CN114214073B - 一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法，涉及土壤修复技术领域，通过在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中进行培育，得到菌液，之后接种到液体培养基中进行培育，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂；通过将该固态微生物土壤修复剂加入到石油污染的土壤中，撒上水，能够使得微生物在土壤中快速繁殖并将石油污染物进行降解，可显著提高受污染土壤中有机质含量，调节土壤菌群结构及土壤酸碱性，提高土壤透气性，改善土壤理化性质，提高土壤肥力，解决了现有的土壤生物修复过程中，由于土著微生物的生长缓慢，往往在生物修复过程受到限制，达不到预期的效果的问题。

Description

一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法。
背景技术
土壤作为能量交换、物质循环的重要场所，经常会成为污染物在环境中迁移、沉积和滞留的最终受害者。当土壤中的有害物质超过土壤的自净能力时，将会引起土壤的结构、组成和功能发生变化，使微生物活动受到抑制，石油进入土壤会附着在植物根表面形成粘膜，阻碍营养的吸入、呼吸作用，引起根部腐烂，导致植物死亡并且会与土粒粘连，破坏土壤结构，降低透气性和渗水性，从而使土壤的许多物理性质发生改变，导致土壤肥力下降；汽车尾气的排放及大气污染产生的气态石油类污染物以沉降物形式进入土壤；石油类的污染物随着各种药剂的使用，作为各种防腐剂、杀虫剂和除草剂的溶剂或乳化剂等进入土壤。同时，在石油的开采和运输的过程中，会产生石油泄露、废弃物堆置等对土壤造成污染，这些石油烃类的污染物都对土壤造成了一定程度的侵害。随着对环境保护的重视，维持土壤的安全性已成为环境科学研究者至关重要的热点之一。
研究发现，生物修复具有费用低、没有二次污染、处理效果好等优点而被认为是最具生命力的清洁技术。虽然微生物的个体微小，但是它具有生命的特征，生长代谢同样需要一定的过程，石油烃类污染物巾具有难降解的多环芳径，因此寻找高效的降解石油污染物的微生物已成为一个热点。
但是，现有的土壤生物修复技术但由于土著微生物的生长缓慢，往往在生物修复过程受到限制，达不到预期的效果。
因此，亟需一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法来解决以上问题。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法：通过在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中进行培育，得到菌液，之后接种到液体培养基中进行培育，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂，通过将该固态微生物土壤修复剂加入到石油污染的土壤中，之后撒上水，能够使得微生物在土壤中快速繁殖并将石油污染物进行降解，解决了现有的土壤生物修复过程中，由于土著微生物的生长缓慢，往往在生物修复过程受到限制，达不到预期的效果的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种固态微生物土壤修复剂，该固态微生物土壤修复剂由以下步骤制备得到：
在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为18-20℃的条件下培育6-7天，得到菌液，将菌液以13-16%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为25-30℃的条件下培育3-5天，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂。
作为本发明进一步的方案：所述复合微生物菌为蛋白降解菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、光合成菌和反硝化菌按照等质量比的混合物。
作为本发明进一步的方案：一种固态微生物土壤修复剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将甲基丙烯酸甲酯、乙二胺加入至安装有搅拌器、温度计以及回流冷凝管的四口烧瓶中，之后加入二丁基二月桂酸锡以及对苯二酚，之后在温度为100-110℃，搅拌速率为300-500r/min的条件下回流反应3-4h，之后进行蒸馏，去除未反应的甲基丙烯酸甲酯和生成的甲醇，得到中间体1；
反应原理如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
步骤二：将丙烯酸、去离子水加入至安装有搅拌器、温度计以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，在温度为-5℃至0℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，控制滴加速率为1-3滴/s，直至中和度达到75-80%，之后加入丙烯酰胺、中间体1以及过硫酸铵，之后升温至60-70℃的条件下恒温搅拌反应7-8h，反应结束后将反应产物加入至真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，之后粉碎，得到中间体2；
反应原理如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
