CN114177305B - 一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的前药纳米粒及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的前药纳米粒及其制备方法、应用。一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的自组装纳米粒，其特征在于：由具有ROS敏感键的前药和聚乙二醇化二茂铁通过自组装形成;前药与聚乙二醇化二茂铁的摩尔比为10：1~10：10，所述前药分子由具有抗肿瘤效果的药物分子和青蒿素衍生物通过ROS敏感键连接而成；其优势在于既可以利用EPR效应被动运输至肿瘤组织，又可以实现在肿瘤组织中的响应性释药，实现多机制杀伤肿瘤；同时表面的聚乙二醇可以有效延长体系循环时间，提高药效。

Description

一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的前药纳米粒及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的前药纳米粒及其制备方法、应用。
背景技术
在2020年，乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌症，可通过手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗等方法治疗乳腺癌。
大部分化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时对正常组织也造成严重损害，限制了其临床应用。纳米给药系统可在分子水平上对药物的递送和释放进行控制，通过改善药物溶解度和药动学特征，实现药物在肿瘤部位的被动或主动靶向释药，从而增强药物疗效并显著降低药物的全身毒副作用。但是最新的临床数据分析结果表明，纳米制剂仅仅提高了化疗的安全性，并没有显著提高化疗药物的抗肿瘤效果。通过化学疗法与其他疗法(如放疗、光热疗法、光动力疗法、化学动力学疗法等)的联合应用，通常能够达到单一治疗方法无法实现的治疗效果，并且不同肿瘤杀伤机制的联合应用能够克服多药耐药性，减少用药剂量。
化学动力学疗法(Chemodynamic Therapy,CDT),是一类基于铁基芬顿反应的新型肿瘤治疗技术。Fenton反应非常复杂，包含一系列反应，主要包括反应的引发、传播和终止部分。首先，在Fe2+和H2O2之间产生羟基自由基(方程式1)。然后，生成的Fe 3+被H2O2还原以再生Fe 2+(方程式2)。
肿瘤中的酸性环境和高H2O2浓度有利于Fenton反应的进行，在酸性条件下，H2O2被亚铁离子催化产生强氧化性的·OH，从而杀死肿瘤细胞。化学动力学疗法具有相对放疗、化疗、光动力学治疗等治疗策略的独特优势。(1)高度选择性。Fenton反应受pH影响很大，人体正常组织pH值维持在7.4左右，不易引发Fenton反应产生毒性·OH。(2)不必考虑肿瘤深度的问题。光的穿透深度有限，这限制了光动力学治疗和光热治疗的临床转化，基于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)的纳米制剂没有这种限制。(3)活性氧产率更高，·OH比H2O2和超氧阴离子的氧化能力更强。(4)不存在耐药性问题。虽然CDT确实能在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长，但在提高其治疗效果方面仍面临诸多挑战。动力学试剂、细胞内pH值、H2O2含量和还原性物质都直接影响Fenton反应的效率，进一步影响CDT的疗效。比如在通常情况下，Fenton试剂在酸性环境下才会发生反应，pH的提高会使·OH的生成受到限制，并且出现氢氧化铁沉淀，使催化能力丧失。如溶液中酸性过强，Fe3+不能被还原为Fe2+，催化反应也会受到阻碍。有研究结果表明，在酸性环境下，尤其是pH在3-5之间时，Fenton试剂有很强的氧化能力。Fenton试剂中Fe2+的催化效率是Fe3+的数百倍。当环境中H2O2含量过低或还原性物质含量过高时，都会减少羟自由基的生成，降低Fenton反应效率。
抗疟药青蒿素及其衍生物中的内过氧化物桥具有高度反应性，可与受疟疾感染的红细胞内的生物铁源发生反应，产生自由基和活性氧(ROS)，有助于杀死寄生虫。此外研究还发现，青蒿素及其衍生物通过促进铁蛋白的降解增加细胞内不稳定铁库，促进细胞活性氧(ROS)的积累，降低GPX4表达使肿瘤细胞对铁死亡敏感。
