CN114173835A - 含有抗坏血酸的可注射式水性植入物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：一种用于口腔组织再生的可注射式水性植入物制剂，其已通过伽马射线或X射线辐照灭菌，并可通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过60N的力挤出，该制剂包含25w/w％至45w/w％的通过筛分确定尺寸为50至200pm的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，所述制剂含有至少0.05％(w/w)的抗坏血酸；以及用于制备上述可注射式水性植入物制剂的方法。

Description

含有抗坏血酸的可注射式水性植入物制剂
技术领域
本发明涉及一种含有抗坏血酸的新型可注射式水性植入物制剂及用于制备新型可注射式水性植入物制剂的方法。
背景技术
牙周病的风险因素有很多，如口腔卫生不良、吸烟、糖尿病、肥胖、遗传倾向、年龄和社会经济状况，这些因素促进细菌积聚、生物膜形成和牙龈沟感染，从而形成牙龈炎或齿龈炎。如果不治疗，炎症会沿着牙根发展，导致PDL和周围牙槽骨的破坏，进而被称为牙周炎。随着牙周病的进展，牙齿和软组织之间会形成囊袋，囊袋继续生长，直到牙齿失去稳定性并可能脱落。牙周病的临床症状包括软组织炎症、(组织)探测出血，可能伴有化脓和牙槽骨的放射丢失。牙医可以使用探针测量牙周囊袋的深度，即软组织或骨与牙齿之间的深度(称为临床(牙齿)附着丧失)，从而确定牙周病的存在和程度。
引导组织再生(GTR)是治疗牙周结构缺失的一种广泛应用的外科手术方法。在该手术中，牙周病医师通过切开软组织来抬起皮瓣，从而接近病根和周围的骨骼。下一步是使用合适的手动器械、超声波或激光装置对病变骨、软组织和牙根表面进行清创，去除病变组织，并对根表面进行刮除和刨平。清创术后，较大的骨缺损用骨再生材料填充。如EP-B1-1676592中所述的购自Geistlich Pharma AG的引导组织再生屏障被放置在深层骨缺损的骨再生材料上。牙周病医师用适当的缝线缝合皮瓣。然后，对牙龈、上皮附着体、骨以及骨与牙之间的牙周附着体进行改造。虽然这一手术是有效的，但牙龈切口会引起患者不适、疼痛、肿胀、牙龈退缩、牙齿敏感、愈合时间长，并增加再次感染的可能性。
许多天然和合成材料及组合物已被用作骨缺损部位的骨再生材料。
一种公知的天然骨传导骨替代材料(可促进牙周骨缺损中的骨生长)是购自Geistlich Pharma AG的Geistlich
Figure BDA0003403731420000011
该材料通过美国专利5,167,961号和5,417,975号中所述的方法由天然骨制成，该材料能够保存天然骨的小梁结构和纳米结晶体结构，从而形成不会或非常缓慢被再吸收的良好的骨传导基质。
为了减少与牙龈切口相关的上述缺陷，需要一种可注射式植入物制剂。
为注射到牙周囊袋中时便于患者接受，并使用注射器方便地手动注射，可注射式水性植入物制剂应可通过直径不大于18#(内径0.838mm)的套管或针的套管挤出，优选使用不超过60N的力。
为了实现最佳口腔组织再生，为了牙槽骨、牙根牙骨质或牙周膜的再生，理想的是注射的植入物制剂提供接近发生此类再生的自然体内环境的羟基磷灰石和胶原的基质。
源自天然骨的羟基磷灰石比合成(非生物)羟基磷灰石或陶瓷更接近发生再生的自然体内环境。
通过研磨源自天然骨的羟基磷灰石获得的颗粒比研磨合成羟基磷灰石或陶瓷获得的圆形颗粒具有更不规则的纵向形状：因此，其具有更高的堵塞18#套管的风险。参见图5，左侧表示源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的扫描电子显微照片(SEM)，右侧表示合成β-TCP颗粒的SEM。因此，通过套管挤出含有合成羟基磷灰石或陶瓷颗粒的制剂的结果只能部分预测含有源自天然骨的羟基磷灰石颗粒的类似制剂的挤出。
