CN114214382A - 一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法及其产品，涉及蛋白胨制备领域；该方法包括以下步骤：新鲜鱼骨、新鲜牛骨和低温豆粕经预处理后，分别用复合酶酶解，再经浓缩后，分别得到鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液，再将所述鱼骨蛋白胨浓缩液、所述牛骨蛋白胨浓缩液和所述豆粕蛋白胨浓缩液按照干物质的重量比为(2‑3):5:(2‑3)进行混合，得到混合液，最后干燥成粉，得到所述发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨。本发明以新鲜鱼骨、新鲜牛骨和低温豆粕为原料制备出了一种发酵生产乳酸链球菌素的专用蛋白胨，有效提高了乳酸链球菌素的发酵水平。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白胨制备领域，特别是涉及一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法及其产品。
背景技术
乳酸链球菌素是从链球菌属的乳酸链球菌发酵产物提取制备的一类小分子多肽化合物，其对热稳定，食用后在消化道内很快被蛋白酶消化成氨基酸，不会产生抗性和过敏反应，因而被单独或与其它防腐剂复配后广泛应用在乳制品、肉制品、罐头制品、果汁和酒精饮料等多种食品中。与化学合成防腐剂相比，乳酸链球菌素具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。然而，目前乳酸链球菌素发酵水平还比较低，生产成本较高，高昂的价格限制了其在食品加工领域的广泛应用。
蛋白胨是微生物培养基的主要原料，蛋白胨是一种复杂的混合物。由各种氨基酸，多肽，胨，
组成，不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，本发明拟通过设计一种发酵生产乳酸链球菌素的专用蛋白胨，来提高乳酸链球菌素的发酵水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法及其产品，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以新鲜鱼骨、新鲜牛骨和低温豆粕为原料制备出了一种发酵生产乳酸链球菌素的专用蛋白胨，有效提高了乳酸链球菌素的发酵水平。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法，包括以下步骤：
(1)新鲜鱼骨加水蒸煮，得到的骨汤分离出油层后，用风味蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶酶解，得到鱼骨酶解液，所述鱼骨酶解液浓缩得到鱼骨蛋白胨浓缩液；
(2)新鲜牛骨加水蒸煮，得到的骨汤分离出油层后，用胰蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶酶解，得到牛骨酶解液，所述牛骨酶解液浓缩得到牛骨蛋白胨浓缩液；
(3)低温豆粕加水蒸煮，得到清液，所述清液用胃蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶酶解，得到豆粕酶解液，所述豆粕酶解液浓缩得到豆粕蛋白胨浓缩液；
(4)将所述鱼骨蛋白胨浓缩液、所述牛骨蛋白胨浓缩液和所述豆粕蛋白胨浓缩液按照干物质的重量比为(2-3):5:(2-3)进行混合，得到混合液，最后干燥成粉，得到所述发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨。
进一步地，在步骤(1)中，所述风味蛋白酶、所述氨肽酶和所述中性蛋白酶的添加量分别为鱼骨重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
进一步地，在步骤(1)中，所述酶解的pH为7-7.5，温度为45-50℃，时间为140min。
进一步地，在步骤(2)中，所述胰蛋白酶、所述氨肽酶和所述中性蛋白酶的添加量分别为牛骨重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
进一步地，在步骤(2)中，所述酶解的pH为6.5-7，温度为45-50℃，时间为140min。
进一步地，在步骤(3)中，所述胃蛋白酶、所述氨肽酶和所述木瓜蛋白酶的添加量分别为豆粕重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
进一步地，在步骤(3)中，所述酶解的pH为6.5-7，温度为45-50℃，时间为140min。
进一步地，在步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)中，所述酶解均采用间歇式搅拌方式，具体为：搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min。
本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨。
本发明公开了以下技术效果：
乳酸链球菌是对营养非常挑剔的微生物，菌体生长及乳酸链球菌素的生产，在更多的时候是受到有机氮源的限制。本发明制备的蛋白胨为乳酸链球菌提供了丰富的速效氮源，有利于在发酵前期实现乳酸链球菌素菌体的快速增长，并且其还具有大量分子量范围在4-30KDa的稍大分子量的肽段，能够在发酵培养后期为乳酸链球菌提供适量的稍大分子量氮源，有助于控制乳酸链球菌菌体量的增长，促进乳酸链球菌素的生成。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
采用凝胶过滤色谱法测定蛋白胨的分子量分布，色谱条件为色谱柱：TSK·GELG2000SWXL(300mm×7.8mm，5um)；流动相为乙腈-Tg.三氟乙酸(15：85：0.07，V/V)；流速0.6mL/min；柱温30℃；进样体积10此：检测波长220nm。
以下实施例中所用低温豆粕为提油后经低温或闪蒸脱溶处理得到的豆粕，蛋白质变性较小，水溶性蛋白质含量较高，参见《低温食用豆粕(GB/T 21494-2008)》。
实施例1