具有H2O2样作用的青蒿素衍生物与亚铁离子(高催化活性的动力学试剂)供体通过纳米给药系统联合递送至肿瘤组织，可充分发挥化学动力学疗效，通过其与化疗药物的共递送，可实现化学疗法与化学动力学疗法相结合。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的无载体纳米粒。
本发明的第二目的是提供该纳米粒的制备方法。
本发明的第三目的是提供该纳米粒的用途。
技术方案：
一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的自组装纳米粒，其特征在于：由具有ROS敏感键的前药和聚乙二醇化二茂铁通过自组装形成；前药与聚乙二醇化二茂铁的摩尔比为10：1～10：10，所述前药分子由具有抗肿瘤效果的药物分子和青蒿素衍生物通过ROS敏感键连接而成。
所述的自组装纳米粒，其特征在于：所述的具有抗肿瘤效果的药物分子为具有活性羟基的紫杉醇、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱；所述的青蒿素衍生物为具有活性羟基的青蒿素衍生物。
所述的自组装纳米粒，其特征在于：
所述的青蒿素衍生物为如下结构：
所述的自组装纳米粒，其特征在于所述的前药为
所述的自组装纳米粒，其特征在于：所述的ROS敏感键为草酸酯键、单硫醚键、单硒键、二硫键、二硒键或间隔二硫醚键。
所述的自组装纳米粒，其特征在于：所述的聚乙二醇化二茂铁中二茂铁供体为含反应活性基团的二茂铁衍生物。
所述的自组装纳米粒，其特征在于：所述的二茂铁为：
其中聚乙二醇为不同分子量聚乙二醇及其衍生物，如：
所述的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于：将前药分子与聚乙二醇化二茂铁、PEG修饰剂溶于有机溶剂中，在搅拌下，将该有机溶剂缓慢滴加到水中，自发形成均匀的纳米粒，除去有机溶剂，即得纳米粒。
所述的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于：所用有机溶剂为二甲基亚砜、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种有机溶剂。
所述的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于：PEG修饰剂为DSPE-PEG、DSPE-mPEG、DSPE-PEG-COOH或DSPE-PEG-NH2。
进一步而言：
本发明提供的无载体纳米粒由抗肿瘤药前药通过自组装包载聚乙二醇化二茂铁与PEG修饰剂而成，所述抗癌药前药分子由具有抗肿瘤效果的药物分子与青蒿素衍生物通过ROS敏感键连接而成。
进一步地，前药与聚乙二醇化二茂铁的摩尔比为10：1～10：10。
进一步地，前药与聚乙二醇化二茂铁的摩尔比可以为：10：1，10：4，10：10。
当前药与聚乙二醇化二茂铁的摩尔比为：10：1，10：4，10：10时，可以形成较好的自组装纳米粒。
进一步地，选用PEG修饰剂可进一步增强纳米粒在生理条件下的稳定性和网状内皮系统逃逸。
进一步地，本发明优选紫杉醇作为抗癌药，双氢青蒿素作为青蒿素衍生物，将两药物分子通过硫代二乙酸连接，得到pH和ROS双响应的前药分子(PSD)；将两药物分子通过戊二酸连接，得到碳单键连接的无pH和ROS响应性的紫杉醇-双氢青蒿素前药分子(PCD)。
其中，PSD的结构式为：
PCD的结构式为：
本发明提供所述前药和对照药物的合成方法，包括以下步骤：1.抗癌药-ROS响应中间体的合成。2.前药分子的合成。其中1是2的基础。
(1)抗癌药-ROS响应中间体的合成：将酯化反应催化剂溶于有机溶剂中，在氮气保护下，加入含羧基的ROS响应连接键，用量为催化剂的0.2-1倍摩尔量，搅拌1h；在氮气保护下，将抗癌药加入上述有机溶液中，用量为催化剂的0.2-1倍摩尔量，室温继续反应24-72h。反应完毕后，将有机溶剂浓缩，通过硅胶柱色谱分离纯化，得抗癌药-ROS响应中间体。
(2)前药分子的合成：将抗癌药-ROS响应中间体溶于有机溶剂中，在氮气保护下，加入酯化反应催化剂，用量为抗癌药-ROS响应中间体中活性羧基摩尔比的1-5倍量，搅拌1h；在氮气保护下，将青蒿素衍生物加入上述有机溶液中，用量为中间体中活性羧基摩尔比的1-5倍量，室温继续反应24-72h。反应完毕后，将有机溶剂浓缩，通过硅胶柱色谱分离纯化，得抗癌药-ROS响应中间体。
所述的酯化反应催化剂为脱水缩合剂，包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑，N-羟基丁二酰亚胺等。
所述的抗癌药包括但不限于紫杉醇，10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱等含有活性羟基的药物分子。
