CN114177166A

CN114177166A - 结肠癌的治疗和诊断

Info

Publication number: CN114177166A
Application number: CN202111170691.6A
Authority: CN
Inventors: S.塔瓦佐薇; J.M.卢
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2022-03-15
Also published as: WO2014071067A2; CN104918659B; US9492414B2; CN114306315A; US20150335601A1; US20190000788A9; US20170296497A1; US20190125706A1; AU2013337768A1; US10406128B2; AU2013337768B2; CN109793897A; EP3736022A3; EP3736022A2; EP2914344A2; US9040497B2; US10172817B2; WO2014071067A3; JP6109951B2; CA2890045C

Abstract

本发明公开了用于诊断和治疗结肠癌的新药剂和方法。还公开了相关的阵列、试剂盒和筛选方法。

Description

结肠癌的治疗和诊断

本申请是基于申请日为2013年10月31日，最早优先权日为2012年10月31 日，申请号为201910112579.3，发明名称为：“结肠癌的治疗和诊断”的专利申请(其母案的申请号为201380068468.8)的分案申请。

对相关申请的交叉引用

本申请要求对2012年10月31日提交的美国临时申请No.61/720,912和 2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/786,500的优先权。这些申请的内容通过提述完整并入本文。

政府利益

本文中公开的发明至少部分在来自国家健康研究所的拨款号1DP2 OD006506-01下得到政府支持完成。因而，美国政府具有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及结肠癌的的诊断和治疗。

发明背景

结肠癌，常称为结直肠癌或肠癌，是来自结肠或直肠或阑尾中不受控的细胞生长的癌症。参见例如，Cancer Genome Atlas Network,"Comprehensive molecularcharacterization of human colon and rectal cancer,"Nature 487: 330–337(2012年7月19日)。它是美国第二常见诊断的恶性和第二大常见的癌症死亡起因。例如，患有在早期局部化阶段诊断出的结直肠癌的患者的五年存活率为92％，而如果容许癌症扩散至临近器官或淋巴结则存活率降至64％，在有远端转移的患者中降至7％。

结肠癌的预后与肿瘤经由肠壁的穿透程度和节参与的存在或缺乏直接相关。因此，早期检测和治疗是重要的。目前，诊断由用于大便潜血的筛选测定、乙状结肠镜检查(sigmoidoscopy)、结肠镜检查(colonoscopy)和双重对比钡灌肠剂的使用辅助。如由癌症的类型和阶段决定的治疗方案包括手术、放射疗法和/或化疗。然而，手术(最常见的治疗形式)之后的复发是一个主要问题且常是死亡的最终起因。尽管对该疾病的疗法进行了研究，但结肠癌仍是难以诊断和治疗的。如此，需要用于检测和治疗结肠癌的新药剂和方法。

发明概述

本发明通过提供用于诊断和治疗结肠癌的药剂和方法着手解决上述需要。

在一个方面，本发明特征在于一种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌(例如转移性结肠癌)的方法。该方法包括增加所述受试者中选自 miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平。增加步骤可通过对所述受试者施用编码miR-483-5p或miR-551a的核酸来实施。所述核酸可以是寡核苷酸，例如合成的核酸。核酸可以在载体，例如选自下组的载体中：质粒、病毒、粘粒、人工染色体和其他源自细菌和/或病毒源的媒介物。病毒的例子包括腺伴随病毒(AAV)或POX病毒。所述腺伴随病毒或POX病毒可被修饰以提高活性、稳定性或特异性。在一些例子中，所述核酸含有SEQ ID NO:1-10 中任一个或其互补体的序列。所述方法还可包括对所述受试者施用如本文中公开的另外的治疗剂。

在第二个方面，本发明提供一种分离的RNA干扰(RNAi)药剂，其能抑制肌酸激酶脑型(CKB)或肌酸转运体通道SLC6a8(SLC6a8)的表达。该药剂含有与编码CKB或SLC6a8蛋白的基因的区域同源或互补的第一核苷酸序列。在一些例子中，所述第一核苷酸序列包含SEQID NO:11-18中任一个的序列。

本发明还提供一种分离的核酸，其包含编码上述RNAi药剂的序列的分离的核酸和拥有该核酸的载体。所述载体可以是选自下组的载体：质粒、病毒、粘粒、人工染色体和其他源自细菌和/或病毒源的媒介物。优选地，载体是病毒载体，例如AAV病毒载体。还提供具有上述RNAi药剂、核酸或载体的宿主细胞。另外提供一种药物组合物，其具有(a)药学可接受的载体，和 (b)所述RNAi药剂、核酸或载体。所述RNAi药剂、核酸或载体可以与其他药剂例如脂质体化合物或聚乙烯胺复合用于有效投递。在一个实施方案中，所述药物组合物还含有另外的治疗剂。

在第三方面，本发明特征在于一种用于在有此需要的受试者中治疗癌症如结肠癌(例如转移性结肠癌)或胰腺癌的方法。该方法包括降低所述受试者中CKB或SLC6a8)的表达水平或活性。所述降低步骤可通过对所述受试者施用核酸、小分子化合物或两者来实施。在一个例子中，所述降低步骤通过对所述受试者施用环肌酸或beta-胍基丙酸(guanidinopropionic acid)来实施。在其他例子中，降低步骤通过对所述受试者施用选自下组的药剂来实施：上文描述的RNAi药剂、核酸和载体。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述受试者施用另外的治疗剂，如beta-胍基丙酸。

本发明特征还在于一种用于在有此需要的受试者中治疗癌症如结肠癌或胰腺癌的方法。该方法包括通过抑制肌酸转运体通道SLC6a8来降低所述受试者中肌酸的水平。该方法包括对所述受试者施用beta-胍基丙酸以及任选地另外的治疗剂。另外的治疗剂的例子包括选自下组的一种或多种：上文所述的环肌酸、RNAi药剂、核酸和载体。另外的治疗剂的其他例子包括5-氟尿嘧啶、奥沙利铂(Oxaliplatin)、伊立替康(Irinotecan)、卡培他滨(Capecitabine)、吉西他滨(Gemcitabine)、西妥昔单抗(Cetuximab)、紫杉醇(Taxol)、阿伐斯汀(Avastin)、亚叶酸(leucovorin)、Regorafenib、Zaltrap、拓扑异构酶I抑制剂、NKTR-102、Tivantinib、PX-866、索拉非尼(Sorafenib)、Linifanib、激酶抑制剂、Telatinib、XL281(BMS-908662)、Robatumumab和IGF1-R抑制剂。

在第四方面，本发明提供一种用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的方法。该方法包括：(i)从所述受试者获得样品；(ii)测量所述样品中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平；和(ii)将该表达水平与预确定的参照值比较。如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者患有或有风险患有转移性结肠癌。所述预确定的参照值可以获自不患有转移性结肠癌的对照受试者。样品可以是体液样品或活组织检查肿瘤样品。该方法还可用于确定受试者是否有或有风险具有转移性结肠癌复发，或用于确定受试者是否患有或有风险患有对化疗剂或靶向疗法有抗性的结肠癌或转移性结肠癌。更具体地，如果所述表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者有或有风险具有转移性结肠癌复发、或对化疗剂或靶向疗法有抗性的结肠癌或转移性结肠癌。

在第五方面，本发明提供一种阵列，其具有(i)具有多个独特位置的支持物，和(ii)具有与miR-483-5p,miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物(例如mRNA或相关cDNA)互补的序列的至少一种核酸的任意组合。例如，核酸可以与SEQ ID NO:1-18之一互补或在严格杂交条件下，与SEQ ID NO: 1-18之一杂交。每个核酸被固定化于所述支持物的独特位置。

本发明还提供一种用于诊断受试者中结肠癌的转移潜力、转移性结肠癌复发的潜力、转移性结肠癌快速进展的潜力或转移性结肠癌展现对化疗的抗性的潜力的试剂盒。该试剂盒包含特异性结合miR-483-5p,miR-551a或编码 CKB或SLC6a8的基因的表达产物(例如mRNA,cDNA和多肽)的试剂。所述试剂可以是具有与miR-483-5p和miR-551a序列互补的序列的探针。例如，每个探针可具有与SEQ ID NO:1-18之一互补或在严格杂交条件下，与SEQID NO: 1-18之一杂交的序列。试剂盒还可包含用于实施杂交测定法或PCR测定法的试剂或上文所述的阵列。

在第六方面，本发明提供一种鉴定可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移存活或转移性定殖(metastatic colonization)的化合物的方法。所述方法包括(i)获得表达选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的测试细胞；(ii)将该测试细胞暴露于测试化合物；(iii)测量测试细胞中所述 microRNA的表达水平；(iv)比较该表达水平与对照水平；和(v)如果该比较指示表达水平高于对照水平，则选择该测试化合物作为可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移存活或转移定殖的候选物。

本发明还提供一种鉴定可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移存活或转移定殖的化合物的方法。所述方法包括(i)获得能够表达选自CKB或SLC6a8的基因的多肽或mRNA的测试细胞；(ii)将该测试细胞暴露于测试化合物；(iii)测量测试细胞中所述基因的表达水平；(iv)比较该表达水平与对照水平；和(v)如果该比较指示表达水平低于对照水平，则选择该测试化合物作为可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移存活或转移定殖的候选物。

在上述方法中，对照水平可获自与测试细胞相同的对照细胞，只不过对照细胞尚未暴露于测试化合物。测试细胞可以是结肠癌细胞系(例如LS-174T 人结肠癌系)的细胞。在一些实施方案中，基因的表达水平可使用报道物构建体测量，其中报道基因(例如编码萤光素酶、GFP或LacZ的基因)可操作地连接于编码上述miR-483-5p,miR-551a,CKB,或SLC6a8的基因的启动子。

本发明还提供一种用于在有此需要的受试者中治疗乳腺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、胆囊癌、前列腺癌、肉瘤癌、黑素瘤或肺癌的方法。该方法包括对所述受试者施用beta-胍基丙酸等。

下文中陈述了本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其他特征、目的和优点从说明书和权利要求将是显而易见的。

本发明涉及以下各项：

1.一种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌的方法，包括降低所述受试者中肌酸激酶脑型(CKB)或肌酸转运体通道SLC6a8(SLC6a8)的表达水平或活性。

2.项1的方法，其中所述降低步骤通过对所述受试者施用环肌酸来实施。

3.项2的方法，还包括对所述受试者施用另外的治疗剂。

4.项3的方法，其中所述另外的治疗剂选自下组：beta-胍基丙酸(beta-guanidinopropionic acid)、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂(Oxaliplatin)、伊立替康(Irinotecan)、卡培他滨(Capecitabine)、吉西他滨(吉西他滨)、西妥昔单抗(Cetuximab)、紫杉醇(Taxol)和阿伐斯汀(Avastin)。

5.项1-4中任一项的方法，其中所述癌症是转移性的。

6.一种用于在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，包括对所述受试者施用beta-胍基丙酸，其中所述癌症是选自下组的一种癌症：结肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和黑素瘤。

7.一种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌的方法，包括提高所述受试者中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平。

8.项1的方法，其中所述结肠癌是转移性的。

9.项7或8的方法，其中所述提高步骤通过对所述受试者施用编码 miR-483-5p或miR-551a的核酸来实施。

10.项9的方法，其中所述核酸是寡核苷酸。

11.项10的方法，其中所述寡核苷酸是合成的核酸。

12.项9的方法，其中所述核酸在载体中。

13.项12的方法，其中所述载体选自下组：质粒、病毒、粘粒和人工染色体。

14.项13的方法，其中所述病毒是腺相关病毒(AAV)或POX病毒。

15.项9-14中任一项的方法，其进一步包括对所述受试者施用另外的治疗剂。

16.项9-14中任一项的方法，其中所述核酸包含SEQ ID NO:1-10中任一个或其互补体的序列。

17.一种用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的方法，包括：

从所述受试者获得样品；

测量所述样品中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平；和

将该表达水平与预确定的参照值比较；

由此如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者患有或有风险患有转移性结肠癌。

18.一种用于确定受试者是否具有或有风险具有转移性结肠癌复发的方法，包括：

从所述受试者获得样品；

将该表达水平与预确定的参照值比较，由此如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者具有或有风险具有转移性结肠癌复发。

19.一种用于确定受试者是否具有或有风险具有对靶向疗法的化疗剂有抗性的转移性结肠癌复发的方法，包括：

从所述受试者获得样品；

将该表达水平与预确定的参照值比较，

由此如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者具有或有风险具有对靶向疗法的化疗剂有抗性的结肠癌或转移性结肠癌。

20.项17-19中任一项的方法，其中所述预确定的参照值获自没有转移性结肠癌的对照受试者。

21.项17-19中任一项的方法，其中所述样品是体液样品。

22.项17-19中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤样品。

23.一种阵列，其包含(i)具有多个独特位置的支持物，和(ii)具有与 miR-483-5p、miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物互补的序列的至少一种核酸的任意组合，其中每个核酸被固定化于所述支持物的独特位置。

24.一种用于诊断受试者中结肠癌的转移潜力的试剂盒，其包含特异性结合miR-483-5p、miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物的试剂。