人类天然骨的一个重要特征是羟基磷灰石晶体的形态和非常小的尺寸(纳米尺寸)，对于人骨矿物而言，羟基磷灰石晶体是：六角晶系空间群P63/m，长度为约30nm至50nm(c轴：[0,0,1])，长度为14nm至25nm(a和b轴：[1,0,0]和[0,1,0])。参见Weiner,S.等人，1992,FASEB,6:879-885。为了更接近发生再生的自然环境，因此，理想的是使用源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒，晶体的形态和大小优选接近人类天然骨。
US2012/0107401描述了流动性可植入骨传导基质，其包含0.1mm至2mm的陶瓷(例如合成羟基磷灰石和β-TCP)或源自天然骨的羟基磷灰石的矿物颗粒、可为源自人类或动物来源的可溶性胶原或不溶性胶原的胶原以及治疗剂(包括他汀类)的混合物。这些流动性可植入骨传导性基质被教导适合作为可注射、喷涂或滴注到目标组织部位的油灰或凝胶。陶瓷与胶原的重量比被教导为0.15至22.5(权利要求4)或1.5至11.5(权利要求5)，所公开的陶瓷与胶原的唯一特定比为5和4.83(权利要求2和[0089]、[0090])。
美国专利7,322,825号公开了一种治疗牙周病的方法，该方法是将一种组合物注射到牙周囊袋中，所述组合物是尺寸为50μm至400μm的微晶羟基磷灰石细磨骨颗粒和直径为小于1mm的“游离胶原”颗粒的混合物，这些“游离胶原”颗粒被教导为非交联胶原小纤维或含有原纤维胶原和任选地生理相容增稠剂的凝胶。在通过加热(例如通过微波辐照)进行额外能量注入后，该混合物的粘度仅足以通过18#(内径0.838mm)的针。根据该专利，交联胶原(如Avitene或Collastat)不能切割成小到足以通过18#针的碎片。对于具体描述的组合物，羟基磷灰石与胶原的重量比为0.5至1.5。
美国专利7'322'825号的牙周病治疗方法尚不满足广泛应用。非交联胶原(如“游离胶原”)远不是口腔组织再生、牙槽骨、牙骨质根或牙周膜再生所需的自然体内环境。
美国专利5'352'715号公开了一种用于软组织和硬组织修复和增强的可注射式陶瓷制剂，其包含药学上可接受的流体载体中的胶原和磷酸钙陶瓷颗粒，其中磷酸钙陶瓷颗粒的尺寸为50μm至250μm，磷酸盐陶瓷颗粒与胶原的重量比为1/19至1/1，优选为1/4至1/2。根据该专利的教导，磷酸钙陶瓷颗粒优选非生物(合成)来源的烧结陶瓷颗粒，并且胶原基本上不存在交联，即剥除端肽，优选胶原为纯化的无端肽重组胶原。该可注射陶瓷制剂可通过20#(内径0.603毫米)针。
剥除端肽的胶原与合成磷酸钙颗粒的组合远不是发生再生的自然体内环境。
EP-0270254-A2公开了一种干燥植入物组合物，该组合物包含2重量％至40重量％的基本上不存在交联的重组原纤维无端肽胶原和60重量％至98重量％的尺寸为100μm至2000μm的磷酸三钙(例如羟基磷灰石)的混合物(不含水)，因此，磷酸三钙与无端肽胶原的质量比为1.5至49。该干燥植入物组合物经伽马辐照处理以改进生物和处理特性。
剥除端肽的胶原与合成磷酸三钙颗粒的组合远不是发生再生的自然体内环境。
国际PCT专利申请WO-2019/115795发明的问题或目标是找到可用于制备用于口腔组织再生，特别是牙槽骨、牙骨质根或PDL再生的可注射式水性植入物制剂的干燥植入物组合物，该可注射式水性植入物制剂可通过锥形系统和18#套管挤出，且不具有现有技术植入物制剂的缺点。
通过改变制备方法、超过300种干燥植入物组合物(包含源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和天然交联纤维胶原)原型中的成分和成分比例，并使通过再水化和均匀混合干燥植入物组合物获得的制剂经历使用18#套管的挤出试验(如实施例9所述)，发明人已发现这些干燥的植入物组合物的特征，其使再水化和均匀混合的水性植入物制剂通过锥形系统和18#套管而意外地提供可挤出性，后者提供接近发生再生的自然环境的基质。
上述目标通过国际PCT专利申请WO-2019/115795的权利要求中定义的发明实现。
该专利申请的发明涉及：