所述的青蒿素衍生物包括但不限于双氢青蒿素。
本发明提供所述聚乙二醇化二茂铁的合成方法，包括以下步骤：
将酯化反应催化剂溶于有机溶剂中，在氮气保护下，加入二茂铁甲酸，用量为催化剂的0.2-1倍摩尔量，搅拌1h；在氮气保护下，将聚乙二醇加入上述有机溶液中，用量为催化剂的0.2-1倍摩尔量，室温继续反应24-72h。反应完毕后，浓缩有机溶剂，用乙醚沉淀混合物，抽滤所得黄色固体即为聚乙二醇化二茂铁(Fc-PEG)。
所述的酯化反应催化剂为脱水缩合剂，包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑，N-羟基丁二酰亚胺等。
所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、氨基修饰聚乙二醇、羧基修饰聚乙二醇；聚乙二醇分子量包括但不限于1000-10000道尔顿。
Fc-PEG的结构式为：
所述的纳米粒制备方法如下：
(1)PSD前药自组装纳米粒(nano PSD)的制备方法：将一定量的PSD前药与PEG修饰剂溶解到适量有机溶剂二甲基亚砜、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种有机溶剂，优选溶剂为丙酮(PSD前药浓度范围为10～30mg/mL,PEG修饰剂浓度范围为10～30mg/mL)，在搅拌下，将该溶液缓慢滴加至水中，自发形成均匀的纳米粒。其中，前药与PEG修饰剂的摩尔比为10：1～10：2，优选比例为10：1.5，所述的PEG修饰剂为DSPE-PEG、DSPE-mPEG、DSPE-PEG-COOH或DSPE-PEG-NH2，优选的PEG修饰剂为DSPE-mPEG,所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。
(2)PSD、Fc-PEG自组装纳米粒(nano PSD-Fc)的制备方法：将一定量的PSD前药、Fc-PEG和PEG修饰剂溶解到适量有机溶剂二甲基亚砜、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种有机溶剂，优选为丙酮(PSD前药浓度范围为10～30mg/mL,Fc-PEG浓度范围为10～30mg/mL，PEG修饰剂浓度范围为10～30mg/mL)，在搅拌下，将该溶液缓慢滴加至水中，自发形成均匀的纳米粒。其中，前药与Fc-PEG的摩尔比10：1～10：10，优选比例为10：4；前药与PEG修饰剂的比例为10：1～10：2，优选比例为10：1.5，所述的PEG修饰剂为DSPE-PEG、DSPE-mPEG、DSPE-PEG-COOH或DSPE-PEG-NH2，优选的PEG修饰剂为DSPE-mPEG,所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。
(3)PCD、Fc-PEG自组装纳米粒(nano PCD-Fc)的制备方法：将一定量的PCD前药、Fc-PEG和PEG修饰剂溶解到适量有机溶剂二甲基亚砜、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种有机溶剂，优选为丙酮(PCD前药浓度范围为10～30mg/mL,Fc-PEG浓度范围为10～30mg/mL，PEG修饰剂浓度范围为10～30mg/mL)，在搅拌下，将该溶液缓慢滴加至水中，自发形成均匀的纳米粒。其中，前药与Fc-PEG的摩尔比10：1～10：10，优选比例为10：4；前药与PEG修饰剂的比例为10：1～10：2，优选比例为10：1.5，所述的PEG修饰剂为DSPE-PEG、DSPE-mPEG、DSPE-PEG-COOH或DSPE-PEG-NH2，优选的PEG修饰剂为DSPE-mPEG,所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。
设计原理
紫杉醇是多种恶性肿瘤的关键化疗成分，包括转移性乳腺癌、卵巢癌和晚期非小细胞肺癌。紫杉醇通过在肿瘤细胞中诱导形成稳定且无生物学功能的微管蛋白束，干扰肿瘤细胞的正常生理活动而促使细胞死亡。但紫杉醇水溶性差，紫杉醇制剂(Taxol)会产生严重的过敏反应、肾毒性及神经毒性，且单一化疗药物的应用往往由于肿瘤细胞耐药性的快速发展而无法达到完全的癌症缓解效果。已有研究表明，将化学动力学疗法与化学疗法联合，可获得更高的治疗效率，并抑制耐药性。
双氢青蒿素的内过氧化物桥具有高度反应性，在肿瘤细胞内与内源性铁作用产生自由基与活性氧，能有效杀伤肿瘤。将紫杉醇分子与双氢青蒿素分子通过化学键连接，减弱了紫杉醇的结构刚性，使其可以在水中自组装形成粒径更小且均一的球形纳米粒，且紫杉醇可与双氢青蒿素以精确的比例共同递送至肿瘤细胞，发挥不同肿瘤杀伤机制的协同作用。