(1)用新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至7.3，温度50℃。加入鱼骨重量0.2wt％的风味蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.2，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)用新鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至6.8，温度50℃。加入牛骨重量0.2wt％的胰蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.2，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到牛骨蛋白胨浓缩液。
(3)用低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕和水的质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时，之后用板框过滤滤出清液，压至酶解罐，清液调pH值至6.8，温度50℃，加入豆粕重量0.2wt％的胃蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，得到的清液经真空浓缩浓缩至固含量50wt％，得到豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将制得的鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液按照3:5:2的重量比混合均匀，再经离心式喷雾干燥机干燥成粉，得到蛋白胨。
实施例2
(1)用新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至7，温度55℃。加入鱼骨重量0.2wt％的风味蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)用新鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至6.5，温度55℃。加入牛骨重量0.2wt％的胰蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到牛骨蛋白胨浓缩液。
(3)用低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕和水的质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时，之后用板框过滤滤出清液，压至酶解罐，清液调pH值至6.5，温度55℃，加入豆粕重量0.2wt％的胃蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，得到的清液经真空浓缩浓缩至固含量50wt％，得到豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将制得的鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液按照2:5:2的重量比混合均匀，再经离心式喷雾干燥机干燥成粉，得到蛋白胨。
实施例3
(1)用新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至7.5，温度50℃。加入鱼骨重量0.2wt％的风味蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.1，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)用新鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水的质量比为1:6)，压力在3个标准大气压下，保温1小时，骨汤压至储料罐。骨汤再经过油水分离器，将分离出出油层后的骨汤放至酶解罐，调pH值至7，温度50℃。加入牛骨重量0.2wt％的胰蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用盐酸调pH至5.1，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，清液再经真空浓缩，浓缩至固含量50wt％，得到牛骨蛋白胨浓缩液。
(3)用低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕和水的质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时，之后用板框过滤滤出清液，压至酶解罐，清液调pH值至7，温度50℃，加入豆粕重量0.2wt％的胃蛋白酶，0.2wt％的氨肽酶，0.1wt％的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min，酶解结束。之后再用氢氧化钠调pH至8，升温至90度后慢慢降温，2-3小时降至50度左右即可，降温过程中不开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的清液，得到的清液经真空浓缩浓缩至固含量50wt％，得到豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将制得的鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液按照2:5:3的重量比混合均匀，再经离心式喷雾干燥机干燥成粉，得到蛋白胨。
对比例1
同实施例1，区别仅在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的酶解都采用0.2wt％胰蛋白酶、0.2wt％的氨肽酶和0.1wt％的中性蛋白酶。
对比例2
同实施例1，区别仅在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的酶解都采用0.2wt％的风味蛋白酶、0.2wt％的氨肽酶和0.1wt％的木瓜蛋白酶。
对比例3
