CN114214315A - 一种含四氢嘧啶的rna稳定剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及RNA保存技术领域，具体涉及一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂及其应用。RNA稳定剂，按质量百分比计，包括四氢嘧啶0.5％‑10％，海藻糖1％‑20％，RNAase抑制因子0.1％‑1％，表面活性剂0.1％‑2％，余量为水；RNA稳定剂的应用为使用RNA稳定剂溶解和/或保存RNA样品。本发明利用四氢嘧啶对生物大分子的稳定性保护，并结合RNAase抑制剂、海藻糖等协同增效，共同提高RNA在提取和保存过程中的稳定性；以本发明RNA稳定剂保存的RNA样品，无需冷冻在液氮中，在冷藏和冷冻条件下即可长期保存，且不会影响RNA分离后获得的RNA的质量和数量。
Description
技术领域
本发明涉及RNA保存技术领域，具体涉及一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂及其应用。
背景技术
核糖核酸(RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，参与细胞的转录、翻译等多种功能活动，是生物学、医药学等生命有关学科研究的重要对象。基于RNA的单链结构易被降解的特性，学科研究中RNA的提取和保存存在一定的困难。
目前RNA提取过程中会加入RNAase抑制因子，保存在液氮或-20℃，但是再次使用反复冻融RNA也会有一定程度的降解，亟待研发一种更加有效的RNA稳定剂用于长期稳定地保存RNA。
发明内容
针对采用现有RNA保存方法保存的RNA反复冻融后存在一定程度降解的问题，本发明提供一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂及其应用，利用四氢嘧啶对生物大分子的稳定性保护，并结合RNAase抑制剂、海藻糖等协同增效，共同提高RNA在提取和保存过程中的稳定性；以本发明RNA稳定剂保存的RNA样品，无需冷冻在液氮中，在冷藏和冷冻条件下即可长期保存，且不会影响RNA分离后获得的RNA的质量和数量。
第一方面，本发明提供一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括四氢嘧啶0.5％-10％，海藻糖1％-20％，RNAase抑制因子0.1％-1％，表面活性剂0.1％-2％，余量为水。
进一步的，所述RNAase抑制因子为DEPC溶液。
进一步的，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，SDS可以促进RNA的快速溶解，减少RNA与环境中RNAase的接触时间。
进一步的，按质量百分比计，包括四氢嘧啶8％，海藻糖5％，DEPC溶液0.1％，SDS1％，余量为水。
进一步的，按质量百分比计，包括四氢嘧啶5％，海藻糖10％，DEPC溶液0.1％，SDS0.5％，余量为水。
进一步的，按质量百分比计，包括四氢嘧啶5％，海藻糖10％，DEPC溶液0.1％，SDS1％，余量为水。
第二方面，本发明还提供一种上述RNA稳定剂的应用，使用含四氢嘧啶的RNA稳定剂溶解和/或保存RNA样品。
进一步的，将溶解RNA样品后的RNA稳定剂置于4℃以下保存，如4℃、-10℃或-28℃。
进一步的，将溶解RNA样品后的RNA稳定剂置于-20℃保存。
本发明的有益效果在于：
(1)添加天然、安全的微生物发酵产物四氢嘧啶作为稳定剂的主要成分，四氢嘧啶是耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，属于亲水性、兼性离子的生物小分子，胞内高耐受性，不易分解，溶解度高，保水性强，能加速RNA在水中的溶解性，维持RNA的长效稳定，四氢嘧啶及其衍生物能够在高温、冷冻、干燥、射线、自由基等不利条件下保护酶、核酸等生物大分子的生物活性。
(2)将RNA溶解在含四氢嘧啶的稳定剂中，可延长4℃条件下的保存时间，且在-20℃条件下保存两年半，RNA的质量和数量都不会降低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1组的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是对照1组的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是实施例1组和对照1组的RIN值对比柱状图。
图4是实施例1组和对照1组的28S/18S比值对比柱状图。
图5是实施例2组和对照2组的RIN值对比柱状图。
图6是实施例2组和对照2组的28S/18S比值对比柱状图。
图7是实施例3组和对照3组的RIN值对比柱状图。
图8是实施例3组和对照3组的28S/18S比值对比柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式中所使用的DEPC溶液为0.1％的DEPC水溶液。
实施例1
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括8％四氢嘧啶，5％海藻糖，0.1％DEPC溶液，1％SDS，余量为水。
RNA提取过程中，使用实施例1的RNA稳定剂溶解RNA样品(实施例1组)，并以不加入RNA稳定剂作为对照1组，两组实验各处理4个RNA样品，两组RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图如图1、图2所示，可以看出，未加RNA稳定剂的对照1组RNA样品出现部分降解，电泳条件弥散；加入RNA稳定剂的实施例1组RNA样品完整度较好，效果显著。
将实施例1组和对照1组置于4℃下保存15天，每3天取样，通过Agilent 2100检测RNA完整性，检测结果用RIN(RNA integrity number)值评价，RIN值从10(完整)到1(完全降解)，值越大表明RNA的完整性好，一般RIN≥7显示RNA完整性良好。同时通过Agilent2100进行28S/18S检测评价RNA完整性，28S/18S的比值在1.8-2.0范围内说明RNA完整性良好。
评价结果如图3、4所示，可以看出，未加RNA稳定剂的对照1组RNA样品在第3天开始降解；而实施例1组溶于RNA稳定剂中的RNA样品可以维持12天。
实施例2