步骤三：将微晶纤维素、稀硝酸溶液加入至安装有搅拌器、温度计、导气管以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，通入氮气保护，在温度为20-30℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下搅拌30-40min，之后加入光引发剂以及中间体2，之后升温至30-40℃的条件下继续搅拌1-2h，之后在紫外灯的照射下反应2-3min，之后继续搅拌5-10min，重复照射反应3-5次并搅拌，反应结束后将反应产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤2-3次，之后离心，将沉淀物放置于真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，得到保水剂；
反应原理如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE004
步骤四：在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为18-20℃的条件下培育6-7天，得到菌液，将菌液以13-16%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为25-30℃的条件下培育3-5天，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂。
作为本发明进一步的方案：步骤一中的所述甲基丙烯酸甲酯、乙二胺、二丁基二月桂酸锡以及对苯二酚的用量比为0.5mol：0.1mol：1.0-1.5g：0.05-0.1g。
作为本发明进一步的方案：步骤二中的所述丙烯酸、去离子水、丙烯酰胺、中间体1以及过硫酸铵的用量比为40-50g：100-150mL：10-15g：0.05-0.15g：0.15-0.25g，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为10-12mol/L。
作为本发明进一步的方案：步骤三中的所述微晶纤维素、稀硝酸溶液、光引发剂以及中间体2的用量比为1-3g：40-50mL：0.05-0.15g：1-3g，所述稀硝酸溶液的摩尔浓度为0.1mol/L，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
作为本发明进一步的方案：步骤四中的所述固体培养基的配方为土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 1.5g/L；所述液体培养基的配方为麸皮20g/L、氯化铵0.5g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4 0.1g/L、CaCl2 0.01g/L、土温80 1.0g/L、无机盐溶液1.0mL/L、有机物溶液0.5mL/L；无机盐溶液的配方为MgSO4 3.0g/L、MnSO4 0.5g/L、NaCl1.0g/L、FeSO4 0.1g/L、CoSO4 0.1g/L、CaCl2 0.1g/L、ZnSO4 0.1g/L；所述有机物溶液的配方为VB1 0.005g/L、VB2 0.005g/L、VB6 0.005g/L、烟酸0.005g/L、生物素0.002g/L、叶酸0.002g/L。
本发明的有益效果：
本发明的一种固态微生物土壤修复剂及其制备方法，通过在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中进行培育，得到菌液，之后接种到液体培养基中进行培育，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂；通过将该固态微生物土壤修复剂加入到石油污染的土壤中，之后撒上水，能够使得微生物在土壤中快速繁殖并将石油污染物进行降解，可显著提高受污染土壤中有机质含量，调节土壤菌群结构及土壤酸碱性，提高土壤透气性，改善土壤理化性质，提高土壤肥力。
在制备该固态微生物土壤修复剂的过程中，也制备了一种保水剂，首先通过甲基丙烯酸甲酯、乙二胺反应生成含有双不饱和键的中间体1，中间体1中含有氮元素，通过丙烯酸中和形成丙烯酸钠，之后与丙烯酰胺、中间体1进行聚合，形成大分子聚合物，得到中间体2，中间体2上含有大量的亲水基团，之后将微晶纤维素在光引发剂的作用下产生自由基，之后将中间体2接枝到微晶纤维素上，增加了亲水基团，亲水基团不仅能够吸水保水，还能吸附重金属离子，由于添加水能提高氧的含量，氧含量的多少直接影响微生物细胞内酶的活性和呼吸作用，控制着微生物的生长和对石油污染物质的去除能力，间断性的翻耕土壤也能使空气进入土壤，增加土壤的含氧量，因此，保水剂的添加能够间接性的促进固态微生物土壤修复剂中的微生物对土壤进行修复，大幅提升固态微生物土壤修复剂的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例为一种保水剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：将0.5mol甲基丙烯酸甲酯、0.1mol乙二胺加入至安装有搅拌器、温度计以及回流冷凝管的四口烧瓶中，之后加入1.0g二丁基二月桂酸锡以及0.05g对苯二酚，之后在温度为100℃，搅拌速率为300r/min的条件下回流反应3h，之后进行蒸馏，去除未反应的甲基丙烯酸甲酯和生成的甲醇，得到中间体1；
S2：将40g丙烯酸、100mL去离子水加入至安装有搅拌器、温度计以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，在温度为-5℃，搅拌速率为200r/min的条件下边搅拌边逐滴加入摩尔浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，控制滴加速率为1滴/s，直至中和度达到75%，之后加入10g丙烯酰胺、0.05g中间体1以及0.15g过硫酸铵，之后升温至60℃的条件下恒温搅拌反应7h，反应结束后将反应产物加入至真空干燥箱中，在温度为50℃的条件下烘干至恒重，之后粉碎，得到中间体2；