聚乙二醇化二茂铁与前药分子在水中自组装形成无载体纳米粒，其中二茂铁结构作为亚铁离子的稳定供体，PEG结构作为亲水层包裹在纳米粒表面。
所示的纳米粒在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，纳米粒的PEG亲水层可减少网状内皮系统对自身的吞噬，通过增强通透性和保留(EPR)效应增强治疗药物在肿瘤部位的积累，pH和ROS双响应实现在肿瘤微环境中靶向释放。紫杉醇诱导产生微管蛋白束；双氢青蒿素可诱导肿瘤细胞铁死亡，同时亚铁离子可催化双氢青蒿素产生和内源性H2O2自由基和活性氧，实现了化学疗法与化学动力学疗法相结合，显著提高了治疗效果。
即使设计好如上纳米粒，下列难题依然需要面对：
1)紫杉醇能否顺利递送肿瘤部位
2)纳米粒的在血液中稳定存在
3)青蒿素形成复合物后是否依然可以与茂铁反应。
有益效果
(1)本发明涉及的PSD和PCD是全新的结构，组建纳米粒是全新构思，即本发明提供的无载体纳米粒由抗肿瘤药前药通过自组装包载聚乙二醇化二茂铁与PEG修饰剂而成，所述抗癌药前药分子由具有抗肿瘤效果的药物分子与青蒿素衍生物通过ROS敏感键连接而成。其优势在于既可以利用EPR效应被动运输至肿瘤组织，又可以实现在肿瘤组织中的响应性释药，实现多机制杀伤肿瘤；同时表面的聚乙二醇可以有效延长体系循环时间，提高药效。
(2)该自组装纳米粒粒径为130-140nm，粒径均一，在血液中可稳定存在；
(3)具有肿瘤微环境响应性释放效果，在肿瘤微环境的酸性和高H2O2浓度条件下响应裂解释放出前药，前药进一步水解释放抗癌药和青蒿素衍生物。青蒿素形成复合物后，仍可与二茂铁反应。PSD、Fc-PEG自组装纳米粒(nano PSD-Fc)在pH＝7.4条件下，48h后仅有40％的紫杉醇释放，在pH＝5.8，含10mM H2O2条件下，48h后有90％紫杉醇释放。
(4)该自组装纳米粒中含有的前药和二茂铁能够实现化学疗法和化学动力学疗法的协同抗肿瘤效果。接受nano PSD-Fc给药的小鼠，其肿瘤体积与重量明显小于接受单独紫杉醇与双氢青蒿素给药的小鼠。
附图说明
图1为本发明实施例1中单硫醚键连接的前药的1H-NMR谱图。
图2为本发明实施例1中单硫醚键连接的前药的ESI-MS谱图。
图3为本发明实施例2中碳单键连接的前药的1H-NMR谱图。
图4为本发明实施例2中碳单键连接的前药的ESI-MS谱图。
图5为本发明实施例3中聚乙二醇化二茂铁的1H-NMR谱图。
图6为本发明实施例4中自组装纳米粒的形成示意图。
图7为本发明实施例4中自组装形成的纳米粒的透射电子显微镜图。其中a、b图分别为nano PSD和nano PSD-Fc的透射电子显微镜图。
图8为本发明实施例5中纳米粒在生理溶液中的粒径-时间变化图，其中a、b图分别为分发明实例4中三种纳米粒在PBS和含10％血清的PBS溶液中的粒径-时间变化图。
图9为本发明实施例6中游离紫杉醇、三种纳米粒在不同过氧化氢含量与pH条件下的药物释放图，其中a、b、c、d分别为游离紫杉醇、nano PSD、nano PCD-Fc、nano PSD-Fc在不同过氧化氢含量与pH条件下的药物释放图。
图10为本发明实施例7中不同制剂的体外ROS生成情况图，a为nano PSD-Fc在不同pH条件下孵育24h，对亚甲基蓝的降解情况图；b为5mM不同游离药物与Fc-PEG共孵育24h，对亚甲基蓝的降解情况图。
图11为本发明实施例8中的细胞毒性图，a为游离药物对4T1细胞的细胞毒性图；b为含不同量Fc-PEG的PSD前药纳米粒对4T1细胞的细胞毒性图；c为三种纳米粒对4T1细胞的细胞毒性图。
图12为本发明实施例9中不同制剂(游离Fc-PEG、H2O2、H2O2与Fc-PEG物理混合物、DHA、DHA与Fc-PEG物理混合物、nano PSD、nano PSD-Fc、nano PCD-Fc)对4T1细胞中ROS水平影响图。a为一定浓度的不同制剂对4T1细胞ROS水平的影响图，b为不同浓度DHA、DHA与Fc-PEG物理混合物对4T1细胞ROS水平的影响图，c为不同浓度nano PSD、nano PSD-Fc、nanoPCD-Fc对4T1细胞ROS水平的影响图。
图13为本发明实施例10中不同制剂(游离Fc-PEG、H2O2、H2O2与Fc-PEG物理混合物、DHA、DHA与Fc-PEG物理混合物、nano PSD、nano PSD-Fc、nano PCD-Fc)对4T1细胞的脂质过氧化水平影响图。a为一定浓度的不同制剂对4T1细胞脂质过氧化水平的影响图，b为不同浓度DHA、DHA与Fc-PEG物理混合物对4T1细胞脂质过氧化水平的影响图，c为不同浓度nanoPSD、nano PSD-Fc、nano PCD-Fc对4T1细胞脂质过氧化水平的影响图。
