CN114177169A - 一种使用硫化氢缓释供体adt-oh抑制黑色素瘤转移的方法及其应用 - Google Patents

一种使用硫化氢缓释供体adt-oh抑制黑色素瘤转移的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种使用硫化氢缓释供体ADT‑OH抑制黑色素瘤转移的方法及其应用。本发明的一种使用硫化氢缓释供体ADT‑OH抑制黑色素瘤转移和生长的方法，改变肿瘤部位硫化氢含量，进而影响黑色素瘤细胞迁移和生长，从而达到抑制黑色素瘤转移和生长的效果。硫化氢缓释供体ADT‑OH可以在体内缓慢释放硫化氢，且对正常细胞的杀伤力较小，以较低浓度即可对黑色素瘤细胞产生迁移抑制作用。本发明的ADT‑OH通过抑制黑色素瘤细胞EMT过程抑制黑色素瘤细胞迁移，进而抑制肿瘤细胞转移，且对正常细胞杀伤力小，药物用量小，毒副作用少，其效果显著好于硫化氢标准供体硫氢化钠；本发明系首次应用硫化氢缓释供体ADT‑OH治疗黑色素瘤迁移和生长，目前尚未见相关报道。

Description

一种使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法及 其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移和生长的方法及其应用。
背景技术
黑色素瘤是最常见和最具转移性的恶性皮肤癌之一。流行病学数据显示，全世界每年诊断出约132,000例黑色素瘤新增病例和50,000例黑色素瘤相关死亡病例(Geller等,2013，JClin Oncol，31:4172-4178.)，而肿瘤转移是该病患者死亡的主要原因。目前针对黑色素瘤的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗以及肿瘤疫苗治疗等。如果能在黑色素瘤转移前进行切除，病患的5年生存率约为98％；而一旦黑色素瘤发生转移，这一比率将降为10-15％(Palrasu等,2019，Cell Physiol Biochem，53:656-686)。在诊断时，许多黑色素瘤患者已经发生转移进而导致其高致死率(Mishra等,2018，J CancerRes Clin Oncol，144:2283-2302)。且转移性黑色素瘤对目前可用的治疗剂均反应不佳。迄今为止，临床上还未有针对转移性黑色素瘤有效的治疗药物。因此，开发更有效的抗黑色素瘤迁移的化合物势在必行。
依据细胞形态和机体组织器官的不同，细胞可分为上皮细胞和间质细胞两类。主要区别在于上皮细胞连接紧密，具有细胞极性，而间质细胞没有极性，缺少细胞间的相互联系。细胞向间充质状态的转变的过程，称为上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。肿瘤转移是一个复杂的生物学过程，涉及多个连续且相互关联的生物学过程，如细胞分离、粘附、侵袭和迁移等(Pal,2019，J Cell Physiol，234:20266-20274)。EMT过程在多种肿瘤功能中发挥重要作用，比如肿瘤转移、肿瘤细胞迁移、肿瘤干性和肿瘤发生发展等(Pastushenko和Blanpain,2019，Trends Cell Biol，29:212-226)。大量研究均表明EMT过程在肿瘤进展和转移中起到决定性作用(Aiello和Kang,2019，J Exp Med，216:1016-1026；Cho等,2019，Archives of pharmacal research，42:14-24；He等,2019，Arch Pharm Res，42:442-447；Tulchinsky等,2019，Biochim Biophys Acta RevCancer，1871:29-39)。肿瘤侵袭转移级联反应始于EMT的发生，EMT过程使得原始肿瘤上皮细胞丧失细胞间连接和细胞极性，获得了迁移和侵袭基底膜及血管的能力。这些细胞进入血管后以循环肿瘤细胞形式在血管中运动(Jolly等,2015，Front Oncol，5:155)。在到达血管远端后，EMT过程又使肿瘤细胞内某些蛋白去酪氨酸化，进而介导微管蛋白微触角的形成，使得肿瘤细胞附着在血管内皮层，促进细胞渗出血管(Gurzu等,2015，World J ClinCases，3:393-404)。渗出血管后，肿瘤细胞通过EMT的逆过程MET重新由间质细胞表型转化为上皮细胞表型，最终形成转移灶或继发性肿瘤。因此，开发具有抑制肿瘤细胞EMT活性的药物在治疗肿瘤转移方向具有重要意义。
