CN114181295A - 一种多肽衍生物及其用途、水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化领域，公开了一种多肽衍生物，其具有：如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。该多肽衍生物具有分子简单且易于合成的特点，同时具有PDGF‑BB的生物活性；通过对该多肽衍生物进行自组装和治疗方面的测试发现，其还具有自组装条件温和、创面修复速度快的特点。同时，本发明还公开了该多肽衍生物的用途、采用该多肽衍生物的水凝胶及其制备方法。

Description

一种多肽衍生物及其用途、水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生化领域，具体为一种多肽衍生物及其用途、水凝胶及其制备方法。
背景技术
伤口愈合是一个复杂而动态的过程，由几个相互重叠的阶段组成，主要分为三个阶段：止血与炎症、增殖和重塑。许多细胞类型(如成纤维细胞和角质形成细胞)、细胞外基质(ECM)、生长因子和细胞因子都参与了愈合过程。PDGF-BB(platelet derived growthfactor，血小板衍生生长因子)是第一个被描述和纯化的伤口愈合的生长因子。作为最重要和最强的生长因子，PDGF几乎参与了伤口愈合的所有阶段。PDGF主要由血小板α颗粒释放，也可由角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞释放。它是多种细胞的有丝分裂原，可导致中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞向伤口部位趋化，这有助于阻止炎症期的发生。同时PDGF还能增加成纤维细胞的增殖和ECM成分的产生。目前，几种皮肤创面愈合的方法，包括负压伤口治疗，局部治疗，皮肤移植，工程皮肤替代品，伤口敷料和干细胞治疗都存在不足，因此需要找寻一种新的可替代的方法来促进创面愈合，减轻患者的痛苦及负担。
Figure BDA0003412283210000011
(重组人PDGF的水凝胶)是目前唯一商品化的用于皮肤伤口愈合的生长因子治疗药。它于1997年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗糖尿病创面的下肢溃疡。然而，由于其成本高，并且配方中使用了高浓度的PDGF-BB(100μg/1g凝胶)，推测该产品可能会加速肿瘤生长，根据临床使用后的效果，2008年FDA要求在药品的标签上增加新的黑框警示，声明该药在用于糖尿病患者手足溃疡的治疗时，如果使用3管或以上的用量，可能会增加用药者患癌死亡的风险，并且对于已知患有恶性肿瘤的患者，并不推荐使用该药。由此，找寻替代重组人PDGF-BB水凝胶的产品迫在眉睫。多肽作为具有再生潜能的化合物的利用已经出现。它们可以模仿蛋白质的功能，且易于合成，具有生物相容性，具有可控制的大小、功能基团和活性，使它们成为最有潜力的药物开发分子。而自组装多肽具有良好的生物相容性和生物降解性，通过合理调控多肽的分子结构及改变外界的环境，可利用非共价键作用力自组装成纳米纤维结构，进而形成水凝胶，表现出独特的物理化学和生化活性。多肽可以设计成具有特定性质的不同超分子纳米结构。
此方面的研究可参考CN201911146406.X和CN202110863352.X；
其中，CN201911146406.X公开了一种可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用，所述多肽衍生物可以模拟PDGF蛋白的生物学活性，即促进成纤维细胞增殖、迁移，生产方法简单、分子量较小、产率大、成本低，产物化学结构明确。所述多肽衍生物能够在水溶液中自组装，形成纳米纤维，可有效修复辐射引起的皮肤损伤。所述可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物的序列为：
X-Phe-Phe-Gly-Val-Arg-Lys-Lys-Pro，其中，端基X为含芳香基团的端基。
在上述序列中，氨基酸序列Val-Arg-Lys-Lys-Pro为PDGF的靶点序列。
