过500.0ng/ml报告>test，透射检测范围为35.0ng/ml-2200.0ng/ml，小于35.0ng/ml报告<test；透散射重叠区(融合区)为35.0-50.0ng/ml，软件输出设置小于50.0ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50.0ng/ml的样本报告透射结果。
结果显示，实施例2中30.0ng/ml处灵敏度(Δ散射光强度)402VS 252提升了59.5％；试剂盒的最低检测限降低至0.92ng/ml；透散射重叠区样本的透射与散射结果偏差都在10％以内；临床结果与罗氏铁蛋白测得的结果相关性系数0.9802>0.95；能够满足临床使用标准；且2.0ng/ml处精密度CV为9.85％＜10％。
实施例3
第一试剂R1含有如下浓度的组分：
100mM Hepes-NaOH缓冲液，pH7.5
NaCl 2000mM
聚乙二醇120002g/L
吐温-2016ml/L
去铁胺8g/L
兔多克隆抗体阻断剂30ml/L(菲鹏生物E-015)
防腐剂1g/L叠氮钠
对应的R2含有如下浓度的组分：
200mM甘氨酸-Tris缓冲液pH7.6
吐温-205ml/L
200nm羧基胶乳2.0g/L
350nm羧基胶乳1.6g/L
保护剂(蔗糖10g/L，海藻糖10g/L，果糖30g/L)
FER兔多克隆抗体30mg/L(成都汇瑞新源生物)
防腐剂1g/L叠氮钠
其中，羧基胶乳胶乳均按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合；R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理。具体步骤如下：
先按照2017109869707《一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法》进行二次收敛聚合：
步骤一、分别使用500ml的自产200nm和350nm胶乳溶液，包括10％质量浓度的粒径为200nm和350nm的胶乳，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包加入蒸馏水分别进行错流过滤，完成8倍换液。
步骤二、将步骤一得到的胶乳溶液分别加入到两个容量为1000ml的四口反应釜中，分别加入1.5g氯化锂和0.4g十二烷基苯磺酸钠，反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，260rpm机械搅拌10min。然后分别通入氩气去除氧气5min后，分别加入0.15g过硫酸钾，二次引发微球胶乳内部的收敛聚合反应，继续在50℃的恒温中，260rpm机械搅拌下反应10h。
步骤三、将完成收敛聚合反应后的两种胶乳溶液分别加入50mM浓度、pH5.0的MES-NaOH溶液，分别通过两个Millipore公司的50KD截留孔径超滤膜包进行错流过滤，完成16倍换液。
收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳的粒径D为200nm和350nm，因此换液后的胶乳溶液中胶乳的粒径D2＝0.78D＝156nm(前200)和273nm(前350)。
然后R2按照常规化学偶联法进行生产后，按照2018114264906《一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法》进行灵敏度处理；
配制300mM的尿素水溶液100ml，室温备用。
配制支架溶解液：100mMpH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。
配制50mM过硫酸钾溶液：即使用支架溶解液200ml溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。
配制封闭清洗液：200mM pH7.6甘氨酸-Tris缓冲液，含5ml/L吐温-20，蔗糖10g/L，海藻糖10g/L，果糖30g/L，1g/L叠氮钠，室温备用。
汇瑞新源FER多克隆抗体(14mg/ml)，离心方式换液(下述胶乳微球均为前一步骤已经二次收敛聚合过的胶乳微球)
(1)胶乳清洗：使用100mM的MES-NaOH缓冲液，pH5.5，离心换液胶乳微球2次；各取10ml，10％质量浓度的上述二次收敛聚合后的胶乳微球156nm(前200)和273nm(前350)，即两种胶乳各1g，22000rpm离心15min，去上清，使用10ml上述MES-NaOH缓冲液复溶，然后再离心，去上清复溶，完成清洗备用；
(2)胶乳活化：以10ml上述清洗过的胶乳为例，称取50mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，30mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，用5ml上述清洗用的MES-NaOH缓冲液溶解后，各取1ml加入10ml已清洗的两种微球中，室温磁力搅拌混匀10min；
(3)活化后清洗：将步骤(2)活化后的两种胶乳以22000rpm离心15min，去上清，加入20ml 100mM/L pH7.5的PBS缓冲液复溶备用；
(4)抗体偶联：取汇瑞新源FER抗体两份，加入到上述用PBS缓冲液复溶的已活化的两种胶乳溶液中，其中156nm(前200)加入1.05ml FER抗体(2.0g胶乳VS 30mg FER抗体)；273nm(前350)加入1.34ml FER抗体，室温磁力搅拌3小时，完成抗体偶联(终体积156nm20ml，273nm 20.2ml)；
(5)R2改造：