S3：将1g微晶纤维素、40mL摩尔浓度为0.1mol/L的稀硝酸溶液加入至安装有搅拌器、温度计、导气管以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，通入氮气保护，在温度为20℃，搅拌速率为200r/min的条件下搅拌30min，之后加入0.05g光引发剂以及1g中间体2，之后升温至30℃的条件下继续搅拌1h，之后在紫外灯的照射下反应2min，之后继续搅拌5min，重复照射反应3次并搅拌，反应结束后将反应产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤2次，之后离心，将沉淀物放置于真空干燥箱中，在温度为50℃的条件下烘干至恒重，得到保水剂。
实施例2：
本实施例为一种保水剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：将0.5mol甲基丙烯酸甲酯、0.1mol乙二胺加入至安装有搅拌器、温度计以及回流冷凝管的四口烧瓶中，之后加入1.5g二丁基二月桂酸锡以及0.1g对苯二酚，之后在温度为110℃，搅拌速率为500r/min的条件下回流反应4h，之后进行蒸馏，去除未反应的甲基丙烯酸甲酯和生成的甲醇，得到中间体1；
S2：将50g丙烯酸、150mL去离子水加入至安装有搅拌器、温度计以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，在温度为0℃，搅拌速率为300r/min的条件下边搅拌边逐滴加入摩尔浓度为12mol/L的氢氧化钠溶液，控制滴加速率为1-3滴/s，直至中和度达到80%，之后加入15g丙烯酰胺、0.15g中间体1以及0.25g过硫酸铵，之后升温至70℃的条件下恒温搅拌反应8h，反应结束后将反应产物加入至真空干燥箱中，在温度为60℃的条件下烘干至恒重，之后粉碎，得到中间体2；
S3：将3g微晶纤维素、50mL摩尔浓度为0.1mol/L的稀硝酸溶液加入至安装有搅拌器、温度计、导气管以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，通入氮气保护，在温度为30℃，搅拌速率为300r/min的条件下搅拌40min，之后加入0.15g光引发剂以及3g中间体2，之后升温至40℃的条件下继续搅拌2h，之后在紫外灯的照射下反应3min，之后继续搅拌10min，重复照射反应5次并搅拌，反应结束后将反应产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后离心，将沉淀物放置于真空干燥箱中，在温度为60℃的条件下烘干至恒重，得到保水剂。
实施例3：
本实施例为一种固态微生物土壤修复剂的制备方法，包括以下步骤：
在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为18℃的条件下培育6天，得到菌液，将菌液以13%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为25℃的条件下培育3天，得到复合菌液，之后将来自于实施例1中的保水剂按照复合菌液质量的10%加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂。
实施例4：
本实施例为一种固态微生物土壤修复剂的制备方法，包括以下步骤：
在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为20℃的条件下培育7天，得到菌液，将菌液以16%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为30℃的条件下培育5天，得到复合菌液，之后将来自于实施例2中的保水剂按照复合菌液质量的25%加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂。
对比例1：
对比例1与实施例4的不同之处在于，不添加保水剂。
检测用污染土壤制备：
取150g石油原油溶解于1200mL的92#汽油中，将土壤自然风干并过10目筛，之后将石油原油与汽油的混合液加入至3kg的土壤中，混合均匀后通风放置10天，使得汽油挥发，之后得到检测用污染土壤，其中石油原油的浓度C0为47.62g/kg。
检测样品制备：
将1g对比例1中的固态微生物土壤修复剂加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品A；
将3g对比例1中的固态微生物土壤修复剂加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品B；
将1g对比例1中的固态微生物土壤修复剂与1g蒸馏水加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品C；
将3g对比例1中的固态微生物土壤修复剂和3g蒸馏水加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品D；
将1g实施例3中的固态微生物土壤修复剂和1g蒸馏水加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品E；
将3g实施例4中的固态微生物土壤修复剂和3g蒸馏水加入至10g检测用污染土壤中，混合均匀，得到样品F；
分别检测样品A-F在1天、10天、30天、60天的石油原油的浓度C1，通过公式J=[（C0-C1）/C0]×100%计算得出降解率J。检测结果如下：
样品 1天降解率，% 10天降解率，% 30天降解率，% 60天降解率，%
样品A 13.6 23.8 47.2 73.5
样品B 21.4 37.6 58.9 84.3
样品C 13.9 24.7 50.1 77.9
样品D 21.8 39.3 63.4 87.0
样品E 14.1 26.4 55.9 82.6
样品F 22.4 45.8 70.1 95.7
参阅上表数据，可以得知本发明中实施例3-4与对比例1中的固态微生物土壤修复剂均能够对石油污染的土壤进行修复，且经过60天以后土壤中的石油污染物能够得到充分降解，根据样品A与样品B、或者样品C与样品D、或者样品E与样品F相比，可以得知固态微生物土壤修复剂的添加对污染土壤降解率有所提升；通过样品A、样品C以及样品F或者样品B、样品D以及样品F之间的比较，可以得知湿润的土壤环境能够促进固态微生物土壤修复剂对污染土壤中的污染物进行降解。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种固态微生物土壤修复剂，其特征在于，该固态微生物土壤修复剂由以下步骤制备得到：