硫化氢(H2S)现在被广泛认为是第三种内源性气体传递物，在肿瘤发生发展过程中起着关键作用，近年来已成为肿瘤生物学的研究热点之一。大量研究发现H2S在培养的细胞和肿瘤组织中发挥显著及多样的抗肿瘤活性，包括诱导细胞凋亡、抑制增殖、抑制肿瘤转移和肿瘤血管生成等(Fan K等，2014，Cell Signal，26:2801-2808；Olah G等，2018，Biochem Pharmacol，149:186-204；Yang等,2017，Front Pharmacol，8:664)。细胞内的H2S由β-胱硫醚合酶(CBS)、γ-胱硫醚裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)等介导生成(Kashfi and Olson,2013，Biochem Pharmacol，85:689-703)。越来越多的研究发现，CSE、CBS和3-MST在多种肿瘤细胞中发挥着重要作用。例如，在结肠癌中，CBS、CSE和3-MST的表达水平均显著上调；在卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌和胆囊腺癌组织中也发现了高表达的CSE水平；并且在前列腺癌、胃癌和黑色素瘤细胞中CBS的表达水平也显著上调(Wang等,2021，Int J Mol Sci，22)。因此，调节H2S生成酶的表达水平从而改变肿瘤的H2S含量，可能是改变肿瘤微环境、影响肿瘤细胞生长和转移的可行方法(Giuffre等,2020，Adv Exp MedBiol，1219:335-353)。研究发现，多种硫化氢供体，如DATS、GYY4137和ATB-346等对包括肺癌、肝癌、前列腺癌和其他癌症在内的多种肿瘤表现良好的抗肿瘤效果(De Cicco等,2016，Pharmacol Res，114:67-73；Lee等,2011，PloS one，6:e21077；Yi和Su,2013，Food ChemToxicol，57:362-370)。但对转移性能强、恶性程度高的黑色素瘤的报道甚少，尤其是在治疗黑色素瘤转移方面更是欠缺，从而反映出研发抑制黑色素瘤转移的药物的难度。DATS、GYY4137和ATB-346等硫化氢供体虽在实验研究阶段进行了测试并取得了诸多实验结果，但由于它们作为硫化氢供体的内在特征差异显著，如硫化氢释放的动力学、pH依赖性、进入细胞的能力、安全性等等；所以针对不同的疾病或者不同肿瘤往往出现不同的结论。
因此开发更好、更安全有效的抗黑色素瘤迁移的硫化氢供体药物也是极为必要的。[5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫代环戊烯-3-硫酮](ADT-OH)是广泛应用的有机硫化氢供体之一，能缓慢释放硫化氢，调控其在体浓度，且对正常细胞杀伤力小，对神经细胞具有一定保护作用。尽管ADT-OH在神经细胞显示出一定的保护作用，但是考虑到神经细胞对药物刺激反应敏感，硫化氢缓释供体ADT-OH对于黑色素瘤的作用如何，能否影响黑色素瘤转移，这是需要深入探索和研究。
发明内容
本发明目的是针对以上存在的问题提供一种较为安全的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移和生长的方法及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移和生长的方法，改变肿瘤部位硫化氢含量，进而影响黑色素瘤细胞迁移，从而达到抑制黑色素瘤转移和生长的效果。
进一步地，硫化氢缓释供体ADT-OH可以在体内缓慢释放硫化氢，且对正常细胞的杀伤力较小，以较低浓度即可对黑色素瘤细胞产生迁移抑制作用。
进一步地，通过不同浓度ADT-OH对构建的B16F10鼠源黑色素瘤细胞的黑色素瘤足掌转移模型、B16F10黑色素瘤肺转移模型以及A375人源黑色素瘤细胞的黑色素瘤肺转移模型三种动物模型治疗，检验了ADT-OH治疗黑色素瘤迁移和生长的作用效果，表明ADT-OH显著抑制肿瘤动物模型中黑色素瘤的转移和生长。