CN201911146406.X无论是靶点序列还是人工添加的序列，其序列长度都较短，其导致的可能的潜在问题是(参考该专利的说明书第28段、35段、116-121段记载)：水凝胶制备过程温度高，要加热至沸腾使化合物完全溶解再冷却到室温成胶，这会导致在实际应用中水凝胶如果添加了其他生物活性成分，将导致额外添加的生物活性成分失活；该方案所记载的水凝胶应用的修复用途为辐射导致的皮肤损伤，其应用领域相对较为受限。导致该问题的可能原因是，靶点序列和人工添加的序列长度需合理的控制以及片段需进一步优选。
CN202110863352.X采用了是PDGF靶点之外的其他多肽序列，通过该序列的多肽制备的凝胶虽然制备条件温和，但是参考其说明书102段、103段、图3的B、C、D记载可以发现：其需要二次给药，在第10天依然保留有较大的创面(原始创面的直径为8mm)，第14天依然具有肉眼可见的明显创面。
所以，本案解决的技术问题是：如何改进多肽衍生物的序列，以使其能够在温和条件下制备成水凝胶，并提高水凝胶的创面修复效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽衍生物，该多肽衍生物具有分子简单且易于合成的特点，同时具有PDGF-BB的生物活性；通过对该多肽衍生物进行自组装和治疗方面的测试发现，其还具有自组装条件温和、创面修复速度快的特点。
该多肽衍生物为具有血小板衍生生长因子生物活性的多肽，并将其制成可注射的水凝胶材料。多肽分子先通过固相多肽合成法得到粗品，再经由高效液相色谱(highperformance liquid chromatography，HPLC)纯化得到纯品，利用纯品的水溶液与2X的磷酸缓冲液(PBS)(1:1)混合在37℃形成水凝胶，此纯品在液体状态下对于小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)有促进增殖及迁移的效果。凝胶制剂可以促进伤口愈合、糖尿病足、骨、颅骨、牙周病、肌腱等需要血小板衍生生长因子参与的修复。
同时，本发明还公开了该多肽衍生物的用途、采用该多肽衍生物的水凝胶及其制备方法。
本发明不作特殊说明的情况下：mM代表毫摩尔/升，nM代表纳摩尔/升；
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多肽衍生物，其具有：
(I)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个或4个。
符合上述的(II)或(III)的相关氨基酸序列可为：X-FFVLK-GG-VRKIEIVRKK；X-KLVFF-GG-VRKIEIVRKK。当然，可变形的序列不能穷举，上述仅为示例，采用类似序列、达到类似效果的相关氨基酸序列均在本发明的保护范围之内。
在上述的多肽衍生物中，其氨基酸序列为：
X-FFVLE-GG-VRKIEIVRKK；
其中，X为封端基团。
在上述的多肽衍生物中，所述封端基团为乙酰基、芴基甲基氧羰基、萘基或芘基。
同时，本发明还公开了一种水凝胶，含如上任一所述的多肽衍生物。
在上述的水凝胶中，所述水凝胶中的多肽衍生物的浓度为1.9mM～3.6mM。
在上述的水凝胶中，还含有缓冲溶液，所述缓冲溶液为PBS，所述水凝胶中的缓冲溶液的浓度为10mM～20mM。
同时，本发明还公开了一种如上所述的水凝胶的制备方法，将多肽衍生物加入到纯水中溶解，与PBS(2X)混合，在25-37℃的条件下进行自组装，即可。
最后，本发明公开了一种如上任一所述的多肽衍生物的用途，作为用于修复皮肤创面的敷料、注射剂型的活性成分。
此外，该多肽衍生物还可以作为用于修复骨、肌腱的损伤修复的敷料、注射剂型的活性成分；所述敷料、注射剂型用于伤口、糖尿病足、骨损伤、颅骨损伤、牙周病、肌腱损伤的等需要血小板衍生生长因子参与的修复。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的多肽衍生物与原始分子相比，分子量小且易于合成，其生物活性优于PDGF-BB。同时，可在PBS(2X)中通过自组装形成稳定且可注射的超分子水凝胶。而水凝胶本身可作为生长因子的“容器”，缓释PDGF-BB模拟分子。除此之外，类PDGF-BB的肽溶液可以在体外促进NIH 3T3及HUVEC的增殖及迁移，也具有促进HUVEC的成管腔能力，在体内能促进皮下血管发生及促进创面愈合，其作为一个生长因子在发育、细胞增殖、细胞存活、血管生成、组织创伤修复等方面发挥关键作用。因此本发明可为这些方面的需求提供新型材料。