附图简述

图1A-E是一组图和照片，其显示miR-483-5p、miR-551a和CKB是临床相关的并且可以被治疗性抑制。a，通过定量实时PCR对37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中的miR-483-5p和miR-551a水平定量。b，通过定量实时 PCR对37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中的CKB表达水平定量。c，注射有LvM3b细胞并在注射细胞后一天用单剂量的双重表达miR-483-5p和 miR-551a的AAV治疗的小鼠中的肝转移。d，注射有5X10⁵LvM3b细胞并每日用环肌酸治疗达两周的小鼠中肝转移的生物发光测量。在治疗结束时将小鼠安乐死并切取肝用于离体成像。e，注射有5X10⁵LvM3b细胞并每日用肌酸转运体抑制剂beta-胍基丙酸(B-GPA)治疗达两周的小鼠中肝转移的生物发光测量。误差条，s.e.m；所有P值基于单侧Student’s t检验。*P<0.05；**P<0.001； ***P<0.0001。

图2是显示B-GPA治疗抑制结直肠癌转移的一组图和照片。注射有5X 10⁵LvM3b细胞并每日用B-GPA治疗达三周的小鼠中肝转移的生物发光测量。在三周时将小鼠安乐死并切取肝用于生物发光成像和大体组织学(gross histology)。误差条代表s.e.m；所有P值基于单侧Student’s t检验。*P<0.05。

图3A-C是一组图和照片，其显示肌酸转运体物SLC6a8是结直肠癌和胰腺癌转移需要的。a)表达靶向肌酸转运体通道SLC6a8的短发夹的高度侵入性LvM3b细胞的肝转移。通过生物发光成像监测肝转移并在接种癌细胞后三周将小鼠安乐死。提取肝用于大体组织学。b)在注射有用靶向SLC6a8的 shRNA转导的5X10⁵SW480细胞的小鼠中的肝转移。通过生物发光成像监测转移进展。在注射后28天将小鼠安乐死并切取肝用于生物发光成像和大体组织学。c)在注射有用靶向SLC6a8的shRNA转导的5X10⁵PANC1胰腺癌细胞的小鼠中的肝转移。通过生物发光成像监测转移进展并将小鼠安乐死，如上文描述的。误差条代表s.e.m；所有P值基于单侧Student’s t检验。*P<0.05； **P<0.001；***P<0.0001。

图4是显示与原发性肿瘤相比SLC6a8在肝转移中上调的图。通过定量实时PCR对36份原发性肿瘤和30份肝转移中SLC6a8的表达定量。误差条代表 s.e.m；所有P值基于单侧Student’s t检验。*P<0.05。

图5是显示B-GPA治疗在体内抑制肝中弥散性(disseminated)PANC1胰腺癌细胞存活的一组图和照片。在有和无10mM B-GPA预处理达48hr的情况下注射有5x10⁵ PANC1细胞的免疫缺陷性小鼠的生物发光成像。在注射后第1 天对小鼠成像并相对于第0天将信号标准化。P值基于单侧Student’s t检验。 *P<0.05。

图6是显示B-GPA增强吉西他滨对PANC1胰腺癌细胞的细胞毒性的图。在用逐步升高剂量的仅吉西他滨或逐步升高剂量的吉西他滨与10mM B-GPA组合治疗后PANC1胰腺癌细胞的细胞存活力。使用WST-1试剂测定细胞存活力。误差条代表均值的标准误差。

图7是显示B-GPA增强5’-氟尿嘧啶对LS-LvM3b结直肠癌细胞的细胞毒性的图。在用逐步升高剂量的仅5’-氟尿嘧啶或逐步升高剂量的5’-氟尿嘧啶与10mM B-GPA组合治疗后Ls-LvM3b细胞的细胞存活力。使用WST-1试剂测定细胞存活力。误差条代表均值的标准误差。

发明详述

本发明至少部分基于以下预料不到的发现，即协同性miRNA-蛋白质网络在转移性结肠癌的肝定殖中失调，且miRNA(例如miR-483-5p和miR-551a) 通过协同性靶向脑肌酸激酶依赖性能量学来抑制结肠癌转移性存活。因此，本发明提供用于诊断和治疗结肠癌，特别是转移性结肠癌的新药剂和方法。

弥散性癌细胞对器官的定殖代表癌症进展的最终、临床上最重大的和了解最少的阶段。肝是许多癌症类型的这类转移性定殖的高度常见器官。为了了解肝定殖的分子基础，建立了结肠癌的肝定殖的体内选择模型。由于它将竞争性器官内体内选择与小RNA序型分析(profiling)偶联以平行地功能性评估611种microRNA在肝定殖期间的体内作用，因此它是一种强大的系统。如本文中公开的，内源性miR-483-5p和miR-551a被鉴定为许多突变背景的多种结肠癌群体中肝转移性定殖的有力抑制剂。这些miRNA在转移性细胞中和人肝转移中是表观遗传沉默的，而且通过靶向脑型肌酸激酶(CKB)来抑制转移。

如本文中公开的，CKB通过增强弥散性癌细胞在肝(在该处其遇到肝缺氧)中的存活来促进转移。结肠癌存活依赖于磷酸肌酸的CKB产生，磷酸肌酸充当用于生成忍耐肝缺氧所需的ATP的能量库。与此一致，经由肌酸转运体敲低来抑制癌细胞肌酸摄取也减少转移。经由腺伴随病毒投递治疗性施用 miR-483-5p和miR-551急剧抑制结肠癌转移。另外，用小分子抑制剂治疗性靶向CKB显著抑制结肠癌转移。这些结果突显了代谢能量学在癌症进展期间在维持转移性存活中的重要性。本文中公开的发现对于治疗优先定殖到肝且每年索取超过500,000人的生命的胃肠恶性具有重要的启示。而且，本文中公开的体内筛选/选择办法有全面和快速鉴定调控任何癌症类型对任何器官的定殖的编码和非编码基因的潜力。

如本文中公开的，经由上文所述的办法，一组miRNA被鉴定为在人转移结肠癌系中失调(deregulated)。如本文中公开的，miR-483-5p和miR-551a充当结肠癌转移的有力内源抑制剂，其经由会聚性靶向代谢基因肌酸激酶脑型 (CKB)实现。这些miRNA在鉴定形成结肠癌转移性复发的患者中展现出重要的预后能力，而治疗性投递这些miRNA则显著抑制结肠癌转移。

本文中公开的miRNA-蛋白质网络的成员可用作用于治疗转移性结肠癌的靶物。另外，该成员可用作生物标志物，用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌，或用于确定患有该病症的患者的预后或监测。因此，本发明涵盖通过靶向一个或多个所述成员治疗转移性结肠癌的方法，确定用于抑制癌症的治疗方案的功效的方法，和鉴定抗癌剂的方法。还提供诊断受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的方法，和筛选出认为有风险形成该病症的受试者的方法。本发明还涵盖适用于实施上述方法的各种试剂盒。

治疗方法

如本文中公开的，miR-483-5p和miR-551a被鉴定为结肠癌和其他癌症类型中的癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活、或转移性定殖的内源性转移抑制剂，而CKB和肌酸运输通道SLC6a8发挥同一过程的转移促进物作用。这些miRNA或蛋白质不仅强烈预测人转移结果，而且还提供用于治疗癌症如结肠癌和其他癌症类型的靶物。

因此，本发明提供在治疗癌症如结肠癌和其他癌症类型中使用相关药剂 (包括microRNA、靶向CKB的RNAi药剂、靶向SLC6a8的RNAi药剂、编码这类RNAi药剂的载体(例如AAV)、环肌酸和胍基丙酸)的方法，其经由增加所述受试者中一种或多种转移抑制剂的表达水平或活性水平进行。该增加可通过迫使一种或多种转移抑制剂表达等来实现。另外，治疗可通过降低一种或多种转移促进物的表达水平或活性水平来实现。其他癌症类型的例子包括实体肿瘤，特别是癌。例示性实体肿瘤包括但不限于，肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、精巢癌、肝癌、腮腺癌、胆管癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、间皮瘤黑素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、卡波西肉瘤、和肉瘤。具体地，本发明的方法可用于治疗胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌和乳腺癌。

转移抑制剂的强迫表达

miR-483-5p和miR-551a两者和编码它们的核酸均可用作转移抑制剂，从而通过在目的细胞或有此需要的受试者中将其过表达来实施本发明。

“过表达”指由导入宿主细胞的核酸所编码的RNA或多肽的表达，其中该 RNA或多肽或蛋白质或者正常不存在于该宿主细胞中，或者其中该RNA或多肽以比从编码该或多肽的内源性基因正常表达的更高的水平存在于所述宿主细胞中。

上述抑制剂的所有天然存在的型式、遗传工程化型式、和化学合成型式均可用于实施其中公开的本发明。为了表达上述抑制剂，本发明提供了编码任意的上述抑制剂的核酸。优选地，核酸序列是分离和/或纯化的。核酸指的是DNA分子(例如但不限于cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如但不限于 mRNA)、或DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可从核苷酸类似物合成。核酸分子可以是单链或双链的。“分离的核酸”是其结构与任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸的任意片段不相同的核酸。该术语因此涵盖，例如(a)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分序列，但侧翼不是连接位于其天然存在的生物体基因组的分子的部分两侧的两个编码序列；(b) 核酸，其整合入载体或原核或真核基因组DNA，其整合方式使得所得的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA都不同；(c)分离的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；以及(d) 重组核苷酸序列，其是杂合体基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。

术语“RNA”、“RNA分子”和“核糖核酸分子”在本文中可交换使用，且指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”指脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然合成DNA和RNA(例如分别通过DNA复制或DNA转录)。RNA可经过转录后修饰。还可以化学合成DNA 和RNA。DNA和RNA可以是单链(即分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。

本发明还提供具有一种或多种本文描述的核苷酸序列的重组构建体。所述构建体的例子包括载体，如质粒或病毒载体，其中已以正方向或反方向插入本发明的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述构建体还包含调控序列，包括启动子，其可操作地连接于该序列。本领域技术人员已知大量的适宜载体和启动子，且其是商品化的。用于原核和真核宿主的适宜的克隆和表达载体还记载于Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press)。

表达载体的例子包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如猿病毒40(SV40)的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽窦病毒和伪狂犬病毒。然而，可以使用任何其他载体，只要它在宿主中是可复制和可存活的。可通过多种规程将适宜的核酸序列插入载体中。一般地，可将编码上文所述的抑制剂之一的核酸序列通过本领域中已知的规程插入适宜的限制性内切核酸酶位点。这类规程和相关的亚克隆规程在本领域技术人员的范围内。

前述表达载体中的核酸序列优选地可操作地连接于适宜的转录调控序列(启动子)以指导RNA合成。这类启动子的例子包括：逆转录病毒长末端重复(LTR)或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体lambda PL启动子、和其他已知调控基因在原核或真核细胞或病毒中表达的启动子。表达载体还可以含有核糖体结合位点用于翻译启动，和转录终止子。载体可包含用于扩大表达的适宜序列。另外，表达载体优选含有一种或多种可选择标志基因以提供表型性状来选择经转化的宿主细胞，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

可以使用含有如上述的适宜核酸序列、以及适宜的启动子或调控序列的载体来转化适宜的宿主以允许宿主表达上文所述的抑制剂。这类载体可用于基因疗法中。适宜的表达宿主的例子包括细菌细胞(例如大肠杆菌、链霉菌 (Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、真菌细胞(酵母)、昆虫细胞(例如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9))、动物细胞(例如CHO、COS和HEK 293)、腺病毒和植物细胞。选择适宜的宿主在本领域技术人员的范围内。在一些实施方案中，本发明提供用于产生上述抑制剂的方法，其通过将宿主细胞用具有编码一种所述抑制剂的核苷酸序列的表达载体转染。

降低转移促进物的表达或活性水平

如上文提述的，在治疗结肠癌中可以使用降低CKB或SLC6a8的表达或活性水平的抑制性药剂。抑制性药剂(即抑制剂)可以是核酸、多肽、抗体或小分子化合物。在一个例子中，所述抑制剂在转录、mRNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性/降解、蛋白质修饰和蛋白质结合的水平发挥功能。

核酸抑制剂可以编码靶向一种或多种上述基因例如CKB或SLC6a8并抑制其表达或活性的小干扰RNA(例如RNAi药剂)。术语“RNAi药剂”指RNA 或其类似物，其具有对靶RNA的足够的序列互补性以指导RNA干扰。例子还包括可用于制备该RNA的DNA。RNA干扰(RNAi)指靶分子(例如靶基因、蛋白质或RNA)被下调的序列特异性或选择性过程。一般地，干扰性RNA("iRNA")是双链短干扰性RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、或单链 micro-RNA(miRNA)，其导致特异性mRNA的催化性降解，且还可用于降低或抑制基因表达。

术语“短干扰性RNA”或“siRNA”(亦称为“小干扰性RNA”)指能指导或介导RNA干扰的长度为约10-50个核苷酸的RNA剂，优选为双链药剂，优选长度为约15-25个核苷酸，更优选长度为约17,18,19,20,21,22,23,24, 或25个核苷酸，链任选地具有包含例如1、2或3个悬突的核苷酸(或核苷酸类似物)的悬突末端。天然存在的siRNA通过细胞的RNAi体系(例如Dicer或其同源物)从更长的dsRNA分子(例如长度>25个核苷酸)生成。

术语“miRNA”或“microRNA”指能指导或介导RNA干扰的长度为约 10-50个核苷酸的RNA剂，优选为单链药剂，优选长度为约15-25个核苷酸，更优选长度为约17,18,19,20,21,22,23,24,或25个核苷酸。天然存在的miRNA通过Dicer从茎环前体RNA(即pre-miRNA)生成。如本文中使用的术语“Dicer”包括Dicer以及能够将dsRNA结构加工成siRNA、miRNA、siRNA 样或miRNA样分子的任何Dicer直系同源物或同源物。基于以下事实术语 microRNA(或"miRNA")可与术语“小时序性RNA”(或"stRNA")交换使用，即发现天然存在的microRNA(或“miRNA”)以时序方式表达(例如在发育期间)。