更进一步地，使用较为安全硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤细胞在体内外转移。
进一步地，在体实验中ADT-OH显著抑制小鼠肿瘤转移模型中黑色素瘤细胞转移和生长。
进一步地，ADT-OH在体外显著抑制黑色素瘤细胞迁移，包括抑制其细胞划痕的愈合及其垂直迁移速率。
更进一步地，低浓度的ADT-OH通过抑制黑色素瘤细胞上皮细胞-间充质转化EMT过程抑制黑色素瘤细胞迁移。
进一步地，低浓度的ADT-OH通过改变黑色素瘤细胞形态及调节细胞EMT标志物表达抑制黑色素瘤细胞EMT过程进而抑制黑色素瘤迁移。
有益效果：本发明的方法应用硫化氢缓释供体ADT-OH治疗黑色素瘤转移，效果较好，药物用量少也较为安全，抑制黑色素瘤细胞迁移的潜在治疗方案。本发明首次提出了ADT-OH应用于抗黑色素瘤转移研究，为治疗黑色素瘤转移药物开发及硫化氢相关药物应用拓展提供了新思路和新方向。
与现有的技术相比，本发明涉及的抑制黑色素瘤迁移的药物具有以下的优点和显著进步：ADT-OH通过抑制黑色素瘤细胞EMT过程抑制黑色素瘤细胞迁移，进而抑制肿瘤细胞转移和生长，且对正常细胞杀伤力小，药物用量小，毒副作用少，且作用效果好于硫化氢标准供体硫氢化钠；本发明系首次应用硫化氢缓释供体ADT-OH治疗黑色素瘤迁移，目前尚未见相关报道；此外，本发明首次提出了ADT-OH在制备抑制黑色素瘤转移药物中的用途，及该化合物在制备抗恶性黑色素瘤药物中的用途。
附图说明
图1为本发明的ADT-OH在小鼠黑色素瘤足垫转移模型中抑制黑色素瘤转移和生长。
图1A为本发明的小鼠足垫转移模型的代表性图像及实验结束时各组小鼠足垫部位肿瘤体积：1.溶剂组小鼠；2.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠；3.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠。(n＝6；数据表示为平均值±SD；*p<0.05，**p<0.01)
图1B为本发明的足垫转移模型各组小鼠肺部H&E组织染色结果及肿瘤面积定量统计：1.正常小鼠肺部组织切片；2.口服溶剂组小鼠肺部组织切片；3.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠肺部组织切片；4.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠肺部组织切片。(比例尺＝100μm；数据表示为平均值±SD；**p<0.01,***p<0.005)
图2为本发明的ADT-OH在小鼠黑色素瘤肺转移模型中抑制黑色素瘤转移和生长。
图2A为本发明的尾静脉注射B16F10细胞3周后各组小鼠的代表性肺部图像：1.正常小鼠肺组织；2.口服溶剂组小鼠肺组织；3.口服18.75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织；4.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织；5.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织；6.口服1.4mg/kg NaHS组小鼠肺组织；7.口服2.8mg/kg NaHS组小鼠肺组织；8.口服5.6mg/kg NaHS组小鼠肺组织。(n＝6)
图2B为本发明的小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型中各组小鼠肺部H&E组织染色结果及肿瘤面积定量统计：1.正常小鼠肺组织切片；2.口服溶剂组小鼠肺组织切片；3.口服18.75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织切片；4.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织切片；5.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织切片；6.口服1.4mg/kg NaHS组小鼠肺组织切片；7.口服2.8mg/kg NaHS组小鼠肺组织切片；8.口服5.6mg/kg NaHS组小鼠肺组织切片。(比例尺＝100μm；数据表示为平均值±SD；**p<0.01,***p<0.005)