同实施例1，区别仅在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的酶解都采用0.2wt％的胃蛋白酶、0.2wt％的氨肽酶和0.1wt％的木瓜蛋白酶。
对比例4
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，酶解时持续搅拌140min。
对实施例1和对比例1-4制备的蛋白胨进行分子量分布检测，结果见表1。
表1不同种蛋白胨中多肽的分子量分布情况(单位％)
发酵实验
1.菌种
乳酸链球菌素生产菌：乳酸链球菌(Streptococcuslactis(Lister)Lohnis)BNCC340479，由山东理工大学工程生物技术实验室提供；
效价指示菌：黄色微球菌(Micrococcus luteus)ATCC10240，由山东理工大学工程生物技术实验室提供。
2.培养基
斜面和种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；
发酵培养基：蔗糖1％，蛋白胨1％，KH2PO40.5％，MgSO4·7H2O 0.2％，pH7.0；
效价测定培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.15％，牛肉提取物0.3％，红糖0.1％，NaCl0.3％，琼脂1.5％，pH6.8。
3.效价测定
乳酸链球菌素的效价测定采用琼脂孔洞扩散法。参考《食品用化学品法典》5版。
4.发酵实验操作
(1)从斜面培养基中挑取一环接于液体种子培养基中，30℃静置培养8h，8h后再按照2％的接种量接种于液体种子培养基中30℃静置培养8h，8h后再重复活化一次，得到种子液。
(2)将步骤(1)得到的种子液，以5％的接种量接种于发酵培养基中(500mL摇瓶，装液量100mL)，30℃静置培养24h。
5.实验结果
分别采用实施例1和对比例1-4制备的蛋白胨配制发酵培养基，并以Sigma-Aldrich蛋白胨配制发酵培养基作为对照，分别进行乳酸链球菌发酵培养实验，培养结束后，分别检测各实验组的乳酸链球菌素效价，结果见表2。综合表1和表2可以看出，实施例1-3制备的蛋白胨，分子量低于2KDa的肽段占比达到44.19％-54.98％，并且占比约为20％的肽段集中在3KDa以上的范围，利用其发酵生产乳酸链球菌素，其效价得到有效提升；对比例1制备的蛋白胨，分子量低于2KDa的肽段占比达到64.11％，较低分子量的肽段占比过多，利用其发酵生产乳酸链球菌素，其效价较低；对比例2-4制备的蛋白胨，高分子量的肽段占比较高，利用其发酵生产乳酸链球菌素，效价同样较低。实施例1-3制备的蛋白胨为乳酸链球菌提供了丰富的速效氮源，有利于在发酵前期实现乳酸链球菌素菌体的快速增长，并且其还具有大量分子量范围在3KDa以上的稍大分子量的肽段，能够在发酵培养后期为乳酸链球菌提供适量的稍大分子量氮源，有助于控制乳酸链球菌菌体量的增长，促进乳酸链球菌素的生成。
表2各实验组发酵液的乳酸链球菌素效价
| 实验组 | 乳酸链球菌素效价IU/mL |
| 实施例1蛋白胨 | 1630 |
| 实施例2蛋白胨 | 1591 |
| 实施例3蛋白胨 | 1610 |
| Sigma-Aldrich蛋白胨 | 1408 |
| 对比例1 | 1005 |
| 对比例2 | 1109 |
| 对比例3 | 1148 |
| 对比例4 | 1269 |
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)新鲜鱼骨加水蒸煮，得到的骨汤分离出油层后，用风味蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶酶解，得到鱼骨酶解液，所述鱼骨酶解液浓缩得到鱼骨蛋白胨浓缩液；
(2)新鲜牛骨加水蒸煮，得到的骨汤分离出油层后，用胰蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶酶解，得到牛骨酶解液，所述牛骨酶解液浓缩得到牛骨蛋白胨浓缩液；
(3)低温豆粕加水蒸煮，得到清液，所述清液用胃蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶酶解，得到豆粕酶解液，所述豆粕酶解液浓缩得到豆粕蛋白胨浓缩液；
(4)将所述鱼骨蛋白胨浓缩液、所述牛骨蛋白胨浓缩液和所述豆粕蛋白胨浓缩液按照干物质的重量比为(2-3):5:(2-3)进行混合，得到混合液，最后干燥成粉，得到所述发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述风味蛋白酶、所述氨肽酶和所述中性蛋白酶的添加量分别为鱼骨重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酶解的pH为7-7.5，温度为45-50℃，时间为140min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述胰蛋白酶、所述氨肽酶和所述中性蛋白酶的添加量分别为牛骨重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述酶解的pH为6.5-7，温度为45-50℃，时间为140min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述胃蛋白酶、所述氨肽酶和所述木瓜蛋白酶的添加量分别为豆粕重量的0.2wt％、0.2wt％和0.1wt％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶解的pH为6.5-7，温度为45-50℃，时间为140min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)中，所述酶解均采用间歇式搅拌方式，具体为：搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅10min停10min，搅10min停25min，搅10min停25min。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的发酵生产乳酸链球菌素专用蛋白胨。
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