如本文中使用的术语“shRNA”指具有茎环结构的RNA剂，其包含具有互补序列的第一和第二区，互补性程度和区域的取向足以使得在区域间发生碱基配对，第二和第二区由环区连接，该环来自于环区的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对。

利用特征为降解RNA分子(例如在细胞内)的RNAi在本发明的范围内。降解由酶性的RNA诱导的沉默复合物(RISC)催化。具有与靶RNA序列(例如上文所述的CKB或SLC6a8基因)足够互补以指导RNAi的序列的RNA剂意味着该RNA剂与靶RNA序列具有至少50％的同源性(例如50％,60％,70％,80％, 90％,95％,98％,99％,或100％的同源性)，从而使得两者彼此足够互补以杂交和触发通过RNAi体系(例如RISC复合物)或过程对靶RNA的破坏。具有“与靶RNA序列足够互补以指导RNAi的序列”的RNA剂还意味着该RNA剂具有足以触发通过RNAi体系或过程对靶RNA的翻译抑制的序列。RNA剂还可具有与由靶DNA序列编码的靶RNA足够互补的序列，从而使得靶DNA序列被染色体沉默。换言之，RNA剂具有足以诱导转录性基因沉默的序列，例如下调靶DNA序列处或附近的基因表达，例如通过诱导靶DNA序列处或附近的染色质结构变化。

可以使用本领域中已知的聚合性、生物可降解的微粒或微胶囊投递装置来投递上述多核苷酸。另一种实现多核苷酸摄取的方式是使用通过标准方法制备的脂质体。多核苷酸可以单独掺入或与组织特异性抗体共同掺入到这些投递媒介物中。或者，可以制备由通过静电或共价力附接于聚-L-赖氨酸的质粒或其他载体构成的分子缀合物。聚-L-赖氨酸与能结合靶细胞上受体的配体结合(Cristiano,等,1995,J.Mol.Med.73:479)。或者，可以通过使用本领域中已知的组织特异性转录调控元件来实现组织特异性靶向。将裸DNA(即没有投递媒介物)投递至肌内、皮内或皮下部位是实现体内表达的另一种手段。

可通过本领域中公知的方法来设计siRNA、miRNA和asRNA(反义RNA) 分子。可使用本领域中已知的程序来设计具有足以提供独特降解任意RNA所需的序列特异性的同源性的siRNA、miRNA和asRNA分子，所述程序包括但不限于，放在AMBION,Inc.和DHARMACON,Inc的网站上的那些。本领域技术人员能常规地实施几种设计物种的系统性测试来优化siRNA、miRNA和 asRNA序列。设计短干扰核酸分子时的考虑包括但不限于，生物物理、热力学和结构方面的考虑，在有义链中特定位置处的碱基偏好，和同源性。这些考虑是本领域中公知的且提供设计上述RNA分子的指南。

本发明的反义多核苷酸(优选DNA)可以是任意反义多核苷酸，只要它拥有与编码前述网络的组分的基因的序列互补或基本互补的碱基序列。碱基序列可以与编码多肽的基因的互补体至少约70％,80％,90％,或95％同源。这些反义DNA可使用DNA合成仪合成。

本发明的反义DNA可以含有改变的或经修饰的糖、碱基或连接。反义 DNA以及上文所述的RNAi也可以以特殊的形式如脂质体、微球提供，或可应用于基因疗法，或可以与附接的模块组合提供。这类附接的模块包括充当磷酸酯主链的电荷中和物的聚阳离子如聚赖氨酸，或增强与细胞膜的相互作用或增加核酸摄取的疏水性模块如脂质(例如磷脂、胆固醇等)。要附接的脂质的优选例子是胆固醇或其衍生物(例如氯甲酸胆固醇酯、胆酸等)。这些模块可以附接于核酸的3'或5'端处且还可以经由碱基、糖或分子内核苷连接附接于核酸。其他模块可以是特定置于核酸3'或5'端的加帽基团以阻止核酸酶 (如外切核酸酶、RNase等)的降解。这类加帽基团包括但不限于，本领域中已知的羟基保护基团，包括二醇如聚乙二醇、四甘醇等。可以使用本发明的基于细胞系或动物的基因表达系统体内和体外检查反义DNA的抑制作用。

可将编码上述一种或多种RNAi剂或多肽抑制剂(将在下文论述)的核酸克隆到载体中用于体外或体内投递至细胞。对于体内使用，投递可以靶向特定的组织或器官(例如肝或结肠)。靶向性投递牵涉在系统性施用后使用靶向特定器官或组织的载体(例如器官导引肽)。例如，载体可以具有亲和素与针对肝特异性蛋白质的单克隆抗体的共价缀合物。

在某些实施方案中，本发明提供用于体内表达上述转移抑制剂的方法。这类方法将通过将编码任意所述因子的核酸序列导入需要抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖的人或非人动物的细胞或组织中来实现其治疗效果。核酸序列的投递可使用重组表达载体如嵌合病毒或胶质分散系统来实现。优选用于治疗性投递核酸序列的是使用靶向性脂质体。

本文中公开的可用于基因疗法的各种病毒载体包括，腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒、牛痘或优选为RNA病毒，如逆转录病毒和慢病毒。优选地，逆转录病毒载体是慢病毒或鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。可以插入单个外来基因的逆转录病毒载体的例子包括但不限于：Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和 Rous肉瘤病毒(RSV)。许多另外的逆转录病毒载体可掺入多个基因。

所有这些载体均可以转移或掺入可选择标志的基因，从而能够鉴定和生成经转导的细胞。可通过附接例如糖、糖脂或蛋白质使得逆转录病毒载体变为靶物特异性的。优选的靶向通过使用靶物特异性抗体或在靶物内具有受体的激素来完成。本领域技术人员将认可特异性多核苷酸序列可插入到逆转录病毒基因组中或附接于病毒包膜，从而允许该逆转录病毒载体的靶物特异性投递。

另一种用于投递核酸的靶向性系统是胶质分散系统。胶质分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、微团(micelle)、混合的微团和脂质体。本发明的优选的胶质系统是脂质体。脂质体是人工膜媒介物，其可用作体外和体内的投递媒介物。RNA、DNA 和完整的病毒粒体可被封装在水性内部内并以生物活性形式投递至细胞。使用脂质体媒介物用于有效基因转移的方法是本领域种已知的。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇特别是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理属性依赖于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

可用于脂质体产生的脂质的例子包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂和神经节苷脂。例示性磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、和二硬脂酰磷脂酰胆碱。基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，脂质体的靶向也是可能的且是本领域种已知的。

当在体内使用时，期望使用可逆的投递-表达系统。为此，可将Cre-loxP 或FLP/FRT系统和其他类似的系统用于一种或多种上述核酸的可逆投递-表达。参见WO2005/112620,WO2005/039643、美国申请20050130919, 20030022375,20020022018,20030027335,和20040216178。具体地，美国申请 NO 20100284990中描述的可逆投递-表达系统可被用于提供选择性或紧急关闭(emergency shut-off)。

在另一个例子中，上述抑制性药剂或抑制剂可以是多肽或蛋白质复合物，如抗体或其抗原结合部分，其抑制或者干扰CKB或SLC6a8的活性。

术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其免疫学活性部分，即抗原结合部分。例子包括但不限于，具有至少一个或两个重(H)链可变区(V_H)，和至少一个或两个轻(L)链可变区(V_L)的蛋白质。所述V_H和V_L区可被进一步细分成高变区，称为“互补决定区”("CDR")，其散布在更保守的称为“框架区”(FR)的区域中。本文中使用的术语“免疫球蛋白”指由一个或多个基本由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括kappa,lambda, alpha(IgA1和IgA2),gamma(IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4),delta,epsilon和mu恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。

术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如CKB或SLC6a8)的能力。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段实施。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的例子包括(i)Fab片段，一种组成为V_L,V_H,C_L和C_H1域的单价片段； (ii)F(ab')₂片段，其是包含两个通过铰链区处的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由V_H及C_H1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L及V_H域组成的Fv 片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由V_H域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个域(V_L及V_H)是由分开的基因编码，但可使用重组方法通过合成接头将此两个域连接在一起，此合成接头使其能够以单一蛋白质链制备，其中V_L及V_H区配对形成单价分子 (称为单链Fv(scFv)；例如参见Bird等人(1988)Science 242:423-426；及Huston 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体亦意图涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常见技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段以供使用。

可以使用本领域中已知的方法来制备特异性结合一种上述靶蛋白(例如 CKB或SLC6a8)的抗体。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体可以是重组产生的，例如通过噬菌体展示或组合方法产生。在另一个实施方案中，抗体是全人抗体(例如在小鼠中制备的抗体，其经遗传工程化以从产生来自人免疫球蛋白序列的抗体)、人源化抗体或非人抗体，例如但不限于，啮齿类(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类(例如但不限于猴)、家兔或骆驼抗体。生成抗体人源化型式的方法的例子包括但不限于，CDR嫁接 (Queen等,U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann等,Nature 332:323(1988))、链改组(U.S.Pat.No.5,565,332)；和镶饰(veneering)或重修表面(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596)；Padlan,Molecular Immunology 28(415):489-498(1991)； Studnicka等,ProteinEngineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.等,PNAS 91:969-973(1994))。生成全人抗体的方法的例子包括但不限于，从小鼠生成能表达人免疫球蛋白基因的抗体并使用噬菌体展示技术来生成和筛选人免疫球蛋白基因文库。

“分离的抗体”意图指基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合CKB或SLC6a8的分离的抗体基本上没有特异性结合这类抗原以外的抗原的抗体)。而且，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物。

如本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文中使用的术语“人抗体”意图包具有以下可变区的抗体，其中框架和CDR区均源自人种系免疫球蛋白基因。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也是源自人种系免疫球蛋白基因。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文中使用的术语“人抗体”不意图包括其中源自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗体。

术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架及CDR区皆衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体可通过杂交瘤产生，该杂交瘤包含自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因及轻链转基因的基因组，所述B细胞融合至永生化细胞。

本文所用的术语“重组人抗体”包含通过重组方式制备、表现、创建或分离的所有人抗体，例如(a)自对于人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体(进一步阐述于下文中)；(b)自经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如自转染瘤)分离的抗体；(c)自重组、组合人抗体文库分离的抗体；和(d)及通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、创建或分离的抗体。这类重组人抗体具有其中框架及CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，这类重组人抗体可经受体外诱变(或在使用对于人Ig 序列转基因的动物时经受体内体细胞诱变)，且由此重组抗体的V_H及V_L区的氨基酸序列尽管源自人种系V_H及V_L序列并与其相关，但其是不可天然存在于体内人抗体种系储库中的序列。

如本文中使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类(例如 IgM或IgG1)。短语“识别抗原的抗体”及“抗原特异性抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。如本文中使用的，术语“高亲和力”对于IgG抗体是指抗体对于靶抗原具有以下K_D：10^-7M或更小、优选10^-8 M或更小、更优选地10^-9M或更小、甚至更优选地10^-10M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可有所变化。举例而言，对于IgM 同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有10^-7M或更小、更优选地10^-8M或更小的K_D。

在一个例子中，组合物含有中和CKB或SLC6a8的单克隆抗体。在一个实施方案中，该抗体可以是全人抗体、人源化抗体或非人抗体，例如但不限于，啮齿类(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类(例如但不限于猴)、家兔或骆驼抗体。在一个实施方案中，可以取代该单克隆抗体的一个或多个氨基酸以改变其物理特性。这些特性包括但不限于，结合特异性、结合亲和力、免疫原性和抗体同种型。含有上述抗体的全人或人源化型式的药物组合物可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖。

如本文中使用的“受试者”指人或非人动物。非人动物的例子包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人哺乳动物、非人灵长类(特别是高等灵长类)、犬、啮齿类(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、猫和兔，以及非哺乳动物，例如鸟类、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是实验动物或适用作疾病模型的动物。要被治疗病症的受试者可通过该病症的标准诊断技术鉴定。任选地，可在治疗前通过本领域中已知或上文描述的方法对受试者检测上文所述的CKB,SLC6a8, miR-483-5p和miR-551a中一种或多种的突变、表达水平或活性水平。如果受试者在基因中具有特定突变，或如果来自受试者的样品中基因表达或活性水平例如大于(在CKB或SLC6a8的情况中)来自正常人的样品中的基因表达或活性水平，则该受试者是本发明治疗的候选者。

为了确认抑制或治疗，可以使用本领域已知的技术在施用步骤之前和/ 或之后确认对癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖的抑制。例示性技术包括对身体器官的CT扫描或PET扫描。

如本文中使用的“治疗”或“处理”指向患有病症的受试者施用化合物或药剂，目的是为了治愈、减轻、缓解、补救、延缓发病、预防或改善病症、病症的症状、病症继发的疾病状态或对病症的易感性。“有效量”或“治疗有效量”指能够在所治疗的受试者中产生医学上想要的结果的化合物或药剂的量。治疗方法可以在体内或离体进行，单独地或与其他药物或治疗联合。治疗有效量可以一次或多次给药、施用或剂量被施用，且不意图被限于特定的制剂或施用途径。