1)取完成抗体偶联的两种胶乳各4ml，分别加入300mM尿素溶液各200μl，使得其尿素浓度在15mM；
2)两种胶乳分别22000rpm 15min离心，去2ml上清，即“换液50％”；
3)将X序列为EDED的氨基酸支架(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)1mg溶解于45ml支架溶解液中，可以计算得到每组实验中，抗体的质量约为156nm(前200)：1.05*14*4/20＝2.94mg、273nm(前350):1.34*14*4/20.2＝3.71mg；
分别向两种胶乳中加入溶解有氨基酸支架的溶液2ml，复溶，可以计算得抗体与支架的用量为1mg抗体对应156nm(前200)0.0151mg、273nm(前350)0.0120mg氨基酸支架；
4)分别加入50mM过硫酸钾溶液0.6ml，即过硫酸钾摩尔量约为步骤1)中尿素量的50％。
5)37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；
(6)封闭及清洗：
两种胶乳22000rpm离心15min后去全部上清，分别加入封闭清洗液156nm(前200)50ml(胶乳终浓度约4.0g/L)、273nm(前350)62ml(胶乳终浓度约3.2g/L)复溶，两种胶乳按体积1:1混合后室温混匀2小时备用(终浓度200nm羧基胶乳2.0g/L，350nm羧基胶乳1.6g/L)，即为成品R2。
所用仪器为日立透散射一体机，以Hitachi3500为例，方法透散射一体法；
上机参数：样本量4μl，R1加入量160μl；R2加入量80μl；
透射波长600nm散射角度20度；两点终点法18-34读点；
散射定标点0.0、30、200、500；
透射定标点：30、200、500、1000、1500、2200；
透散射融合区2-50ng/ml；
小于50ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50ng/ml的结果报告透射结果。
定标后测试2.0ng/ml精密度，测定40例罗氏铁蛋白测值的临床样本，比较透散射融合区透散射结果差异。结果见表21-表25和图5。
表21
Figure BDA0003387099370000231
表22
Figure BDA0003387099370000232
表23
2ng/ml精密度
2.1
1.8
2.1
1.9
2.2
2.3
2.1
2.3
2.2
1.8
mean 2.08
STDEV 0.187379591
CV 9.01％
表24
Figure BDA0003387099370000241
检测试剂盒空白限，确定本试剂最低检测限(LLD)＝0.125+3*0.275＝0.95ng/mL。
表25
Figure BDA0003387099370000242
Figure BDA0003387099370000251
注：散射20°检测范围为2.0-50.0ng/ml，超过500.0ng/ml报告>test，透射检测范围为35.0ng/ml-2200.0ng/ml，小于35.0ng/ml报告<test；透散射重叠区(融合区)为35.0-50.0ng/ml，软件输出设置小于50.0ng/ml的结果报告散射结果，大于等于50.0ng/ml的样本报告透射结果。
结果显示，实施例3中30.0ng/ml处灵敏度(Δ散射光强度)415VS 252提升了64.7％；试剂盒的最低检测限降低至0.95ng/ml；透散射重叠区样本的透射与散射结果偏差都在10％以内；临床结果与罗氏铁蛋白测得的结果相关性系数0.9884>0.95；能够满足临床使用标准；且2.0ng/ml处精密度CV为9.01％＜10％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂R1和第二试剂R2；
所述第一试剂R1包括如下浓度的组分：100mM Hepes-NaOH缓冲液pH 6.8-7.5，NaCl600-2000mM，聚乙二醇120002g/L，吐温-2016ml/L，去铁胺8-15g/L，兔多克隆抗体阻断剂20-40ml/L；
所述第二试剂R2包括如下浓度的组分：50-200mM缓冲液pH 7.0-7.6，吐温-204-16ml/L，200nm羧基胶乳1.6-2.4g/L，350nm羧基胶乳1.0-1.8g/L，保护剂10-90g/L，FER兔多克隆抗体20-40mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂R1和所述第二试剂R2还包括防腐剂，所述防腐剂为1g/L叠氮钠或0.5ml/L PC300。
3.根据权利要求1所述的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂R2中，所述缓冲液为BES-NaOH缓冲液，磷酸盐缓冲液或甘氨酸-Tris缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂R2中，所述保护剂为10-30g/L蔗糖、10-30g/L海藻糖、10-30g/L果糖中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，所述200nm羧基胶乳和350nm羧基胶乳为经过二次收敛聚合反应的胶乳。
6.根据权利要求1所述的一种高特异性透散射一体法铁蛋白胶乳比浊检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂R2为经增敏处理的试剂。
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