图2C为本发明的尾静脉注射A375细胞3周后各组小鼠的代表性肺部图像：1.正常小鼠肺组织；2.口服溶剂组小鼠肺组织；3.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织；4.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织；5.口服2.8mg/kg NaHS组小鼠肺组织。(n＝6)
图2D为本发明的小鼠A375黑色素瘤肺转移模型中各组小鼠肺部H&E组织染色结果及肿瘤面积定量统计：1.正常小鼠肺组织切片；2.口服溶剂组小鼠肺组织切片；3.口服37.5mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织切片；4.口服75mg/kg ADT-OH组小鼠肺组织切片；5.口服2.8mg/kg NaHS组小鼠肺组织切片。(比例尺＝100μm；数据表示为平均值±SD；**p<0.01,***p<0.005)
图3为本发明的ADT-OH在体外抑制3种黑色素瘤细胞迁移。
图3A为本发明的黑色素瘤细胞系B16F10在不同浓度ADT-OH处理后的划痕愈合代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.12.5μM ADT-OH处理组；4.50μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001)
图3B为本发明的黑色素瘤细胞系B16F1在不同浓度ADT-OH处理后的划痕愈合代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.12.5μM ADT-OH处理组；4.50μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005)
图3C为本发明的人源黑色素瘤细胞系A375在不同浓度ADT-OH处理后的划痕愈合代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.12.5μM ADT-OH处理组；4.50μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；*p<0.05,**p<0.01)
图4为本发明的ADT-OH在体外抑制3种黑色素瘤细胞纵向迁移。
图4A为本发明的黑色素瘤细胞系B16F10在不同浓度ADT-OH处理后的Transwell实验的代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；**p<0.01,***p<0.005)
图4B为本发明的黑色素瘤细胞系B16F1在不同浓度ADT-OH处理后的Transwell实验的代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；*p<0.05,***p<0.005)
图4C为本发明的人源黑色素瘤细胞系A375在不同浓度ADT-OH处理后的Transwell实验的代表性图像及其统计结果：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(n＝3；数据表示为平均值±SD；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005)
图5为本发明的ADT-OH调节3种黑色素瘤细胞形态。
图5A为本发明的黑色素瘤细胞系B16F10在不同浓度ADT-OH处理后细胞F-肌动蛋白免疫荧光染色的代表性图像：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(比例尺＝20μm)
图5B为本发明的黑色素瘤细胞系B16F1在不同浓度ADT-OH处理后细胞F-肌动蛋白免疫荧光染色的代表性图像：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(比例尺＝20μm)