治疗剂可以在体内或离体施用，单独或与其他药物或治疗联合施用，即鸡尾酒疗法。如本文中使用的，术语“共施用”指对受试者施用至少两种药剂或治疗。例如，在肿瘤特别是恶性肿瘤的治疗中，药剂可以单独使用或与例如化疗剂、放疗、凋亡、抗血管生成剂和/或免疫毒素或coaguligand组合使用。在一些实施方案中，两种或更多种药剂/疗法的共施用是同时的。在其他实施方案中，第一药剂/疗法在第二药剂/疗法之前施用。本领域技术人员理解使用的各种药剂/疗法的剂型和/或施用路径可以变化。

在体内办法中，给受试者施用化合物或药剂。通常，化合物悬浮于药学可接受的载体(如例如但不限于生理盐水)中并通过口服或静脉内输注施用，或经皮下、肌内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内或肺内注射或植入。

所需剂量取决于所选择的施用路径；制剂的性质；患者疾病的性质；受试者的个头、重量、表面积、年龄和性别；施用的其他药物；和主治医师的判断。合适的剂量是在0.01-100mg/kg的范围内。所需剂量的变化考虑到可用的化合物种类和各种施用路径的不同效率而是可以预期的。例如，可以预期口服施用比通过i.v注射施用需要更高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用本领域公知的标准的经验性的优化途径进行调整。在合适的投递载体(例如聚合微粒或植入装置)中的化合物的封装可以提高投递效率，尤其对于口服投递而言。

组合物

在本发明范围内的是含有合适的载体和一种或多种上述治疗剂的组合物。组合物可以是含有药学可接受载体的药物组合物，含有饮食可接受的适宜载体的饮食组合物，或含有美容上可接受载体的化妆品组合物。

术语“药物组合物”指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得该组合物特别适合于体内或离体的诊断或治疗用途。“药学可接受的载体”在对受试者施用后不导致不希望的生理效应。药物组合物中的载体必须是“可接受”的意义还在于它是与活性成分相容的且可以能够稳定它。一种或多种增溶剂可以用作药物载体以用于投递活性化合物。药学可接受的载体的例子包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以获得可作为一种剂量形式的组合物。其他载体的例子包括胶态硅氧化物、硬脂酸镁、纤维素、月桂基硫酸钠和D&C Yellow#10。

处于上述任何形式的上述组合物可用于治疗结肠癌。有效量指赋予治疗的受试者治疗效果所需要的活性化合物/药剂的量。如本领域技术人员所认可的，有效剂量会发生变化，这取决于所治疗疾病的类型、施用路径、赋形剂使用和与其他治疗性处理共同使用的可能性。

本发明的药物组合物可以经胃肠外、经口、经鼻、经直肠、局部或经颊施用。本发明所使用的术语“胃肠外”指皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输注技术。

无菌可注射组合物可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液。这些溶液包括但不限于1,3-丁二醇、甘露糖醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质(例如合成的单或双甘油酯)。脂肪酸(例如但不限于油酸及其甘油酯衍生物)可用于注射剂的制备，天然的药学可接受的油(例如但不限于橄榄油或蓖麻油、其聚氧乙烯化的版本)也可以使用。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如但不限于羧甲基纤维素或类似的分散剂。为了制剂目的，也可以使用其他常用的表面活性剂，例如但不限于吐温或Spans或其他相似的乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于药学上可接受的固体、液体或其他剂量形式的制备。

用于口服施用的组合物可以是任何口服可接受的剂量形式，包括胶囊剂、片剂、乳剂和水性悬浮剂、分散剂和溶液。在片剂的情况中，常用的载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。还通常加入润滑剂，例如但不限于硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括但不限于乳糖和干燥的玉米淀粉。当水性悬浮剂或乳剂被口服施用时，活性成分可悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。

根据本发明的用于表面施用的药物组合物可以配制成溶液、软膏剂、霜剂、悬浮剂、洗剂、粉剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。任选地，表面表面制剂可以是浸渍有活性成分的贴剂或敷料的形式，其可任选地包括一种或多种赋形剂或稀释剂。在一些优选的实施方案中，表面表面制剂包括能够增强活性剂通过皮肤或其他感染区域的吸附或渗透的材料。

表面组合物含有安全和有效量的适于施用到皮肤上的皮肤学上可接受的载体。“美容上可接受的”或“皮肤学上可接受的”组合物或成分指适合用于接触人皮肤而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的组合物或成分。载体使得活性剂和可选成分被以合适的浓度投递至皮肤。因此，载体可以作为稀释剂、分散剂、溶剂等发挥作用以确保活性材料被施用并以合适的浓度平均分布在所选目标上。载体可以为固体、半固体或液体。载体可以是乳液、乳膏或凝胶的形式，尤其是具有足够厚度或软化点(yield point)以阻止活性材料沉淀的一种。载体可以是惰性的或具有皮肤学上的益处。它还可以与本发明的活性成分在生理和化学上相容，并且不应当不适当地损害与该组合物相关的稳定性、功效或其他用途的益处。

诊断和预后方法

上述基因可用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌。或者，可将其用于确定受试者中这类病症的预后。

诊断方法

在一个方面，本发明提供定性和定量信息来确定受试者是否患有或易感于转移性结肠癌、易感于转移性结肠癌的复发、易感于对化疗抗性的结肠癌、或由癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖表征的其他疾病。可以基于来自受试者的测试样品中上述基因或产物(mRNA、microRNA或多肽) 的表达水平、模式或概况来确定患有这类病症或倾向于患有这类病症的受试者。换言之，该产物可用作标志物来指示病症的存在或缺乏。本发明的诊断和预后测定法包括用于评估产物的表达水平的方法。该方法允许检测病症。例如，一种或多种促进物(即CKB或SLC6a8)的表达水平的相对升高指示该病症的存在。相反，较低的表达水平或缺乏表达指示没有该病症。类似地，一种或多种抑制剂(即miR-483-5p或miR-551a)的较低表达水平或缺乏指示病症的存在，而表达水平中的相对升高指示没有该病症。

可以评估测试样品中mRNA、microRNA或肽产物的存在、水平或缺乏，其通过从测试受试者获得测试样品并将测试样品与能检测核酸(例如RNA或 DNA探针)或多肽的化合物或药剂接触。“测试样品”包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及受试者内存在的组织、细胞和流体。可以以许多方式来测量目的基因的表达水平，包括测量基因编码的RNA。

可使用许多公知规程中的任一种来从生物学样品分离表达的RNA样品。例如，可将生物学样品裂解于基于胍盐的裂解缓冲液(任选含有另外组分以稳定化RNA)中。在一些实施方案中，裂解缓冲液可含有纯化的RNA作为对照来监测来自细胞培养物的RNA的回收和稳定性。这类纯化的RNA模板的例子包括来自PROMEGA(Madison,WI)的卡那霉素阳性对照RNA，和来自LIFE TECHNOLOGIES(Rockville,MD)的7.5kb聚(A)加尾RNA。可以立即使用裂解物或在例如-80℃冷冻保藏。

任选地，可使用基于硅石的分离从细胞裂解物(或其他样品类型)纯化总RNA，其以自动化相容、96孔形式，如RNEASY纯化平台(QIAGEN,Inc., Valencia,CA)。涵盖其他RNA分离方法，如用硅石包被的珠或胍盐提取。本领域技术人员能够设计用于RNA分离和制备的其他方法。

可以使用粗样品(例如血液、血清、血浆或细胞裂解物)来实施本发明的方法，从而消除了分离RNA的需要。任选地添加RNAse抑制剂至粗样品。当使用粗细胞裂解物时，应注意根据样品不同，基因组DNA可能供应了靶序列例如某基因的一个或多个拷贝。在靶序列源自一种或多种高度表达的基因的情况中，来自基因组DNA的信号可能不显著。但对于以低水平表达的基因，可通过将样品用DNAse处理，或通过使用靶向剪接接合处用于后续引发 cDNA或扩增产物的引物来消除背景。

可以原位和体外测定细胞中对应于基因的RNA水平。可将从测试样品分离的RNA用于杂交或扩增测定法，其包括Southern或Northern分析、PCR分析和探针阵列。用于检测RNA水平的优选诊断方法牵涉使分离的RNA与核酸探针接触，该核酸探针能与基因编码的RNA杂交。探针可以是全长核酸或其部分，如长度为至少10个核苷酸且足以在严格条件下特异性杂交于该RNA的寡核苷酸。

在一个形式中，将RNA(或从其制备的cDNA)固定化于表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的RNA并将RNA从凝胶转移至膜如硝酸纤维素。在另一个形式中，将探针固定化于表面上，并使RNA(或cDNA) 与探针接触，例如在基因芯片阵列中。熟练的技术人员可以改编已知的RNA 检测方法来检测RNA水平。

可用核酸扩增来估测样品中要检查的基因所编码的RNA(或从其制备的 cDNA)的水平，例如通过标准PCR(美国专利No.4,683,202)、RT-PCR(Bustin S.J MolEndocrinol.25:169-93,2000)、定量PCR(Ong Y.等,Hematology. 7:59-67,2002)、实时PCR(Ginzinger D.Exp Hematol.30:503-12,2002)和原位PCR(Thaker V.Methods MolBiol.115:379-402,1999)，或任何其他核酸扩增方法，继之以施用本领域中已知的技术来检测扩增分子。在另一个实施方案中，本发明的方法还包括使对照样品与能检测基因的RNA的化合物或药剂接触，并将对照样品中RNA的存在与测试样品中RNA的存在比较。

上文描述的方法和标志物可用于评估受试者形成结肠癌的风险。具体地，本发明可适用于那些在高风险组的、已经具有某些风险的受试者，从而获得对早期检测的关键了解。与结肠癌有关的上述基因产物水平中的变化可以在受试者的细胞中形成转换的或赘生表型之前或其早期阶段检测。本发明因此还提供一种用于筛选有风险形成结肠癌或其结肠癌的转移性复发的受试者的方法，其包括在从受试者获得的生物学样品中评估至少一种与病症相关的基因产物或基因产物组合的水平。因此，生物学样品中基因产物或基因产物组合的水平相比于对照样品中相应基因水平的变化指示受试者有形成该病症的风险。用于这类筛选的生物学样品可包括组织样品，其为正常的或怀疑为癌性的。具有与结肠癌相关的一种或多种基因产物的水平变化的受试者是进一步监测和检验的候选者。这类进一步检验可包括对组织样品的组织学检查或本领域内的其他技术。

如本文中使用的，术语“诊断”意为检测疾病或病症，或者确定疾病或病症的阶段或程度。通常地，对疾病或病症的诊断基于对指示疾病的一种或多种因子和/或症状的评估。亦即，诊断可基于指示疾病或状况的存在或缺乏的因子的存在、缺乏或量来进行。被视为指示用于特定疾病诊断的每个因子或症状不需要唯一地与该特定疾病相关；即可从某诊断因子或症状推断出不同的诊断。类似地，有可能指示特定疾病的因子或症状存在于不具有该特定疾病的个体中。所述诊断方法可以独立地使用，或与医学领域已知用于特定疾病或病症(例如结肠癌)的其他诊断和/或分期方法组合使用。

预后方法

上文描述的诊断方法能鉴定出患有、或有风险形成结肠癌或转移性结肠癌的复发的受试者。另外，生物学样品，例如外周血样品中上述基因的表达水平和/或趋势的变化能提供恢复或其缺乏的早期指示。例如，促进物基因(或抑制剂基因)的进一步的增加(或衰减)或持久改变的基因表达水平指示较差预后，即缺少改善或健康衰退(或仍是较差预后)。因此，这些基因允许评估结肠癌的治疗后恢复。对这一基因选择组或其子集的分析指示疾患的结果。

本文中描述的预后测定法可用于确定是否适宜对受试者施用药剂(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物) 以治疗结肠癌或与癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖相关的其他病症。例如，这类测定法可用于确定是否可对受试者施用化疗剂。

如此，本发明还提供一种监测受试者中的细胞增殖性病症治疗的方法。为此，可在进行治疗之前、期间或之后测定来自受试者的测试样品中本文中披露的基因的基因表达水平。然后评估相比于基线水平在水平中的变化幅度。治疗后在上述促进物基因(例如CKB或SLC6a8)表达中的降低指示可通过同一治疗来进一步治疗受试者。类似地，抑制剂(例如miR-483-5p或miR-551a) 的升高还指示可通过同一治疗来进一步治疗受试者。相反地，一种或多种促进物基因的进一步升高或持久的高表达水平(或一种或多种抑制剂基因的进一步降低或持久的低或无表达水平)指示缺少改善或健康衰退。

从实施上述测定法获得的信息可用于疾病和影响个体受试者的健康状态的其他有害状况的预测、鉴定其进展和临床管理。在优选的实施方案中，前述诊断测定法提供可用于结肠癌、转移性结肠癌和由癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖表征的其他疾患的预测、鉴定其进展和管理的信息。更特定地，该信息协助临床医师设计化疗或其他治疗方案来从患病受试者(人)的身体中根除这类疾患。

如本文中使用的，术语“预后”指对临床疾患或疾病的可能进程和结果的预测。预后通常通过估测疾病的因子或症状来进行，该因子或症状指示疾病的有利或不利进程或结果。如本文中使用的短语“确定预后”指熟练技术人员可预测患者中疾病的进程或结果的过程。术语“预后”不指以100％的准确性来预测疾患的进程或结果的能力，相反，熟练技术人员会理解术语“预后”指特定进程或结果将发生的增加的可能性；即，某种进程或结果更可能在展现出给状况的患者(与不展现该状况的那些个体相比)中发生。