图14为本发明实施例11中不同制剂的在体抗肿瘤实验图，其中a、b分别为实验结束后肿瘤重量和体积图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例中。
实施例1单硫醚键连接的紫杉醇-双氢青蒿素前药的合成(PSD)。
称取硫代二乙酸(150.15mg，1mmol)，二甲氨基吡啶(12.22mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg，1.06mmol)溶于无水二甲基甲酰胺中，在冰浴下搅拌1h，随后将紫杉醇(853.91mg，1mmol)加入反应体系中，转至室温反应24h。反应结束后将有机溶剂滴加至冷水中得白色沉淀物，抽滤并用无水硫酸钠干燥得中间体。中间体与二甲氨基吡啶(12.22mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg，1.06mmol)溶于无水二氯甲烷中，在冰浴下搅拌1h，随后将双氢青蒿素(568.70mg，2mmol)加入反应体系中，转至室温反应24h。通过硅胶柱色谱分离纯化。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例1中所合成的化合物结构，选用氘代溶剂为CDCl3，结果如图1。通过LC-MS确定实施例1中所合成的化合物的分子量，结果如图2，单硫醚键连接的紫杉醇-双氢青蒿素前药的理论分子量为1252.39.，LC-MS结果图中显示[M+Na]+：1275.7。
实施例2碳单键连接的紫杉醇-双氢青蒿素前药的合成(PCD)
称取戊二酸(132.11mg，1mmol)，二甲氨基吡啶(12.22mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg，1.06mmol)溶于无水二甲基甲酰胺中，在冰浴下搅拌1h，随后将紫杉醇(853.91mg，1mmol)加入反应体系中，转至室温反应24h。反应结束后将有机溶剂滴加至冷水中得白色沉淀物，抽滤并用无水硫酸钠干燥得中间体。中间体与二甲氨基吡啶(12.22mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg，1.06mmol)溶于无水二氯甲烷中，在冰浴下搅拌1h，随后将双氢青蒿素(568.70mg，2mmol)加入反应体系中，转至室温反应24h。通过硅胶柱色谱分离纯化。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例2中所合成的化合物结构，选用氘代溶剂为CDCl3，结果如图3。通过LC-MS确定实施例1中所合成的化合物的分子量，结果如图4，单硫醚键连接的紫杉醇-双氢青蒿素前药的理论分子量为1234.36.，LC-MS结果图中显示[M+Na]+：1257.6。
实施例3聚乙二醇化二茂铁的合成(Fc-PEG)
称取二茂铁甲酸(230.04mg，1mmol)，在氮气保护下，二甲氨基吡啶(12.22mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg，1.06mmol)溶于无水二氯甲烷中，在冰浴下搅拌1h；随后将聚乙二醇单甲醚2000(2000.00mg，1mmol)加入反应体系中，转至室温反应24h。反应完毕后，浓缩有机溶剂，用乙醚沉淀混合物，抽滤所得黄色固体即为聚乙二醇化二茂铁(Fc-PEG)。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例3中所合成的化合物结构，选用氘代溶剂为CDCl3，结果如图5。
聚乙二醇化二茂铁(Fc-PEG)的结构式为：
实施例4紫杉醇-双氢青蒿素前药纳米粒的制备
称取一定量实施例1中所制备的紫杉醇-双氢青蒿素前药，DSPE-mPEG2000溶于无水丙酮中，配制成10mg/mL的PSD储备液和DSPE-mPEG储备液。
当前药与DSPE-mPEG的摩尔比为10：1时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液和10μL DSPE-mPEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD。