图5C为本发明的人源黑色素瘤细胞系A375在不同浓度ADT-OH处理后细胞F-肌动蛋白免疫荧光染色的代表性图像：1.DMSO溶剂组；2.6.3μM ADT-OH处理组；3.25μM ADT-OH处理组；4.100μM ADT-OH处理组。(比例尺＝20μm)
图6为本发明的ADT-OH抑制黑色素瘤细胞EMT进程。
图6A为本发明的黑色素瘤细胞系B16F10在不同浓度ADT-OH处理后细胞波形蛋白(Vimentin，红色)和E-钙粘蛋白(E-Cadherin,绿色)免疫荧光染色的代表性图像：1.DMSO溶剂组；2.3.2μM ADT-OH处理组；3.6.3μM ADT-OH处理组；4.12.5μM ADT-OH处理组5.25μMADT-OH处理组；6.50μM ADT-OH处理组。(比例尺＝50μm)。
图6B为本发明的人源黑色素瘤细胞系A375在不同浓度ADT-OH处理后细胞波形蛋白(Vimentin，红色)和E-钙粘蛋白(E-Cadherin,绿色)免疫荧光染色的代表性图像：1.DMSO溶剂组；2.3.2μM ADT-OH处理组；3.6.3μM ADT-OH处理组；4.12.5μM ADT-OH处理组5.25μMADT-OH处理组；6.50μM ADT-OH处理组。(比例尺＝50μm)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进一步说明。
实施例1
ADT-OH在小鼠黑色素瘤足垫转移模型中抑制黑色素瘤转移和生长
实验中使用小鼠均在无菌通风、恒湿恒温的SPF级别环境中饲养。小鼠均可自由摄水、取食。硫化氢缓释供体ADT-OH使用0.5％CMC(羧甲基纤维素)配置。选择5-6周龄雄性C57BL/6小鼠，使用Hamilton注射器和25号针头将B16F10细胞(2×105个细胞/50μLPBS/只)植入小鼠的右后足垫中。自接种肿瘤5天后每天给与小鼠100μL/只的0.5％CMC、37.5mg/kgADT-OH及75mg/kg ADT-OH，直至肿瘤接种21天后对所有小鼠实施安乐死，以评估小鼠肺部黑色素瘤自发转移的数量。以下公式用于测量和计算足底肿瘤体积：0.5236×L1×(L2)2，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。
实施例2
ADT-OH在小鼠黑色素瘤肺转移模型中抑制黑色素瘤转移
将培养好的B16F10或A375细胞(2×106个细胞/200μL PBS/只)悬液注射到C57BL/6小鼠或裸鼠的尾静脉中以构建小鼠黑色素瘤肺转移模型。从接种肿瘤后的第二天开始，分别给予小鼠0.5％CMC、17.5mg/kg ADT-OH、37.5mg/kg ADT-OH、75mg/kg ADT-OH、1.4mg/kgNaHS、2.8mg/kg NaHS或5.6mg/kg NaHS治疗，每周5次。3周后对所有小鼠实施安乐死，并收集小鼠肺组织拍照采集其肺部成像结果及进行后续H&E染色实验以评估小鼠肺部黑色素瘤转移的数量。
实施例3
ADT-OH在体外抑制3种黑色素瘤细胞迁移
体外培养B16F10和B16F1(小鼠黑色素瘤细胞)以及A375(人黑素瘤细胞)。将生长状态良好的细胞接种于6孔培养板中以形成细胞单层，直至细胞培养至接近90％汇合。接下来使用无菌P-200微量移液器吸头刮掉细胞以制造伤口，然后用PBS洗涤孔内3次以去除非贴壁细胞。最后更换含有0μM(对照)、6.3μM、12.5μM以及100μM ADT-OH完全培养基培养细胞；并在药物处理的0h及24h时使用光学显微镜(Carl Zeiss Axioplan 2)拍摄×10显微照片以监测伤口闭合的进展。使用Image J软件计算黑色素瘤细胞在0h和24h处理或不处理ADT-OH后的划痕面积，然后使用下式计算迁移率：迁移率＝(S1-S2)/S1,其中S1表示0h时的划痕区域；S2表示24小时的划痕区域。
实施例4
ADT-OH在体外抑制3种黑色素瘤细胞纵向迁移
实验前细胞均在无血清培养基中饥饿12小时处理。而后收集细胞并重悬于含有1％BSA的无血清DMEM中并制备为5×105个细胞/mL的细胞悬液。将200μL细胞悬液移入Transwell迁移系统的内室(上层小室)，其外室(下层小室)填充600μL含有10％FBS的完全培养基。在37℃下孵育12小时后，去除上层小室膜上表面的细胞。使用4％多聚甲醛中将附着在下表面的迁移细胞固定30分钟，并用含有1％结晶紫染色30分钟，清水轻轻冲洗3遍，显微镜拍照采集图像。拍摄结束后使用33％HAC 100μL吹洗小室，待结晶紫完全溶解细胞使其均匀分布在HAC溶液中后，酶标仪570nm检测，进行定量分析。