如本文中使用的术语“有利预后”和“阳性预后”，或者“不利预后”或“阴性预后”是用于预测疾患或疾病的可能进程和/或可能结果的相关术语。有利或阳性预后比不利或阴性预后对于疾患预测更好的结果。在一般意义上，“有利预后”是比许多其他可与特定疾患有关的可能预后相对更好的结果，而不利预后预测比许多其他可与特定疾患有关的可能预后相对更差的结果。有利或阳性预后的典型例子包括好于平均的治愈率、更低的转移倾向、长于预期的生命期望、从癌性过程分化为良性过程等。例如，阳性预后是其中患者具有治疗后特定癌症被治愈的50％的可能性的预后，而患有相同癌症的平均患者仅具有25％的可能性被治愈。

术语“测定/确定”、“测量”、“评估”和“检验”可交换使用且包括定量和定性测量，和包括确定特征性的性状或特征是否存在。评估可以是相对的或绝对的。“评估…(靶物)的存在”包括测定存在的靶物的量，以及确定其是存在还是缺乏。

阵列

本发明中还提供生物芯片或阵列。生物芯片/阵列可以含有固体或半固体底物，其具有本文中描述的附接的探针或多个探针。探针可以能够在严格杂交条件下与靶序列杂交。探针可以附接于底物上的空间限定的地址。可以使用每靶序列超过个探针，有重叠的探针或针对特定靶序列的不同区段的探针。探针可以能与本领域技术人员领会的单个病症有关的靶序列杂交。可以先合成探针，随后附接于生物芯片，或者可以直接在生物芯片上直接合成。

如本文中使用的涉及核酸(例如探针)和固体支持物的“附接”或“固定化”可以意指探针和固体支持物之间的结合在结合、清洗、分析和除去的条件下使足够稳定的。结合可以是共价或非共价的。共价键可以在探针和固体支持物之间直接形成或者可以通过交联剂或通过在固体支持物或探针或两者的分子上纳入特定反应基团来形成。非共价结合可以是静电、亲水和疏水性相互作用的一种或多种。纳入非共价结合的是分子如链霉亲合素对支持物的共价附接，和生物素化探针对链霉亲合素的非共价结合。固定化可能还牵涉共价和非共价相互作用的组合。

固体基质可以是以下材料，其可经过修饰以含有适用于探针的附接或联合的离散个体位点且能通过至少一种检测方法处理。这类基质的例子包括玻璃和经修饰或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、树脂、硅石或基于硅石的材料(包括硅和经修饰的硅)、碳、金属、无机玻璃和塑料。所述基质可允许光学检测而没有可感受到的荧光。

基质可以是平面的，尽管也可以使用其他构造的机制。例如，可将探针置于管的内部表面上，用于流通样品分析以最小化样品体积。类似地，基质可以是柔性的，如弹性泡沫，包括由特定塑料制成的闭孔泡沫。

可以将阵列/生物芯片和探针用化学官能团衍生化以用于两者的后续附接。例如，可将生物芯片可包括但不限于以下的化学官能团衍生化：氨基基团、羧基基团、氧基团或硫醇基团。使用这些官能团，使用接头可以直接或间接地利用探针上的官能团来附接探针。探针可以通过5'末端、3'末端或经由内部核苷酸附接于固体支持物。探针还可以非共价附接于固体支持物。例如，可以制备生物素化的寡核苷酸，其可结合用链霉亲合素共价包被的表面，从而引起附接。或者，可使用技术如光聚作用和光刻(photolithography)在表面上合成探针。用于将核酸连接至固体基质的方法的详细论述可见于，例如美国专利Nos.5837832,6087112,5215882,5707807,5807522,5958342, 5994076,6004755,6048695,6060240,6090556,和6040138。

在一些实施方案中，表达的转录本(例如本文中描述的microRNA或多肽基因的转录本)被表现在核酸阵列中。在这类实施方案中，一组结合位点包括具有不同核酸的探针，所述核酸与表达的转录本的不同序列区段互补。这类核酸的例子可以是长为15至200个碱基、20至100个碱基、25至50个碱基、 40至60个碱基。除了与其靶序列互补的序列外，每个探针序列还可包含一个或多个接头序列。接头序列是与其靶序列互补的序列与支持物表面之间的序列。例如，本发明的核酸阵列可具有与每个靶microRNA基因特异性的一个探针。然而，若期望，核酸阵列可含有特异于一些表达的转录本(例如本文中描述的microRNA基因的转录本)的至少2,5,10,100,200,300,400,500或更多个探针。

试剂盒

在另一个方面，本发明提供具体化如本文中描述的用于分析多肽和 microRNA表达的方法、组合物和系统的试剂盒。这类试剂盒可含有本文中描述的核酸连同以下任一种或所有：测定试剂、缓冲剂、探针和/或引物、和无菌盐水或另一种药学可接受的乳剂和悬剂基底。另外，试剂盒可包含指导材料，其含有用于实践本文所述方法的指导(例如方案)。例如，试剂盒可以是用于扩增、检测、鉴定或量化靶mRNA或microRNA序列的试剂盒。为此，试剂盒可含有适宜的引物(例如发夹引物)、正向引物、反向引物和探针。

在一个例子中，本发明的试剂盒包含一个或多个微阵列载玻片(或备选的微阵列形式)，其上已存放有多个不同的核酸(各自对应于上述基因之一)。或者，试剂盒可包含适用于探针的多个多核苷酸和适用于纳入的多核苷酸序列定制化的标记物选择，或其他多核苷酸序列，由专业人员来判断。通常，至少一个纳入的多核苷酸序列对应于一个对照序列，例如标准化基因等。例示性标记物包括但不限于，荧光团、染料、放射性标记物、酶标签，其连接于核酸引物。

在一个实施方案中，提供适用于扩增对应于表达的RNA样品的核酸的试剂盒。这类试剂盒包含适用于在上文描述的任意扩增方法中使用的试剂盒引物。或者/另外地，试剂盒适用于扩增对应于探针与靶核酸样品(例如存放于微阵列上)之间的杂交的信号。

另外，任选地，试剂盒中包含制备用于基因表达分析的生物样品所需的一种或多种材料和/或试剂。此外，任选包含在试剂盒中的是一种或多种适于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(RT、Taq等)，一种或多种脱氧核苷酸，和提供扩增需要的反应混合物的缓冲液。

通常，将试剂盒用于分析基因表达模式，其使用mRNA或microRNA作为起始模板。RNA模板可以呈现为总细胞RNA或分离的RNA；两种样品类型得到可比的结果。在其他实施方案中，本发明中描述的方法和试剂盒允许量化基因表达的其他产物，包括tRNA、rRNA或其他转录产物。

任选地，本发明的试剂盒还包含加速数据的生成、分析和/或存储和促进数据库读取的软件。软件包括逻辑指令、指令集或可用于收集、存储和/或分析数据的适宜的计算机程序。使用提供的软件可对数据进行比较和关系分析。

任选地，试剂盒含有单个试剂盒/或酶区分的不同容器。每种组分一般将适用于在其相应容器中等分试样。试剂盒的容器任选包括至少一个小瓶、安瓿(ampule)或试管。也可以是其中可放置和/或等分试样的试剂的烧瓶 (Flask)、瓶子或其他容器装置。试剂盒的每个容器优选地保持于严密限制以用于商业销售。适宜的较大容器可包括注射或吹模塑料容器，其中保留有期望的管形瓶(vial)。任选地，用法说明书，如详述本发明试剂盒使用的书面指导或录像带展示与试剂盒一起提供。

在另一个方面，本发明提供本文中的任意组合物或试剂盒用于实践本文中的任意方法或测定法的用途，和/或任意装置或试剂盒实践本文中测定法或方法的用途。

如本文中使用的，“测试样品”或“生物学样品”可以意指包含核酸的生物学组织或流体样品。这类样品包括但不限于，从动物分离的组织或体液。生物学样品还可以包括组织切片，如活组织检查和尸检样品，为组织学目的而取的冷冻切片，血液，血浆，血清，痰，粪便，泪，粘液，尿液，渗出物，羊水，腹水，毛发和皮肤。生物学样品还包括外植体和源自患者组织的原代和/或经转化的细胞培养物。生物学样品可通过从动物取出细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如分离由另一人，在另外的时间和/ 或用于另一目的而进行)或通过体内实施本文中描述的方法来实现。还可以使用归档组织(Archivaltissue)，如具有治疗史或结果史的那些。

术语“体液”或“身体流体(bodily fluid)”指来自动物身体的任意流体。体液的例子包括但不限于，血浆，血清，血液，淋巴液，脑脊髓液，滑液，尿液，唾液，粘液(mucous)，粘液质(phlegm)和痰(sputum)。体液样品可通过任何适宜的方法收集。体液样品可立即使用或可保藏用于后续使用。可将本领域已知的任何适宜的保藏方法用于保藏体液样品：例如，样品可冻存于约-20℃至约-70℃。适宜的体液是无细胞流体。“无细胞”流体包括其中细胞不存在，或存在的量很低以至于测定的miRNA水平反映其在样品的液体部分而非细胞部分的水平的体液样品。这类无细胞体液一般通过处理含细胞体液(通过例如离心或过滤)以除去细胞而产生。无细胞体液通常不含有完整细胞，然而一些可能含有细胞碎片或细胞残余物。无细胞流体的例子包括血浆或血清，或已除去细胞的体液。。

本文中使用的术语“基因”指天然(例如基因组)或合成基因，其包含转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或不翻译序列(例如内含子、5'-和3'不翻译序列)。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA，如tRNA, rRNA、催化性RNA,siRNA,miRNA或反义RNA的核苷酸序列。基因也可以是对应于编码区(例如外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选地包含与其连接的5'-或3'不翻译序列。基因还可以是体外产生的扩增核酸分子，包含全部或部分的编码区和/或与其连接的5'-或3'不翻译序列。该术语还包括假基因，其为已知基因的功能异常相关物，已失去其蛋白质编码能力或者不再在细胞中表达。

如本文中使用的“表达概况(profile)”指基因组表达概况，例如microRNA 的表达概况。可通过用于测定核酸序列水平的任何常规手段来生成概况，例如microRNA、cRNA等的定量杂交，定量PCR，用于定量的ELISA等，并容许分析两样品之间的差异基因表达。测定受试者或患者样品，例如细胞或其集合，例如组织。通过本领域中已知的任意方便方法来收集样品。目的核酸序列是发现为预测性的核酸序列，包括本文中所述那些的核酸序列，其中表达概况可包含5,10,20,25,50,100个或更多(包括所有)所列核酸序列的表达数据。术语“表达概况”还可以意指测量核酸序列在所测量样品中的丰度。

“差异表达”指细胞和组织中时序性和/或细胞基因表达模式中的定性或定量差异。如此，差异表达的基因可定性改变其表达，包括在例如正常对疾病组织中的激活或失活。相对于另一状态，基因在某特定状态可打开或关闭，如此允许比较两个或更多个状态。定性调控的基因将展现出状态内或细胞类型中的表达模式，其可通过标准技术检测。一些基因将在一个状态或细胞类型而非两者中表达。或者，表达中的差异可以是定量的，例如表达受调控，上调引起增加的转录本量，或下调引起降低的转录本量。表达差异的程度仅需要足够大以经由标准表征技术量化，所述标准技术如表达阵列、定量逆转录PCR、Northern分析和RNase保护。

如本文中使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸。对单链的描述也限定了互补链的序列。如此，核酸还涵盖所示单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。如此，核酸还涵盖基本相同的核酸及其互补物。单链提供了可与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。如此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体(其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，和包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合)。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。

术语“引物”指能在其3'端与互补核酸分子杂交且提供可由核酸聚合酶延伸的游离3'羟基末端的任何核酸。如本文中使用的，扩增引物是能与基因 (分别为正链和负链，或反之)的5’或3’区退火且之间包含短区域的一对核酸分子。在适宜的条件下，使用适宜的试剂，这类引物允许扩增具有两侧为该引物的核苷酸序列的核酸分子。对于原位方法，可制备细胞或组织样品并固定化于支持物如玻璃载玻片上，然后与可杂交于RNA的探针接触。用于扩增对应于表达的RNA样品的核酸的其他方法包括记载于例如美国专利No. 7,897,750的那些。

如本文中使用的术语“探针”指能结合具有互补序列的靶核酸的寡核苷酸，该结合经由一种或多种类型的化学键，通常经由互补碱基配对，通常经由氢键形成。根据杂交条件的严格性，探针可以结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。可以存在任意数目的碱基对错配，其将干扰本文中描述的靶序列与单链核酸之间的杂交。然而，如果突变数目太多以至于甚至在最小严格杂交条件下也不能发生杂交，那么该序列不是互补靶序列。探针可以是单链或部分单链和部分双链的。探针的链性由靶序列的结构、组成和特性决定。探针可以直接标记或间接标记，如用生物素标记，其可之后被链霉亲合素蛋白复合物结合。

如本文中使用的提述核酸的“互补体”或“互补”可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。完全互补体或完全互补可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的100％互补碱基配对。