当前药与DSPE-mPEG的摩尔比为10：1.5时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液和15μL DSPE-mPEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD。
当前药与DSPE-mPEG的摩尔比为10：2时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液和20μL DSPE-mPEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD。
当前药与DSPE-mPEG的摩尔比为10：1，10：1.5，10：2时，能形成自组装纳米粒，其粒径分布及24h后粒径分布如表1。
表1前药与DSPE-mPEG的处方优化
PSD与Fc-PEG自组装纳米粒(nano PSD-Fc)的制备：
称取一定量实施例1中所制备的紫杉醇-双氢青蒿素前药，DSPE-mPEG2000，Fc-PEG溶于无水丙酮中，配制成10mg/mL的PSD储备液、DSPE-mPEG储备液和Fc-PEG储备液。
当前药与DSPE-mPEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：1时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液、15μL DSPE-mPEG溶液、10μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD-Fc。
当前药与DSPE-mPEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：4时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液、15μL DSPE-mPEG溶液、40μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD-Fc。
当前药与DSPE-mPEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：10时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液、15μL DSPE-mPEG溶液、100μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PSD-Fc。
当前药与DSPE-mPEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：1，10：1.5：4，10：1.5：10时，均能形成粒径为140nm左右的均一纳米粒，其对4T1细胞的IC50值如表2。
表2前药，DSPE-mPEG，Fc-PEG的处方优化
PCD与Fc-PEG自组装纳米粒(nano PCD-Fc)的制备
称取一定量实施例2中所制备的紫杉醇-双氢青蒿素前药，DSPE-mPEG2000，Fc-PEG溶于无水丙酮中，配制成10mg/mL的PCD储备液、DSPE-mPEG储备液和Fc-PEG储备液。
当实施例2中前药与DSPE-mPEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：4时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PCD溶液、15μL DSPE-mPEG溶液、40μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得所述纳米粒nano PCD-Fc。
通过透射电子显微镜观察纳米粒nano PSD、nano PSD-Fc的外观形貌，结果如图7，nano PSD纳米粒形状均一，在没有Fc-PEG的情况下，呈致密球形。nano PSD-Fc纳米粒粒径分布均一，外观呈球形，且具有明显的PEG亲水层。
实施例5三种前药纳米粒的稳定性
取2mL实施例4中所制备的三种前药纳米粒nano PSD、nano PSD-Fc、nano PCD-Fc分散于10mL PBS(pH＝7.4)及含10％血清的PBS(pH＝7.4)中，通过马尔文激光粒度仪监测纳米粒的粒径变化。图8a、b分别显示在不同时间内三种纳米制剂在PBS和含10％血清的PBS中的粒径基本稳定，证实了三种纳米粒在模拟生理环境中的稳定性。
实施例6三种纳米粒在不同条件下的体外药物释放