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括5％四氢嘧啶，10％海藻糖，0.1％DEPC溶液，0.5％SDS，余量为水。
将RNA样品溶解于实施例2的RNA稳定剂(实施例2组)，然后置于4℃下保存15天，并以不加入RNA稳定剂作为对照2组，每3天取样并进行RNA完整性检测，检测及评价方法同实施例1。
评价结果如图5、图6所示，可以看出，未加RNA稳定剂的对照2组RNA样品在4℃条件下降解较快，放置第3天RIN值降到6，28S/18S比值到1.4，开始降解；而实施例2组溶于RNA稳定剂中的RNA样品可以维持12天，第12天RIN值为7，28S/18S比值为1.8。
实施例3
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括5％四氢嘧啶，10％海藻糖，0.1％DEPC溶液，1％SDS，余量为水。
将RNA样品溶解于实施例3的RNA稳定剂(实施例3组)，然后置于-20℃下放置3年，并以不加入RNA稳定剂作为对照3组，每半年取样并进行RNA完整性检测，检测及评价方法同实施例1。
评价结果如图7、图8所示，可以看出，未加RNA稳定剂的对照3组RNA样品在-20℃放置半年RIN值降到5，28S/18S比值到0.8，降解速度较快；而实施例3组保护的RNA样品在-20℃下可以保存2.5年，保护效果显著。
对比例1
一种RNA稳定剂，按质量百分比计，包括10％海藻糖，0.1％DEPC溶液，1％SDS，余量为水。
对比例2
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括5％四氢嘧啶，10％海藻糖，余量为水。
对比例3
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括5％四氢嘧啶，0.1％DEPC溶液，余量为水。
对比例4
一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，按质量百分比计，包括5％四氢嘧啶，余量为水。
将RNA样品分别溶解于实施例3及对比例1～4的RNA稳定剂(对比例1～4组)中，然后置于4℃下放置15天，每3天取样并进行RNA完整性检测，检测及评价方法同实施例1。
评价结果如表1、表2所示，可以看出，实施例3组中四氢嘧啶与海藻糖、DEPC溶液和SDS作为稳定剂，在4℃条件下根据RIN值与28S/18S比值，RNA完整度可以维持12天。而使用仅包含海藻糖、DEPC、SDS的稳定剂，RNA的RIN值在第6天降到7以下，28S/18S比值则到1.8以下，完整度相对较差。四氢嘧啶单独使用或与海藻糖、DEPC溶液中一种复配使用时，效果都不如实施例3组，配方中效果较好的一组，RNA仅在6天内保持相对完整。
表1实施例3组和对比例1～4组的RIN值表
表2实施例3组和对比例1～4组的28S/18S比值表
| 时间/天 | 实施例3组 | 对比例1组 | 对比例2组 | 对比例3组 | 对比例4组 |
| 1 | 2 | 2 | 2 | 1.9 | 1.9 |
| 3 | 1.9 | 1.8 | 1.9 | 1.8 | 1.8 |
| 6 | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 1.8 | 1.8 |
| 9 | 1.8 | 1.7 | 1.7 | 1.7 | 1.6 |
| 12 | 1.8 | 1.6 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 15 | 1.6 | 1.5 | 1.5 | 1.4 | 1.5 |
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，按质量百分比计，包括四氢嘧啶0.5％-10％，海藻糖1％-20％，RNAase抑制因子0.1％-1％，表面活性剂0.1％-2％，余量为水。
2.如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，所述RNAase抑制因子为DEPC溶液。
3.如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，所述表面活性剂为SDS。
4.如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，按质量百分比计，包括四氢嘧啶8％，海藻糖5％，DEPC溶液0.1％，SDS 1％，余量为水。
5.如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，按质量百分比计，包括四氢嘧啶5％，海藻糖10％，DEPC溶液0.1％，SDS 0.5％，余量为水。
6.如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂，其特征在于，按质量百分比计，包括四氢嘧啶5％，海藻糖10％，DEPC溶液0.1％，SDS 1％，余量为水。
7.一种如权利要求1所述的含四氢嘧啶的RNA稳定剂的应用，其特征在于，使用含四氢嘧啶的RNA稳定剂溶解和/或保存RNA样品。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将溶解RNA样品后的RNA稳定剂置于4℃以下保存。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将溶解RNA样品后的RNA稳定剂置于-20℃保存。
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Denomination of invention: An RNA stabilizer containing tetrahydropyrimidine and its application Effective date of registration: 20230530 Granted publication date: 20220830 Pledgee: Shandong Linshu Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANDONG FREDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980042385 |
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