实施例5
ADT-OH调节3种黑色素瘤细胞形态
将生长状态良好的细胞接种于预先放置好细胞爬片的6孔培养板里，待细胞贴壁后更换含有0μM(对照)、6.3μM、25μM以及100μM ADT-OH的培养基处理细胞；24h后取出细胞爬片并用PBS洗涤3次，后用4％多聚甲醛固定12分钟后，再次用PBS洗涤3次，每次5分钟；接下来用含0.3％Triton X-100的PBS处理20min；而后使用稀释好的FITC标记的F-actin工作液室温避光孵育30分钟；再次用PBS洗涤3次，每次5分钟；紧接着用DAPI染色液避光染色1分钟后进行封片处理，最后使用荧光显微镜拍照成像。
实施例6
ADT-OH抑制黑色素瘤细胞EMT进程
将生长状态良好的细胞接种于预先放置好细胞爬片的6孔培养板里，待细胞贴壁后更换含有0μM(对照)、3.2μM、6.3μM、12.5μM、25μM以及50μM ADT-OH的培养基处理细胞；24h后取出细胞爬片并用PBS洗涤3次，后用4％多聚甲醛固定12分钟后，再次用PBS洗涤3次，每次5分钟；接下来用含0.3％Triton X-100的PBS处理20min；而后使用10％山羊血清封闭1h；分别用含E-钙粘蛋白(稀释比1:200)和波形蛋白(稀释比1:200)的一抗稀释液包被爬片；4℃包被过夜后用PBS洗涤3次，每次5分钟；然后将细胞与Alexa Fluor 488(标记E-Cadherin；#A21202，Thermo Fisher Scientific Inc.；稀释比1:500)或Alexa Fluor 594(标记Vimentin；#A21207，Thermo Fisher Scientific Inc.；稀释1:500)二抗一起避光孵育1h；再次用PBS洗涤3次，每次5分钟；紧接着使用DAPI染色液避光染色1分钟后进行封片处理，最后使用荧光显微镜拍照成像。
本发明实施例通过小鼠足掌转移模型(图1)、肺转移模型(图2)等3种黑色素瘤转移模型，检测了硫化氢缓释供体ADT-OH对在体黑色素瘤转移的抑制作用。通过对转移模型小鼠肿瘤体积计量、肺组织H&E染色结果统计，发现ADT-OH显著抑制3种转移模型中黑色素瘤细胞转移，且在较低浓度(37.5mg/kg)下即可显著抑制肿瘤细胞转移。在小鼠足掌转移模型(图1A)中，相比于溶剂给药组，37.5mg/kg ADT-OH治疗后小鼠足掌部位肿瘤体积降低了60％左右(对照组：252.13±97.56mm3；37.5mg/kg ADT-OH组：105.26±40.84mm3；75mg/kgADT-OH组：119.24±63.95mm3)，从而显示ADT-OH能够抑制黑色素瘤生长；而肺部切片也显示ADT-OH治疗后显著减少了黑色素瘤浸润(图1B)。而在B16F10细胞构建的肺转移模型中，不同浓度的ADT-OH治疗后均显著减少了黑色素瘤细胞的肺部浸润情况；且治疗效果显著优于硫化氢释放的阳性对照-硫氢化钠治疗组(图2A和B)。其中18.5mg/kg(80μmol/kg)ADT-OH组与5.6mg/kg(100μmol/kg)NaHS组相比，前者肿瘤相对面积为27.08％，而后者肿瘤相对面积为80.87％；即使是在相似摩尔浓度下，ADT-OH的治疗效果也显著优于硫氢化钠。同样地，在A375细胞构建的肺转移模型中，ADT-OH治疗后小鼠肺部黑色素瘤浸润面积显著降低，表明ADT-OH有较好的抗黑色素瘤转移和生长的效果(图2C和D)。
为了进一步验证ADT-OH抗黑色素瘤细胞转移特性，采用细胞划痕及Transwell方法，检测ADT-OH处理B16F10、B16F1及A375细胞后细胞迁移情况。细胞划痕结果显示ADT-OH显著抑制了3种黑色素瘤细胞的划痕愈合；并且这一现象呈现一定的剂量依赖性(图3)。另一方面，Transwell结果显示随着ADT-OH作用浓度的增加，穿透小室的黑色素瘤细胞逐渐减少，表明随着ADT-OH作用浓度的增加，显著抑制了黑色素瘤细胞垂直迁移速率(图4)。由此可见，ADT-OH显著抑制了黑色素瘤细胞迁移。