本发明采用动态透析法考察载药纳米粒释放行为。精密量取一定体积纳米粒(约含PTX 100μg)，置于透析袋(截留分子量：3500Da)内，束紧口，投入25mL含或不含过氧化氢，pH值为7.4，或5.8的含0.5％(w/m)吐温80的PBS中，于37℃±0.5℃，100r/min振摇，分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24h取样1mL，同时补充相同体积和温度的新鲜释放介质。样品经0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液取20μL，用HPLC测定PTX含量，并计算累积释放百分数。结果如图9所示，nano PSD和nano PCD-Fc无pH和ROS响应性，在48h后累积释放量少于40％，而nano PSD-Fc在pH＝5.8，10mM H2O2条件下48h后累积释放量达90％。证实了nanoPSD-Fc具有pH和ROS双响应性。
实施例7不同制剂体外ROS生成量考察
本发明采用亚甲基蓝(MB)检测体外ROS的生成。在酸性条件下，H2O2在亚铁离子催化下产生的·OH可降解亚甲基蓝。配置含10mM H2O2的pH＝7.4和5.8的缓冲液，分别与Fc-PEG或制剂孵育24h，离心收集上清液，通过紫外分光光度计扫描上清液在590nm-730nm处的紫外吸收来测量·OH诱导的亚甲基蓝降解。亚甲基蓝降解结果如图10所示。其中图a为制剂在不同条件下对MB的降解，在酸性条件下，H2O2基本不降解MB,制剂能产生更多的活性氧降解MB；图b为5mM DHA、PSD、PCD与Fc-PEG在pH＝5.8时共孵育对亚甲基蓝的降解，双氢青蒿素制成前药，不影响其过氧桥键的H2O2样作用，在酸性条件与二茂铁催化下产生活性氧降解MB。
实施例8不同制剂对小鼠4T1细胞的细胞毒性
将处于对数生长期的4T1细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，培养至细胞汇合度达80％。将梯度浓度的实施例4中所制备的纳米粒以及游离药物，游离药物与Fc-PEG混合物加入各孔中，设置三个复孔，每孔200μL，经过20h孵育后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续孵育4h。随后弃去上清液，加入200μL DMSO溶解，用酶标仪在492nm下测定吸光度，测定纳米粒对4T1细胞的毒性。毒性结果(图11)显示游离药物与Fc-PEG混合物对4T1细胞的毒性明显强于单独游离药物的细胞毒性，nano PSD-Fc细胞毒性强于其余两个制剂，证实了nano PSD-Fc的强肿瘤杀伤作用。当PSD与Fc-PEG的摩尔比为10：1时，细胞毒性较摩尔比为10：4和10：10的制剂毒性弱，PSD与Fc-PEG的摩尔比为10：4与10：10时，细胞毒性无显著差异。
实施例9不同制剂对4T1细胞中ROS水平的影响
将处于对数生长期的4T1细胞以10000个/孔的密度接种于12孔板中，培养至细胞汇合度达80％。将梯度浓度的实施例4中所制备的纳米粒以及游离药物，游离药物与Fc-PEG混合物加入各孔中，设置三个复孔，每孔1mL，孵育6h，移除培养基，细胞用PBS清洗两次，并通过1X胰蛋白酶EDTA处理得游离细胞，离心收集细胞，将细胞在含10μM DCFH-DA的无血清培养基中避光、37℃孵育30min。细胞用PBS洗涤两次，通过流式细胞仪测量荧光强度。结果如图12所示。
游离二茂铁不会增加4T1中ROS含量，DHA对4T1细胞中ROS诱导效果强于H2O2，这可能是由于DHA的化学稳定性较H2O2更强。H2O2和DHA与Fc-PEG联用时可显著增加4T1细胞中ROS含量，这是由于其在亚铁离子催化下产生了氧化活性更强的ROS。DHA、DHA与Fc-PEG联用、nano PSD、nano PSD-Fc诱导4T1细胞中ROS的生成呈浓度依赖性，且纳米粒诱导4T1细胞中ROS的生成较游离药物更强，这可能是由于细胞对纳米粒更强的吞噬作用。nano PCD-Fc虽然能诱导ROS的产生，但无明显浓度依赖性，这是由于仅有部分纳米粒裂解释放出少量PCD与Fc-PEG，产生少量ROS。
实施例10不同制剂对4T1细胞的脂质过氧化水平的影响
将处于对数生长期的4T1细胞以10000个/孔的密度接种于12孔板中，培养至细胞汇合度达80％。将梯度浓度的实施例4中所制备的纳米粒以及游离药物，游离药物与Fc-PEG混合物加入各孔中，设置三个复孔，每孔1mL，孵育24h，移除培养基，细胞用PBS清洗两次后，在含2μM C11 BODIPY 581/591的无血清培养基中避光、37℃孵育30min，细胞用PBS洗涤两次，通过1X胰蛋白酶EDTA处理得游离细胞，离心收集细胞，用流式细胞仪测量荧光强度。结果如图13所示。