通过实验验证，采用该多肽衍生物的水凝胶其制备条件温和、只需一次给药就可以达到促进创面愈合的效果。
同时，本发明还公开了水凝胶、制备方法以及该多肽衍生物的具体的应用。
附图说明
图1为本发明的实施例2的多肽水凝胶的透射电子显微镜图像(标尺：100nm)；
图2为本发明的实施例2的多肽水凝胶的纤维结构的结构图；
图3为本发明的实施例2的多肽水凝胶的稳定性标定的坐标图；
图4为本发明的实施例3采用多肽衍生物促进细胞增殖的效果图；
图5为本发明的实施例3采用多肽衍生物促进细胞迁移的效果图；
图6为本发明的实施例4的动物实验效果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂说明
所需氨基酸原料及树脂：希施生物科技(上海)有限公司(CSBio)
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇、正己烷、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tis)、乙醚：国药集团。
实施例1
通过固相多肽合成法合成类PDGF-BB的多肽分子，分子式为
Nap-FFVLE-GG-VRKIEIVRKK。
其分子式如下式1：
Figure BDA0003412283210000061
固相多肽合成，采用氨甲基树脂(AM resin)。先称量好按当量比计算所需的各种氨基酸以及其他反应原料，加入相对应的无水DMF分别超声溶解，投放到多肽合成仪上，再按照相关操作进行合成：打开固相多肽合成仪软件，编辑氨基酸序列，NH2，Nap，Phe，Phe，Val，Leu，Glu，Gly，Gly，Val，Arg，Lys，Ile，Glu，Ile，Val，Arg，Lys，Lys，OH，点击选择相对应的合成程序，待其运行完成即得到含有所需分子的树脂。再将其转移至砂芯漏斗中，依次用无水DCM、甲醇、正己烷冲洗3遍，接着干燥树脂10分钟。之后用95％TFA(体积比TFA:Tis:纯水＝95:2.5:2.5)将合成的多肽分子从树脂上切割下来，然后利用冰乙醚沉淀，最后将沉淀物真空干燥即得到粗品。通过高效液相色谱仪进行纯化及冻干即可得到相应的干粉状目标多肽产品。
实施例2
制备多肽水凝胶及其表征的方法：
称取1mg的如实施例1所示的多肽成品，加入50μL的纯水，得到水溶液，再加入50μL的PBS(2X)，放于37℃即可形成水凝胶，此为1wt％(浓度为3.6mM)的水凝胶。
将形成的水凝胶利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)检测，结果表明其是一种纳米级的纤维结构(附图1)，利用圆二色法，波长为横坐标，有关量为纵坐标，检测其为β-折叠的二级结构(附图2)，利用流变仪进行时间扫描，横坐标为时间，纵坐标G’为储能模量和G”损耗模量，测定其稳定性，结果表明其稳定高(附图3)。
实施例2-1
称取1mg的如实施例1所示的多肽成品，加入100μL的纯水，得到水溶液，再加入100μL的PBS(2X)，放于37℃即可形成水凝胶，此为0.5wt％(浓度为1.9mM)的水凝胶。
经过实验证实，实施例1所示多肽以不同浓度形成水凝胶时，其在自组装条件、创面修复速度方面，在相同浓度下对比本领域大部分的多肽水凝胶具有明显优势。
实施例3：对HUVEC有促进增殖及迁移的效果：
取1mg多肽成品溶于1mL无菌水中，配置成3.6mM的母液，对其进行梯度稀释后，加入到提前铺好HUVEC细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)的96孔板中，每孔100μL，每个浓度三个复孔，24小时后用CCK-8(陶术)在450nm处测定OD值，得出的数值经过计算，结果表明在1nM浓度下有促进细胞增殖的效果(附图4)，其中control组肽浓度为0。