而后，细胞骨架染色后发现ADT-OH调节了黑色素瘤细胞形态，ADT-OH处理后的黑色素瘤细胞表面伪足变少、减短；且随着ADT-OH作用浓度的增加，这一现象也逐渐显著(图5)。但在6.3μM ADT-OH的作用下细胞形态改变已有发生。而细胞这一形态的变化有可能预示着其EMT过程的改变。
接下来使用免疫荧光方法分别检测了3种黑色瘤细胞中E-Cadherin及Vimentin蛋白表达情况；发现ADT-OH处理后，黑色素瘤细胞内细胞黏附分子E-Cadherin的表达量显著增加而波形蛋白Vimentin的表达量显著降低，表明ADT-OH抑制了黑色素瘤细胞的EMT进程(图6)。由此可见，ADT-OH通过抑制黑色素瘤细胞EMT过程抑制了黑色素瘤细胞迁移进而抑制其肿瘤转移过程。
本发明提供了一种利用硫化氢抗黑色素瘤转移的潜在方法，与硫化氢标准供体硫氢化钠的效果相比，该方法应用硫化氢缓释供体ADT-OH治疗黑色素瘤转移和生长，效果较好，药物用量少也较为安全。其特性在于首次提出了ADT-OH应用于抗黑色素瘤转移研究，为治疗黑色素瘤转移药物开发及硫化氢相关药物应用拓展提供了新思路和新方向。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：改变肿瘤部位硫化氢含量，进而抑制黑色素瘤细胞生长、影响黑色素瘤细胞迁移，从而达到抑制黑色素瘤转移的效果。
2.根据权利要求1所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：硫化氢缓释供体ADT-OH可以在体内缓慢释放硫化氢，且对正常细胞的杀伤力较小，以较低浓度即可对黑色素瘤细胞产生生长和迁移抑制作用；其作用强于硫氢化钠。
3.根据权利要求1所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：通过不同浓度ADT-OH对构建的B16F10鼠源黑色素瘤细胞的黑色素瘤足掌转移模型、B16F10黑色素瘤肺转移模型以及A375人源黑色素瘤细胞的黑色素瘤肺转移模型三种动物模型治疗，检验了ADT-OH治疗黑色素瘤生长和迁移的作用效果，表明ADT-OH显著抑制肿瘤动物模型中黑色素瘤的生长和转移。
4.根据权利要求1所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：使用较为安全硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤细胞在体内外转移。
5.根据权利要求2所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：在体实验中ADT-OH显著抑制小鼠肿瘤转移模型中黑色素瘤细胞转移和生长。
6.根据权利要求2所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：ADT-OH在体外显著抑制黑色素瘤细胞迁移，包括抑制其细胞划痕的愈合及其垂直迁移速率。
7.根据权利要求2所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：低浓度的ADT-OH通过抑制黑色素瘤细胞上皮细胞-间充质转化EMT过程抑制黑色素瘤细胞迁移。
8.根据权利要求2所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH抑制黑色素瘤转移的方法，其特征在于：低浓度的ADT-OH通过改变黑色素瘤细胞形态及调节细胞EMT标志物表达抑制黑色素瘤细胞EMT过程进而抑制黑色素瘤迁移。
9.权利要求1至8任一项所述的使用硫化氢缓释供体ADT-OH在制备黑色素瘤转移药物中的应用。
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FANGFANG CAI等: "ADT-OH, a hydrogen sulfide-releasing donor, induces apoptosis and inhibits the development of melanoma in vivo by upregulating FADD", 《CELL DEATH & DISEASE》, vol. 11, pages 1 - 15 *

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