如本文中使用的“严格杂交条件”指以下条件，在该条件下第一核酸序列(例如探针)与第二核酸序列(例如靶物)杂交，如在核酸的复杂混合物中。严格条件是序列依赖性的且在不同情况下不同，而且可由本领域技术人员适宜地选择。严格条件可选择为比在限定的离子强度pH下特定序列的热熔解点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是50％的与靶物互补的探针与靶序列杂交达到平衡的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列过量存在，在Tm 处，50％的探针处于平衡占据态)。严格条件可以是以下条件，其中盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，在pH 7.0至8.3，且温度对于短探针(例如约10-50个核苷酸)为至少约30℃，对于长探针(例如超过约50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是至少2至10倍背景杂交。例示性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5xSSC和1％SDS，在42℃温育，或者5xSSC，1％SDS，在65℃温育，并在0.2xSSC和0.1％SDS中于65℃清洗。然而，除了温度以外的几个因素，如盐浓度，可以影响杂交严格性，本领域技术人员能适宜地选择因素来实现相似的严格性。

如本文中使用的术语“参照值”指当与测定结果比较时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参照值从将microRNA或蛋白质表达与已知临床结果比较的研究的统计学分析测定。参照值可以是阈值得分值或截留得分值(cutoff score value)。参照值典型将为在其之上(或之下)一种结果将更可能而在其之下另一种结果更可能的阈值。

在一个实施方案中，参照水平可以是一个或多个miRNA或多肽水平，其表示为取自对照健康(无疾病)受试者群体的样品的miRNA或多肽的平均水平。在另一个实施方案中，参照水平可以是在不同时间的同一受试者中的水平，例如在当前测定之前，如在受试者形成疾病之前或在启动治疗之前。一般地，通过通用因子将样品标准化。例如，无细胞体液样品通过体积体液标准化，含细胞样品通过蛋白质含量或细胞计数标准化。核酸样品还可以相对于内部对照核酸标准化。

如本文中公开的，一种或多种多肽或RNA(mRNAs或microRNAs)水平的差异指示疾病或其阶段。短语“水平的差异”指特定标志物如核酸在样品中的量相比于对照或参照水平的差异。例如，特定生物标志物的量可以以相比于参照水平升高的量或降低的量存在于患有赘生性疾病的患者的样品中。在一个实施方案中，“水平的差异”可以是存在于样品中的特定生物标志物的量相比于对照(例如参照值)至少约1％,2％,3％,5％,10％,15％,20％,25％, 30％,35％,40％,50％,60％,75％,80％100％,150％,200％或更大的差异。在一个实施方案中，“水平的差异”可以是样品中存在的生物标志物的量相比于对照的统计学显著的差异。例如，如果生物标志物的测量水平落入任何对照或参照组的均值的约1.0标准偏差，约1.5标准偏差，约2.0标准偏差，或约2.5 标准偏差之外，则该差异可以是统计学显著的。对于miRNA测量，水平可自实时PCR测量为Ct值，其可如下文实施例中描述的标准化为ΔCt值。

药物筛选

本发明提供用于鉴定可用于治疗结肠癌或抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖的化合物的方法。

要筛选的候选化合物(例如蛋白质、肽、肽模拟物、类肽(peptoid)、抗体、小分子或其他药物)可使用本领域已知的组合文库方法中的众多办法来获得。这类文库包括：肽文库、类肽文库(具有肽的功能性，但具有对酶降解抗性的新非肽主链的分子的文库)；空间可寻址的并行固相或溶液相文库；通过去卷积或亲和层析选择获得的合成文库；和“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库。参见例如Zuckermann等1994,J.Med.Chem. 37:2678-2685；和Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145。用于合成分子文库的方法的例子可见于，例如DeWitt等,1993,PNAS USA 90:6909；Erb等,1994, PNAS USA 91:11422；Zuckermann等,1994,J.Med.Chem.37:2678；Cho等, 1993,Science 261:1303；Carrell等,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059； Carell等,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等,1994J.Med. Chem.37:1233。化合物的文库可呈递在溶液中(例如Houghten,1992, Biotechniques 13:412-421)，或在珠(Lam,1991,Nature 354:82-84)，芯片(Fodor, 1993,Nature 364:555-556)，细菌(美国专利No.5,223,409)，孢子(美国专利No.5,223,409)，质粒(Cull等,1992,PNAS USA 89:1865-1869)或噬菌体上 (Scott和Smith1990,Science 249:386-390；Devlin,1990,Science 249:404-406； Cwirla等,1990,PNASUSA 87:6378-6382；Felici 1991,J.Mol.Biol. 222:301-310；和美国专利No.5,223,409)。

为了鉴定可用的化合物，可以使测试化合物与含有表达报道基因的测试细胞的系统接触，所述报道基因由与选自上述转移促进物或抑制剂的标志物基因的启动子可操作连接的核酸编码。该系统可以是体外细胞系模型或体内动物模型。细胞可以天然表达该基因，或可经修饰以表达重组核酸。重组核酸可含有编码报道多肽的核酸和异源启动子。然后可测量miRNA、多肽或报道多肽的表达水平。

对于多肽，表达水平可在mRNA水平或在蛋白质水平测定。测量细胞、组织样品或体液中mRNA水平的方法是本领域中公知的。为了测量mRNA水平，可以裂解细胞且裂解物中mRNA或从裂解物纯化或半纯化的RNA的水平可通过，例如杂交测定法(使用可检测标记的基因特异性DNA或RNA探针)和定量或半定量RT-PCR(使用适宜的基因特异性引物)来测定。或者，可使用组织切片或未裂解的细胞悬液以及可检测(例如荧光或酶)标记的DNA或RNA 探针来实施定量或半定量原位杂交测定法。其他mRNA量化方法包括RNA保护测定法(RPA)和SAGE。测量细胞或组织样品中蛋白质水平的方法也是本领域已知的。

为了确定候选化合物治疗结肠癌或抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活或转移性定殖的有效性，可以将以上文所述方式获得的水平与对照水平 (例如在缺少候选化合物的情况下获得的)比较。化合物被鉴定为有效，如果 (i)转移抑制剂的水平高于对照或参照值或(ii)转移促进物的水平低于对照或参照值。可以使用如下文实施例中公开的体外细胞培养模型或体内动物模型进一步验证如此鉴定的化合物的功效。

实施例

实施例1

本实施例描述了用于下文实施例2-15的材料和方法。

体内选择

将表达萤光素酶报道物的1x 10⁶LS174T细胞悬浮于20μl体积的1:1 PBS/Matrigel混合物中并肝内注射到NOD-SCID小鼠的肝中。允许转移性小结在3-4周的时段内生长并通过生物发光成像来监测。切出形成的小结并通过胶原酶和透明质酸酶消化解离成单细胞悬液。允许细胞体外扩大，接着重注射到小鼠中。在重复3遍体内选择后，建立高度转移性的LvM3a和LvM3b衍生系细胞系。

Lenti-miR库筛选

将细胞用611种miRNA的慢病毒Lenti-miR库(System Biosciences)以低感染复数(MOI)转导，从而使得每个细胞过表达单一的miRNA。然后，将经转导的群体肝内注射到NOD-SCID小鼠中用于体内选择在过表达时促进或抑制转移性肝定殖的miRNA。在注射前，依照制造商方案从肝小结中细胞上实施基因组DNA PCR扩增和回收慢病毒miRNA插入物。miRNA阵列序型分析 (profiling)允许在体内选择之前和之后进行miRNA插入物定量。

器官型切片培养系统

将要注射的细胞用细胞追踪剂红或绿色(Invitrogen)标记并经由脾内注射接种到NOD-SCID小鼠的肝中。然后提取肝并使用McIlwain组织切碎器 (Ted Pella)切成150um切片，铺板于器官型组织培养插入物(Millipore)并在补充有Hepatocyte MaintenanceSupplement Pack(Invitrogen)的William’s E培养基中培养。在指定的时间段后，将肝切片在低聚甲醛中固定并使用多光子显微术成像。

体内胱天蛋白酶活化测定法

为了测量体内胱天蛋白酶活性，使用VivoGlo胱天蛋白酶3/7底物 (Z-DEVD-氨基萤光素钠盐，Promega)。萤光素在通过凋亡细胞中活化的胱天蛋白酶-3从其切割DEVD肽以前都是无活性的。将DEVD-萤光素注射到携有表达萤光素酶的结直肠癌细胞的小鼠中。在通过凋亡细胞活化时，可实施生物发光成像来测量体内胱天蛋白酶活性。在体内胱天蛋白酶活性测量后5小时，用常规萤光素注射小鼠用于标准化目的。

腺伴随病毒疗法

将miR-483-5p和miR-551a以多顺反子(由串联的两个miRNA前体和侧翼基因组序列组成)克隆到scAAV.GFP(质粒21893,Addgene)的BglII和NotI位点中。下文列出了编码miR-483-5p和miR-551a的基因组序列(SEQ ID NOs:5和 6)，对应的前体序列(带下划线，SEQ ID NOs:3和4)，和对应的成熟microRNA 序列(带下划线和粗体，SEQ ID NOs:1和2)。将腺伴随病毒包装，使用来自 Cell Biolabs的AAV-DJ Helper Free表达系统纯化和滴定。

miR-551a:

miR-483-5p:

下文列出了SEQ ID NO:1-4的相应RNA序列(SEQ ID NOs:7-10)

GACCCACUCUUGGUUUCCA(SEQ ID NO:7)

GGGGACUGCCGGGUGACCCUGGAAAUCCAGAGUGGGUGGGGCCAGU CUGACCGUUUCUAGGCGACCCACUCUUGGUUUCCAGGGUUGCCCUG GAAA(SEQ ID NO:8)

GAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG(SEQ ID NO:9)

GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCUCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCUCCUCUC(SEQ ID NO:10)

CKB,SLC6a8敲低

从Sigma-Aldrich购得表达靶向CKB和SLC6a8的shRNA发夹的pLKO载体。将产生最佳转录物水平敲低的两个独立发夹用于所有实验。下文列出了这些发夹DNA和RNA序列：

将以下引物用于SLC6a8的定量qRT-PCR：正向引物：5’-GGC AGC TAC AAC CGC TTCAAC A-3’和反向引物：5’-CAG GAT GGA GAA GAC CAC GAA G-3’(分别为SEQ ID No.21和22)。

环肌酸和Beta-胍基丙酸处理

将小鼠用10mg的环肌酸或盐水媒介物处理，经由腹膜内注射施用。处理方案开始于肿瘤细胞接种后一天，并持续至小鼠被安乐死。以200ul 0.5M溶液的剂量经由腹膜内注射施用Beta-胍基丙酸。处理方案与环肌酸处理的相同。

实施例2

作为鉴定结肠癌的肝定殖的分子调控物的第一步，在经由重复将癌细胞肝内注射到免疫缺陷性小鼠用于增强的肝定殖而在LS-174T人结肠癌系上实施体内选择，接着手术切除肝集落并将细胞解离。更具体地，在直接肝内注射后通过生物发光来检查5X10⁵LS-亲本(Parental)、LvM3a和LvM3b细胞的肝定殖。在注射后第21天将小鼠成像，并提取肝用于离体成像和大体(gross) 形态学检查。获得并比较各组的光子通量比。发现第三代肝定殖物LS-LvM3a 和LS-LvM3b在肝内注射后相对于其亲本系展现出急剧增强的肝定殖能力 (>50倍)。重要地，这些衍生物在转移性定殖测定法中在门脉循环注射后还展现出显著增强(>150倍)的肝转移能力—从而揭示了肝定殖能力是结肠癌转移进展中的关键步骤。对于这些生物发光测定法，各组的相应光子通量比的所有P值均基于单侧Student’s t检验且发现其低于0.05,0.001,或0.0001。

为了系统性鉴定转移性进展的microRNA调控物，将慢病毒颗粒的库(各编码611种人microRNA之一)转导到LS-LvM3b定殖物群体LS-174T亲本系和 SW620结肠癌群体中。然后将含有表达661种miRNA中每种的癌细胞的这些癌群体肝内注射到小鼠中以允许选择出能定殖肝的细胞。miRNA序列的基因组PCR扩增、逆转录和miRNA插入物的miRNA序型分析允许量化miRNA插入物呈现(representation)。鉴定出几种miRNA在两种细胞系的肝定殖背景中展现出漏失(drop-out)，这与这些miRNA的过表达抑制结肠癌细胞的肝定殖一致。

实施例3

在本实施例中，实施测定法来检查任何这些miRNA的内源水平在高度转移性衍生物中相对于同基因较差转移性细胞展现出沉默。事实上，发现 miR-483-5p和miR-551a在高度转移性LS-LVM3a和LS-LVM3b肝定殖物中相对于其亲本系和在转移性SW620衍生物中相对于其同基因亲本系被沉默。与这些miRNA在肝定殖中的抑制作用一致，miR-483-5p或miR-551a的过表达有力抑制LS-LvM3b细胞的转移性定殖，而在较差转移性亲本系LS-174T和SW480中对内源性miR-483-5p或miR-551a的抑制显著增强了肝转移性定殖。

实施例4

在本实施例中，实施测定法来研究这些miRNA施加其抗转移效果的机制。这些miRNA对于转移进展的效果并不继发于对增殖能力的调控，因为 miR-551a抑制不影响体外增殖，而miR-483-5p抑制提高增殖。另外，这些 miRNA的过表达不改变癌细胞的侵入能力或凋亡率。为了确定这些miRNA 影响转移的机制，实施测定法来鉴定转移过程期间过表达这些miRNA的细胞展现出进展缺陷时的时间点。令人惊讶地，注意到在将细胞注射到门脉循环中用于肝转移性定殖测定法后早达24小时时，过表达这些miRNA的细胞就在其代表性中超出了表达对照发夹的细胞。