C11 BODIPY 581/591中还原型染料的荧光强度越弱，细胞脂质过氧化程度越强。游离二茂铁对4T1细胞脂质过氧化基本无影响，DHA对4T1细胞脂质过氧化诱导效果强于H2O2，这可能是由于DHA的化学稳定性较H2O2更强。H2O2和DHA与Fc-PEG联用时可显著增加4T1细胞脂质过氧化程度，这是由于其在亚铁离子催化下产生了氧化活性更强的ROS，ROS进一步氧化细胞中脂质，且DHA与亚铁离子产生的自由基也可使脂质过氧化。DHA、DHA与Fc-PEG联用、nano PSD、nano PSD-Fc诱导4T1细胞脂质过氧化呈浓度依赖性；nano PCD-Fc虽然能诱导4T1细胞脂质过氧化，但无明显浓度依赖性，这是由于仅有部分纳米粒裂解释放出少量PCD与Fc-PEG，产生少量ROS使脂质过氧化。
实施例11不同制剂的在体抗肿瘤实验
将4T1细胞悬液(1x 106cells/100μL)接种于雌性Balb/C第四对乳腺脂肪垫下。待肿瘤体积生长至150mm3时，将荷瘤小鼠随机分组，每组五只,分别给与生理盐水、紫杉醇、紫杉醇与双氢青蒿素物理混合物、实施例4中制备的前药自组装纳米粒。每隔1天给药1次，连续给药6次，按紫杉醇计算，给药剂量为10mg/kg。抑瘤效果如图14所示。
与对照组相比，游离PTX与nano PCD-Fc均未能明显抑制肿瘤生长；nano PSD、游离PTX与DHA联用，通过影响肿瘤细胞微管蛋白与诱导细胞铁死亡，对肿瘤生长有更强的抑制作用；nano PSD-Fc通过化学疗法与化学动力学疗法相结合，对肿瘤生长有最强的抑制作用。
对比例1：PEG修饰剂对纳米粒稳定性的影响
称取一定量实施例1中所制备的紫杉醇-双氢青蒿素前药、Fc-PEG、DSPE-PEG2000溶于无水丙酮中，配制成10mg/mL的PSD储备液、Fc-PEG储备液和DSPE-PEG储备液。
当前药与Fc-PEG的摩尔比为10：4时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液、40μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得纳米粒nano PSD-FC。纳米粒无法在PBS中立即凝集产生沉淀。
当前药与DSPE-PEG、Fc-PEG的摩尔比为10：1.5：4时，在搅拌速度1500rpm条件下，将混合溶液(100μL PSD溶液、15μL DSPE-PEG溶液、40μL Fc-PEG溶液)缓慢滴加至3.5mL水中，通过透析除去有机溶剂，超滤浓缩至4mL，即得纳米粒nano PSD-Fc。纳米粒在PBS中孵育24h后产生沉淀。
对比例2：Fc-PEG含量过高对纳米粒稳定性的影响
当前药与Fc-PEG的摩尔比大于10：10时，亲水性的Fc-PEG影响疏水性前药在水中的自组装，无法形成纳米粒。
对比例3：Fc-PEG含量过低对纳米粒细胞毒性的影响
当前药与Fc-PEG的摩尔比小于10：1时，可形成稳定的纳米粒，但过低的亚铁离子浓度降低了Fenton反应效率，进一步影响化学动力学疗效。

Claims (5)

1.一种诱导肿瘤细胞多机制死亡的自组装纳米粒，其特征在于：由前药和PEG修饰的二茂铁、PEG修饰剂通过自组装形成；前药与PEG修饰的二茂铁的摩尔比为10：1～10：10，所述的前药为：
Figure FDA0004138738880000011
2.根据权利要求1所述的自组装纳米粒，其特征在于：制备PEG修饰的二茂铁时，所用的二茂铁为
Figure FDA0004138738880000012
制备PEG修饰的二茂铁时，所用的PEG为
Figure FDA0004138738880000013
3.根据权利要求1或2所述的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于：将前药分子与PEG修饰的二茂铁、PEG修饰剂溶于有机溶剂中，在搅拌下，将该有机溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的纳米粒，除去有机溶剂，即得纳米粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所用有机溶剂为二甲基亚砜、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或几种有机溶剂；PEG修饰剂为DSPE-PEG、DSPE-mPEG、DSPE-PEG-COOH或DSPE-PEG-NH2。
5.根据权利要求1或2所述的自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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