步骤一：将甲基丙烯酸甲酯、乙二胺加入至安装有搅拌器、温度计以及回流冷凝管的四口烧瓶中，之后加入二丁基二月桂酸锡以及对苯二酚，之后在温度为100-110℃，搅拌速率为300-500r/min的条件下回流反应3-4h，之后进行蒸馏，去除未反应的甲基丙烯酸甲酯和生成的甲醇，得到中间体1；
步骤二：将丙烯酸、去离子水加入至安装有搅拌器、温度计以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，在温度为-5℃至0℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，控制滴加速率为1-3滴/s，直至中和度达到75-80%，之后加入丙烯酰胺、中间体1以及过硫酸铵，之后升温至60-70℃的条件下恒温搅拌反应7-8h，反应结束后将反应产物加入至真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，之后粉碎，得到中间体2；
步骤三：将微晶纤维素、稀硝酸溶液加入至安装有搅拌器、温度计、导气管以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，通入氮气保护，在温度为20-30℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下搅拌30-40min，之后加入光引发剂以及中间体2，之后升温至30-40℃的条件下继续搅拌1-2h，之后在紫外灯的照射下反应2-3min，之后继续搅拌5-10min，重复照射反应3-5次并搅拌，反应结束后将反应产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤2-3次，之后离心，将沉淀物放置于真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，得到保水剂；
步骤四：在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为18-20℃的条件下培育6-7天，得到菌液，将菌液以13-16%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为25-30℃的条件下培育3-5天，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂；
所述复合微生物菌为蛋白降解菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、光合成菌和反硝化菌按照等质量比的混合物；
步骤一中的所述甲基丙烯酸甲酯、乙二胺、二丁基二月桂酸锡以及对苯二酚的用量比为0.5mol：0.1mol：1.0-1.5g：0.05-0.1g；
步骤二中的所述丙烯酸、去离子水、丙烯酰胺、中间体1以及过硫酸铵的用量比为40-50g：100-150mL：10-15g：0.05-0.15g：0.15-0.25g，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为10-12mol/L；
步骤三中的所述微晶纤维素、稀硝酸溶液、光引发剂以及中间体2的用量比为1-3g：40-50mL：0.05-0.15g：1-3g，所述稀硝酸溶液的摩尔浓度为0.1mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种固态微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将甲基丙烯酸甲酯、乙二胺加入至安装有搅拌器、温度计以及回流冷凝管的四口烧瓶中，之后加入二丁基二月桂酸锡以及对苯二酚，之后在温度为100-110℃，搅拌速率为300-500r/min的条件下回流反应3-4h，之后进行蒸馏，去除未反应的甲基丙烯酸甲酯和生成的甲醇，得到中间体1；
步骤二：将丙烯酸、去离子水加入至安装有搅拌器、温度计以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，在温度为-5℃至0℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，控制滴加速率为1-3滴/s，直至中和度达到75-80%，之后加入丙烯酰胺、中间体1以及过硫酸铵，之后升温至60-70℃的条件下恒温搅拌反应7-8h，反应结束后将反应产物加入至真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，之后粉碎，得到中间体2；
步骤三：将微晶纤维素、稀硝酸溶液加入至安装有搅拌器、温度计、导气管以及恒压滴液漏斗的四口烧瓶中，通入氮气保护，在温度为20-30℃，搅拌速率为200-300r/min的条件下搅拌30-40min，之后加入光引发剂以及中间体2，之后升温至30-40℃的条件下继续搅拌1-2h，之后在紫外灯的照射下反应2-3min，之后继续搅拌5-10min，重复照射反应3-5次并搅拌，反应结束后将反应产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤2-3次，之后离心，将沉淀物放置于真空干燥箱中，在温度为50-60℃的条件下烘干至恒重，得到保水剂；
步骤四：在无菌环境下，将复合微生物菌放入固体培养基中，在温度为18-20℃的条件下培育6-7天，得到菌液，将菌液以13-16%的接种量接种到液体培养基中，之后在温度为25-30℃的条件下培育3-5天，得到复合菌液，之后将保水剂加入至复合菌液中，之后冷冻干燥，得到该固态微生物土壤修复剂。
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