实施例5

为了阐明这些miRNA抑制肝转移性定殖的机制，开发了体外肝器官型切片培养系统。该系统允许研究结肠癌细胞在肝微环境中的单细胞扩散后肝转移期间的早期事件。与之前对于转移性定殖期间细胞存活的显著选择的研究一致，作为时间的函数的是，在肝微环境中的细胞数中有较大降低。高度转移性LvM3b定殖物细胞在持续处于肝微环境方面显著优于其较差转移性亲本系—与在转移性进展中的肝内持久性方面的阳性作用一致。

接着，实施测定法来研究该miRNA调控网络对癌细胞持久性的作用是否由转移性进展期间减小的癌细胞存活所致。为了量化体内细胞死亡，利用胱天蛋白酶-3/7活性的基于生物发光的萤光素报道物。

更具体地，将内源性miR-483-5p或miR-551a受抑制的SW480细胞随后通过脾内注射导入免疫缺陷性小鼠的肝中。然后，使用胱天蛋白酶-3活化的 DEVD-萤光素监测这些细胞中的相对体内胱天蛋白酶活性。发现miRNA抑制在肝定殖的早期显著降低结肠癌细胞中的体内胱天蛋白酶活性，从而揭示了癌存活是被这些miRNA抑制的表型。

这些体内发现得到器官型切片培养系统的支持。简言之，器官型培养物 (n＝8)中通过用LNA预处理抑制内源性miR-483-5p或miR-551a的SW480细胞的存活。将5X10⁵细胞用细胞追踪剂绿色(LS-Parental)或细胞追踪剂红色 (LvM3b)标记并经由脾内注射引入肝中。在注射后立即切取肝病使用组织切碎器制备150-um切片培养物。用多光子显微镜监测器官型培养物中的细胞存活达长达4天。实施染料交换实验以排除染料偏倚的影响。显示第0天和第3 天的代表性图像。发现microRNA在LS-LvM3b细胞中的过表达抑制了结肠癌持久性，而抑制两种microRNA的内源性水平增强了较差转移性SW480细胞的持久性。上述发现解释了miR-483-5p和miR-551a抑制肝中的肝转移性定殖和转移性细胞存活(由高度转移性结肠癌细胞所展现的表型)。

实施例6

在本实施例中，实施测定法来鉴定这些miRNA的下游效应物。经由转录组序型分析，鉴定出被每种microRNA的过表达下调且含有与该miRNA互补的3’-UTR或编码序列(CDS)元件的转录本。有意思的是，肌酸激酶脑型(CKB) 被鉴定为两种miRNA的推定靶物，表明展现出共有的体内和器官型表型的这些miRNA可能经由共有的靶基因来介导其作用。实际上，定量PCR验证揭示了在所述microRNA过表达时对CKB转录本水平的抑制。发现高度转移性LvM3b细胞中CKB的表达水平受到miR-483-5p和miR-551a过表达的抑制。另外，发现内源性miR-483和miR-551a抑制内源性CKB蛋白水平。例如，发现 CKB的表达在较差转移性SW480细胞中上调，在SW480细胞中内源性 miR-483-5p和miR-551aa被LNA抑制。诱变和基于萤光素酶的报道物测定法揭示了miR-483-5p和miR-551a直接靶向CKB的3’UTR或CDS。为此，实施了CKB编码序列和3’-UTR的萤光素酶报道物测定法。发现miR-483-5p和 miR-551a分别靶向CKB的3’-UTR和编码序列中的互补区。还在突变互补区的情况下实施测定法并且至少实施3次。

实施例7

在本实施例中，实施测定法来检查CKB对于结肠癌的肝转移性定殖是否是充足和必要的。

简言之，在脾内注射有5X10⁵较差转移性SW480细胞和CKB过表达细胞的小鼠中检查肝转移。在注射后28天将小鼠安乐死并切取肝用于生物发光成像。类似地，还在脾内注射有5X10⁵高度攻击性LvM3b(表达对照发夹或靶向CKB的发夹)的小鼠中检查肝转移。如上文描述的在注射后21天将这些小鼠安乐死。

发现CKB在较差转移性SW480细胞中的过表达足以将肝转移促进超过3 倍，而转移性LS-LvM3b细胞和SW480细胞中的CKB敲低(经由每个系中的独立发夹敲低)将肝转移有力地抑制超过5倍。与miRNA的效果一致，CKB 过表达足以显著增强结肠癌细胞在肝微环境中持续存在的能力并增强其在肝中的代表性，而CKB敲低显著降低肝内持久性。为此，实施研究来检查对照SW480和CKB多表达的SW480细胞在器官型肝切片(n＝8)中的存活，和表达对照发夹或靶向CKB的发夹的LvM3b细胞的器官型切片培养物(n＝8)。在第0 天和第2天所取的图像显示CKB过表达足以显著增强癌细胞的能力。在这些测定法中，基于单侧Student’st检验发现P值低于0.001或0.0001。

为了研究CKB是否在miR-483-5p和miR-551a下游直接作用，将CKB的编码序列在过表达miR-483-5p或miR-551a的细胞中过表达。简言之，实施测定法来检查注射有过表达miR-483-5p和miR-551a的5X10⁵LvM3b细胞(有和无 CKB过表达)的小鼠中的转移性进展。通过生物发光成像监测肝转移并在注射后35天将小鼠安乐死。发现CKB的过表达足以拯救过表达miR-483-5p和 miR-551a.的细胞的受抑制肝转移性表型。相反，CKB在展现内源性miR-483-5p或miR-551a抑制的细胞中的敲低阻止了对miR-483-5p或miR-551a 抑制时看到的增强的转移效果。为此，实施测定法来检查注射有其内源性 miR-483-5p和miR-551a被LNA抑制的5X10⁵SW480细胞(有和无CKB敲低) 的小鼠中的肝转移。在28天后将小鼠安乐死并切取肝用于离体生物发光成像。上述突变性的获得功能和失去功能实验的结果和上位性分析揭示了CKB 是miR-483-5p和miR-551a的直接靶物且在结肠癌转移性进展的调控中充当这些miRNA的下游效应物。在这些测定法中，基于单侧Student’s t检验发现P 值低于0.05或0.001。

为了进一步确认CKB的作用，在小鼠肝中的对照SW480和过表达CKB的细胞中检查相对体内胱天蛋白酶活性。通过生物发光来测量活性，其使用胱天蛋白酶-3活化的DEVD-萤光素并标准化至来自常规萤光素的生物发光信号(n＝3)。还在表达对照发夹或靶向CKB的发夹、且经由脾内注射引入小鼠肝中的SW480细胞中检查类似的相对体内胱天蛋白酶-3活性。在注射后第1天、第4天和第7天测量胱天蛋白酶活性。与上述发现一致，在肝定殖的起始阶段期间CKB过表达显著降低而CKB敲低显著增强体内胱天蛋白酶-3/7活性。在这些测定法中，基于单侧Student’s t检验发现P值低于0.05或0.001。这些发现揭示了CKB是肝转移性定殖期间结肠癌存活的促进物。

实施例8

已知CKB调控组织(如脑和肾)中快速移动的高能量磷酸盐的储库，其经由催化高能量磷酸根基团从磷酸肌酸转移至ADP，从而产生ATP和肌酸。有假设认为，从磷酸肌酸CKB生成ATP可能在肝定殖期间给结肠癌细胞提供了能量优势。为了确定CKB催化的终产物ATP是否能拯救在CKB敲低时看到的转移抑制，在实验转移测定法中在注射之前将CKB敲低细胞加载ATP。简言之，在注射有有和无CKB敲低且用100uM ATP或媒介物预处理的5X10⁵ LvM3b的小鼠中检查肝转移。通过生物发光成像监测转移负担并在注射后21 天将小鼠安乐死。发现细胞的ATP加载足以将消耗CKB的细胞中受抑制的转移表型显著增强超过10倍。通过ATP的拯救是特异性的，因为ATP加载并未增强表达短发夹对照的细胞的转移性活性。

进行了类似的研究来确定肌酸和磷酸肌酸是否能拯救CKB敲低时看到的表型。更具体地，实施测定法来检查在注射有在CKB敲低的背景下用10uM 肌酸预处理的5X10⁵LvM3b的小鼠中的肝转移。然后如上文描述的在注射后第21天将小鼠安乐死并提取肝用于离体生物发光成像。还有，在注射有CKB 敲低且用10uM磷酸肌酸预处理的5X10⁵LvM3b细胞的小鼠中检查结直肠癌转移。通过生物发光成像监测肝转移并入上文描述的将小鼠安乐死。发现肌酸和磷酸肌酸均拯救转移抑制。

为了研究结肠癌转移是否能通过阻断肌酸运输到结肠癌细胞中来抑制，在LvM3b细胞中通过表达靶向SLC6a8的短发夹来抑制肌酸运输通道 SLC6a8。以与上文描述的相同的方式来检查LvM3b细胞的肝转移。发现肌酸运输通道SLC6a8的敲低抑制结肠癌转移。这些发现揭示结肠癌细胞在肝定殖期间依赖于CKB生成的ATP来存活。

实施例9

为了确定控制结肠癌转移性进展的这一协同性miRNA调控网络是否具有人病理相关性，在自MSKCC的患者获得的一组67份原发性结肠癌以及肝转移中分析miR-483-5p和miR-551a的表达水平。更具体地，通过定量实时PCR 来对37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中的miR-483-5p和miR-551a水平定量。与这些miRNA在转移性进展期间的转移抑制性作用一致，miR-483 和miR-551a两者均展现出在人肝转移中相对于原发性结肠癌的显著降低的表达水平(图1A；对于miR-483-5p为p<0.05而对于miR-551a为p<0.05；N＝67)。

还在37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中通过定量实时PCR来检查CKB表达水平。重要地，发现CKB表达在肝转移中相对于原发性结肠癌显著升高(p<0.05)且其表达与所述miRNA显著逆相关—与这些miRNA在人结肠癌中对其直接靶向一致(图1B)。这些发现与揭示CKB蛋白在晚期癌症中的升高水平的先前临床组织学分析一致。

实施例10

在本实施例中，实施测定法来研究靶向该miRNA调控网络的治疗潜力。为此，用较高数目(500k)的高度转移性LvM3a细胞注射小鼠并在24小时后用单静脉内剂量的、从单一转录本表达miR-483-5p和miR-551a的腺病毒相关病毒(AAV)注射小鼠。发现投递两种miRNA的单治疗剂量的腺伴随病毒(AAV) 将转移性定殖急剧且显著降低超过5倍(图1C)。

最后，实施测定法来确定CKB的小分子抑制和肌酸可获性限制对于结肠癌转移的影响。环肌酸(类似于磷酸肌酸)是针对肌酸激酶的转换态类似物。为了检查环肌酸的效果，在注射有5X10⁵LvM3b细胞并用环肌酸每日治疗达两周的小鼠中实施对肝转移的生物发光测量。然后，在治疗结束时将小鼠安乐死并切取肝用于离体成像。发现尽管环肌酸是CKB的较差抑制剂(5000uM ki)，但用环肌酸治疗小鼠显著降低了转移性定殖且证明比目前的标准医护 FOLFOX化疗更好(图1D)。

使用肌酸转运体抑制剂beta-胍基丙酸(B-GPA)来实施类似的测定法。利用生物发光测量来检查注射有5X10⁵LvM3b细胞且用B-GPA每日治疗达两周的小鼠中的肝转移。发现将小鼠用肌酸运输通道的这一竞争性抑制剂治疗也显著降低了转移性定殖(图1E)。

使用系统性办法，两种miRNA被鉴定为充当结肠癌细胞的肝转移性定殖的抑制剂。发现这些miRNA会聚性靶向CKB—赋予遇到肝缺氧的细胞从磷酸肌酸储库生成ATP的能力的一个关键基因。使用4种独立的治疗物(比目前的临床标准医护更有效，且展现出没有明显的毒性)对该途径的成功靶向表明了靶向该途径的治疗在人结肠癌中的前景。上文描述的组合的体内选择/基因筛选办法(称为经由器官内串联选择对人基因的多基因筛选(MUlti-Gene Screening of Human genes through intra-Organ Tandem Selection)(MUGSHOTS))有效地鉴定了结肠癌的肝定殖和转移中的有力和经病理学验证的调控物，且具有发现任意癌症类型在任意器官的转移性定殖中的编码和非编码调控物的潜力。

实施例11

在本实施例中，实施测定法来确认通过施用小分子B-GPA(其为SLC6a8 的抑制剂)靶向肌酸运输通道SLC6a8的治疗潜力。如上文描述的，对注射有 LvM3b结肠癌细胞的小鼠施用B-GPA在治疗两周后引起对结肠癌转移至肝的抑制(图1E)。为了确认该治疗效果，将注射有LvM3b结肠癌细胞的小鼠用 B-GPA或对照媒介物(PBS)经由腹膜内注射每日处理达3周(图2)。在3周时将小鼠安乐死并提取肝用于生物发光成像和大体组织学。

发现用B-GPA每日治疗导致结肠癌转移至肝的显著降低，如通过体内小鼠的体内生物发光成像、对提取的肝的生物发光成像、和通过对来自经治疗小鼠的提取肝的大体解剖学检查评估的(图2)。更具体地，通过生物发光成像测量的对照组(没有B-GPA治疗)和治疗组的平均光子通量比分别为约800 和100。发现基于单侧Student’s t检验的P值为低于0.05。