另外将细胞提前铺在6孔板中，在0小时对其进行划痕，并用PBS洗3遍，去除死细胞后，加入含有1nM的肽溶液的培养基，进行0小时拍照，24小时后再拍照观察，结果表明1nM下对细胞具有促进迁移的效果(附图5)。
实施例4：对小鼠皮肤创面损伤有促进愈合的作用：
提前按照实施例2的水凝胶制备方法(多肽产品提前照紫外1h，杀菌，且制备过程在无菌环境下进行)将其吸入于1mL的无菌注射器中用封口膜封好避免蒸发，放置在37℃恒温箱中成胶。取小鼠20只，雄性，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，用剃毛刀背部脱毛，随后用脱毛膏进行彻底去除，并用无尘棉和75％酒精将其擦拭干净，固定四肢，用7mm模具画直径为7mm的圆，以小鼠脊柱为中心，在左右各一个，去除画圆部分的皮肤，并拍照记录，PBS组和水凝胶组(Gel)，各注射100μL，注射完毕后，用医用纱布及医用胶带进行进一步包扎固定，随后腹腔注射一针庆大霉素(8万单位/2mL，0.5mL/只)，放入笼中待其麻醉醒后放回动物房饲养。拍照观察3天、5天、7天、10天、12天的皮肤愈合情况(附图6)，通过实验发现Gel组与PBS组相比有促进愈合的效果。
特别的是，本发明的水凝胶只需要进行一次给药，在12天的时候就几乎看不到创面的存在，其修复效果是非常优异的。
本发明的水凝胶、多肽并不仅仅限于作为皮肤创面修复的有效的成分，其还可以作为用于修复骨、肌腱等损伤修复的敷料、注射剂型的活性成分，比如现在已经进行的部分实验证实，该辅料对于小鼠头骨的损伤具有一定的修复促进作用，可以预测的，对于肌腱、肌肉组织等修复时需要血小板衍生生长因子参与的情况均可以适用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种多肽衍生物及其用途、水凝胶及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 多肽衍生物(人工序列)
<400> 1
Phe Phe Val Leu Glu Gly Gly Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys
1 5 10 15
Lys

Claims (9)

1.一种多肽衍生物，其特征在于，其具有：
(I)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上相似性的氨基酸序列；所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个或4个。
2.根据权利要求1所述的多肽衍生物，其特征在于，其氨基酸序列为：
X-FFVLE-GG-VRKIEIVRKK；
其中，X为封端基团。
3.根据权利要求2所述的多肽衍生物，其特征在于，所述封端基团为乙酰基、芴基甲基氧羰基、萘基或芘基。
4.一种水凝胶，其特征在于，含如权利要求1-3任一所述的多肽衍生物。
5.根据权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中的多肽衍生物的浓度为1.9mM～3.6mM。
6.根据权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，还含有缓冲溶液，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液(PBS)，所述水凝胶中的缓冲溶液的浓度为10mM～20mM。
7.一种如权利要求4-6任一所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，将多肽衍生物加入到纯水中溶解，与PBS(2X)冲液混合，在25-37℃的条件下进行自组装，即可。
8.一种如权利要求1-3任一所述的多肽衍生物的用途，作为用于修复皮肤创面的敷料、注射剂型的活性成分。
9.一种如权利要求1-3任一所述的多肽衍生物的用途，用于修复骨、肌腱的损伤修复的敷料、注射剂型的活性成分；所述敷料、注射剂型用于伤口、糖尿病足、骨损伤、颅骨损伤、牙周病、肌腱损伤的修复。
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