实施例12

在本实施例中，实施测定法来估测用靶向SLC6a8的shRNA敲低来靶向肌酸运输通道SLC6a8的治疗益处。

简言之，用表达靶向肌酸运输通道SLC6a8的两种独立的短发夹RNA (shSLC6a8#4或shSLC6a8#5)中任一的LvM3b结肠癌细胞或对照RNA(空 pLKO载体，购自Sigma Aldrich)来注射小鼠(图3A)。同样，通过生物发光成像来监测肝转移并在接种癌细胞后3周将小鼠安乐死。提取肝用于大体组织学。发现将SLC6a8用两种独立的shRNA敲低导致对结肠癌转移的抑制(图 3A)。

为了进一步确认敲低SLC6a8的治疗益处，将表达靶向SLC6a8 (shSLC6a8#2)的短发夹RNA的另一独立的结肠癌细胞系(SW480结肠癌细胞系)注射到小鼠中(图3B)。发现SLC6a8敲低显著抑制SW480结肠癌细胞的转移(图3B)。

最后，在胰腺癌细胞中研究靶向SLC6a8的治疗益处。为了完成该目的，将表达靶向SLC6a8(shSLC6a8#5)的shRNA或对照RNA(空pLKO载体)的 PANC1胰腺癌细胞注射到小鼠中。通过生物发光成像监测转移性进展并以与上文所述相同的方式将小鼠安乐死。发现在28天时，在用靶向SLC6a8的 shRNA处理的细胞中在胰腺癌转移中有显著降低，从而揭示了SLC6a8是用于胰腺癌的治疗靶物。

实施例13

在本实施例中，研究了肌酸转运体SLC6a8在人结肠癌肿瘤中的表达是否与转移性进展相关。

为了完成这一点，使用定量实时PCR来量化SLC6a8在36份原发性结肠癌肿瘤和30份转移性结肠癌肿瘤中的表达(图4)。实际上，SLC6a8的表达在转移性肿瘤中(约1.3)比在原发性肿瘤中(约0.5)显著更高，进一步确证了SLC6a8 在转移中的枢纽作用(图4)。发现基于单侧Student’s t检验的P值为低于0.05。

实施例14

如上文描述的，显示用shRNA介导的敲低对肌酸转运体SLC6a8的抑制导致对两种结肠癌以及胰腺癌的转移的抑制。还显示用小分子抑制剂B-GPA抑制SLC6a8在体内产生对结肠癌转移的治疗益处。为了估测B-GPA治疗是否在胰腺癌治疗中产生治疗益处，在小鼠中体内评估B-GPA治疗抑制人胰腺癌细胞存活的能力。

简言之，将PANC1胰腺癌细胞在有和无10mM B-GPA存在的情况下温育 48小时，然后注射到免疫缺陷性小鼠中(每只小鼠5x10⁵ PANC1细胞；治疗分组和不治疗分组中各4只小鼠)。在注射后1天将小鼠用生物发光成像并将信号标准至第0天。早在注射后1天就观察到治疗益处，如通过生物发光成像(图 5)评估的在体内胰腺癌细胞的肿瘤负担中有显著降低，显示了B-GPA治疗对于胰腺癌的治疗益处。更具体地，通过生物发光成像测量的对照组(没有 B-GPA治疗)和治疗组的平均光子通量比分别为约2.7和1.6。发现基于单侧Student’s t检验的P值为低于0.05。

实施例15

上述实施例展示单独的B-GPA治疗差生针对结肠癌和胰腺癌的治疗益处。在本实施例中，研究了B-GPA治疗是否能增强化疗剂5’-氟尿嘧啶和吉西他滨的治疗活性。为了实现该目的，实施细胞活力测定法来比较单独的5’- 氟尿嘧啶或吉西他滨相比于与B-GPA的组合疗法的细胞毒性活性。

简言之，将10 000PANC1细胞一式三份接种于96孔板中并用多个浓度的吉西他滨(1nm,10nm,100nm,1000nm,10000nm,100000nm,和1000000 nm)在有或无10mM B-GPA的情况下处理48小时。然后使用WST-1试剂 (Roche Applied Science)测定细胞活力，将在440nm处的吸光度作为活细胞数的指示物。如图6中显示的，发现添加治疗浓度的B-GPA增强了吉西他滨对 PANC1胰腺癌细胞的细胞毒性活性，如通过使用WST-1试剂的细胞活力测定法评估的。

类似地，添加治疗浓度的B-GPA增强了5’-氟尿嘧啶对Ls-LvM3b结肠癌细胞的细胞毒性活性。为此，将10,000Ls-LvM3b细胞一式三份接种于96孔板中并用多个浓度的5’-氟尿嘧啶在有或无10mM B-GPA的情况下处理48小时。以与上述相同的方式测定细胞活力，将在440nm处的吸光度作为活细胞数的指示物。如图7中显示的，这些结果显示B-GPA增强了常见使用的化疗剂对于结直肠癌和胰腺癌治疗的治疗活性。

前述实施例和对优选实施方案的描述应视为例示性的，而不是限制本发明由权利要求限定的范围。如将容易领会的，可利用上述特征的众多变体和组合而不背离如由权利要求所述的本发明。这类变化不视作背离本发明的范围，且所有这类变化均意图包括在所附权利要求的范围中。本文中引用的所有参考内容均通过提述完整并入本文。

序列表

<110> 洛克菲勒大学

<120> 结肠癌的治疗和诊断

<130> 070413.20370

<140> PCT/US13/67860

<141> 2013-10-31

<150> 61/720,912

<151> 2012-10-31

<150> 61/786,500

<151> 2013-03-15

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

gaagacggga ggaaagaagg gag 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 2

gacccactct tggtttcca 19

<210> 3

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 3

gagggggaag acgggaggaa agaagggagt ggttccatca cgcctcctca ctcctctcct 60

cccgtcttct cctctc 76

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 4

ggggactgcc gggtgaccct ggaaatccag agtgggtggg gccagtctga ccgtttctag 60

gcgacccact cttggtttcc agggttgccc tggaaa 96

<210> 5

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成 miR-483-5p

<400> 5

cctgccccat ttgggggtag gaagtggcac tgcagggcct ggtgccagcc agtccttgcc 60

cagggagaag cttccctgca ccaggctttc ctgagaggag gggagggcca agcccccact 120

tgggggaccc ccgtgatggg gctcctgctc cctcctccgg ctgatggcac ctgccctttg 180

gcaccccaag gtggagcccc cagcgacctt ccccttccag ctgagcattg ctgtggggga 240

gagggggaag acgggaggaa agaagggagt ggttccatca cgcctcctca ctcctctcct 300

cccgtcttct cctctcctgc ccttgtctcc ctgtctcagc agctccaggg gtggtgtggg 360

cccctccagc ctcctaggtg gtgccaggcc agagtccaag ctcagggaca gcagtccctc 420

ctgtgggggc ccctgaactg ggctcacatc ccacacattt tccaaaccac tcccattgtg 480

agcctttggt cctggtggtg tccctctggt tgtgggacca agagcttgtg cccatttttc 540

atctgaggaa ggaggcagc 559

<210> 6

<211> 490

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成 miR-551a

<400> 6

ggagaacctt cagcttcatg tgacccagag actcctgtat gcctggctct gggagtacag 60

aagggcctag agctgacccc tgccctccga agcccctggg gcactagatg gatgtgtgcc 120

agagggtagt agaggcctgg gggtagagcc cagcaccccc ttcgcgtaga gacctggggg 180

accagccagc ccagcaaccc cctcgcggcc gacgcctgag gctgttcctg gctgctccgg 240

tggctgccag aggggactgc cgggtgaccc tggaaatcca gagtgggtgg ggccagtctg 300

accgtttcta ggcgacccac tcttggtttc cagggttgcc ctggaaacca cagatgggga 360

ggggttgatg gcacccagcc tcccccaagc ctgggaaggg accccggatc cccagagcct 420

ttccctgcct atggagcgtt tctcttggag aacagggggg cctctcagcc cctcaatgca 480

agttgctgag 490

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 7

gacccacucu ugguuucca 19

<210> 8

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 8

ggggacugcc gggugacccu ggaaauccag aguggguggg gccagucuga ccguuucuag 60

gcgacccacu cuugguuucc aggguugccc uggaaa 96

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 9

gaagacggga ggaaagaagg gag 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 10

gaagacggga ggaaagaagg gag 23

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 11

ccggcccaga ttgaaactct cttcactcga gtgaagagag tttcaatctg ggttttt 57

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 12

ccggccgcgg tatctggcac aatgactcga gtcattgtgc cagataccgc ggttttttg 59

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 13

ccggcttatt ccctacgtcc tgatcctcga ggatcaggac gtagggaata agtttttg 58

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 14

ccggattacc tggtcaagtc ctttactcga gtaaaggact tgaccaggta attttttg 58

<210> 15

<211> 57

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 15

ccggcccaga uugaaacucu cuucacucga gugaagagag uuucaaucug gguuuuu 57

<210> 16

<211> 59

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 16

ccggccgcgg uaucuggcac aaugacucga gucauugugc cagauaccgc gguuuuuug 59

<210> 17

<211> 58

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 17

ccggcuuauu cccuacgucc ugauccucga ggaucaggac guagggaaua aguuuuug 58

<210> 18

<211> 58

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 18

ccggauuacc uggucaaguc cuuuacucga guaaaggacu ugaccaggua auuuuuug 58

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 19

ccgggctggt ctacaacaac acctactcga gtaggtgttg ttgtagacca gctttttg 58

<210> 20

<211> 58

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 20

ccgggcuggu cuacaacaac accuacucga guagguguug uuguagacca gcuuuuug 58

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成正向引物

<400> 21

ggcagctaca accgcttcaa ca 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成反向引物

<400> 22

caggatggag aagaccacga ag 22

Claims

1.β-胍基丙酸在制备用于在有此需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中所述受试者具有比正常人更高的肌酸激酶脑型(CKB)或SLC6a8基因表达或活性水平，其中所述β-胍基丙酸为降低CKB或SLC6a8的基因表达或活性水平用于治疗所述癌症的治疗有效量，其中所述癌症是选自下组的一种：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、胆囊癌、肉瘤癌和黑色素瘤。

2.权利要求1的用途，其中所述癌症是转移性的。

3.权利要求1的用途，其中所述癌症选自下组：胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、胆囊癌和肉瘤癌。

4.权利要求1的用途，其中所述癌症是胰腺癌。

5.权利要求1的用途，其中所述受试者中的CKB比正常人高。

6.权利要求5的用途，其中所述受试者中的CKB高至少约10％。

7.权利要求1的用途，其中所述癌症是胃癌。

8.权利要求1的用途，其中所述药物进一步包含另外的治疗剂。

9.权利要求8的用途，其中所述另外的治疗剂选自下组：5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、卡培他滨、吉西他滨、西妥昔单抗、紫杉醇、阿伐斯汀、亚叶酸(leucovorin)、Regorafenib、Zaltrap、拓扑异构酶I抑制剂、NKTR-102、Tivantinib、PX-866、索拉非尼、Linifanib、Telatinib、XL281(BMS-908662)、Robatumumab和IGF1-R抑制剂。

10.权利要求8的用途，其中所述另外的治疗剂是吉西他滨。

11.编码miR-483-5p或miR-551a的核酸在制备用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌的药物中的用途，其中所述受试者具有比正常人更高的CKB表达水平，所述治疗包括提高所述受试者中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平。

12.权利要求11的用途，其中所述结肠癌是转移性的。

13.权利要求11的用途，其中所述核酸是寡核苷酸。

14.权利要求13的用途，其中所述寡核苷酸是合成的核酸。

15.权利要求11的用途，其中所述核酸在载体中。

16.权利要求15的用途，其中所述载体选自下组：质粒、病毒、粘粒和人工染色体。

17.权利要求16的用途，其中所述病毒是腺相关病毒(AAV)或痘病毒。

18.权利要求13-17中任一项的用途，其中所述药物进一步包括另外的治疗剂。

19.权利要求13-17中任一项的用途，其中所述核酸包含SEQ ID NO:1-10中任一个或其互补体的序列。

20.用于测量选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平的试剂在制备用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于包括以下的方法：

从所述受试者获得样品；

将该表达水平与预确定的参照值比较；

21.用于测量选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平的试剂在制备用于确定受试者是否具有或有风险具有转移性结肠癌复发的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于包括以下的方法：

从所述受试者获得样品；

22.用于测量选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平的试剂在制备用于确定受试者是否具有或有风险具有对靶向疗法的化疗剂有抗性的转移性结肠癌复发的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于包括以下的方法：

从所述受试者获得样品；

将该表达水平与预确定的参照值比较，

23.权利要求20-22中任一项的用途，其中所述预确定的参照值获自没有转移性结肠癌的对照受试者。

24.权利要求20-22中任一项的用途，其中所述样品是体液样品。

25.权利要求20-22中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤样品。

26.一种阵列，其包含(i)具有多个独特位置的支持物，和(ii)具有编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物的序列的至少一种核酸的任意组合，其中每个核酸被固定化于所述支持物的独特位置。

27.一种用于诊断和治疗受试者中结肠癌的转移潜力的试剂盒，其包含特异性结合miR-483-5p、miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物的试剂，以及β-胍基丙酸。