-一种干燥植入物组合物，其基本上由源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒(通过筛分确定尺寸为50μm至200μm)和通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物组成，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，
-该干燥植入物组合物用于制备可通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管挤出的可注射式水性植入物制剂(用于口腔组织再生)的用途，其中通过将25w/w％至45w/w％的上述干燥植入物组合物用药学上可接受的水性载体再水化和均匀混合进行制备，和
-用于口腔组织再生的可注射式水性植入物制剂，其可通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过60N的力挤出的，其包含用无菌水或无菌等渗盐水溶液再水化并均匀混合的25w/w％至45w/w％的上述干燥植入物组合物。
术语“基本上由……的混合物组成”是指非常高比例(通常至少99重量％)的干燥植入物由所述混合物和至多6％的矿物盐(例如氯化钠)组成，通常干燥植入物的至多1重量％的其他成分源自天然来源，且不会显著影响可注射式水性植入物制剂的挤出行为。这些成分可能是脂肪、硫酸灰分、葡萄糖胺、半乳糖胺和极少量的残余蛋白质部分，如骨膜素、饰胶蛋白聚糖(decorine)和基膜聚糖或类似的蛋白质。其他成分不包括任何合成聚合物、任何聚环氧乙烷、任何聚环氧丙烷或任何合成润滑剂。其他成分不包括任何他汀类或任何人工羟基磷灰石，即非生物来源的羟基磷灰石。
“源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒”是通过能够保存天然骨的纳米结晶结构的过程源自天然骨的颗粒。这一过程必须在足够低的温度下进行，以确保天然骨的矿物部分不会再结晶，通常温度不超过700℃。
美国专利5,167,961或5,417,975号中公开了一种合适的此类工艺：其包括通过氨水加热降解脱脂骨中的有机物，通过用低于60℃温度的流动水洗涤来提取溶解的降解产物，并在250℃至600℃温度的空气中处理骨矿物，以便例如能够保存天然骨的小梁结构和纳米结晶结构，提供具有非常低的有机杂质或蛋白质含量的纳米结晶羟基磷灰石。通过研磨和筛分上述纳米结晶羟基磷灰石，可获得源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒。
源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒也可以方便地通过研磨和筛分Geistlich
Figure BDA0003403731420000051
Small Granules(购自Geistlich Pharma AG，CH-6110，Switzerland)获得。
适于并入本发明组合物中的“源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒”通过筛分确定的尺寸为50μm至200μm。
实际上，当源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的尺寸超过200μm时，通过再水化和均匀混合获得的植入物制剂往往会堵塞18#(内径0.838mm)的注射器套管，且当源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的尺寸低于50μm时，这些小颗粒物引起炎症的风险增加。
因此，50μm至200μm的范围尺寸(通过筛分确定，参见实施例1)至关重要。
优选的是，源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的尺寸为100μm至180μm(通过筛分确定，参见实施例1)。于是炎症或堵塞的风险降至最低。
术语“天然交联纤维胶原材料”指通过允许保留其端肽结构及其天然交联的大部分的工艺而源自天然组织材料的纤维胶原材料。此类天然交联纤维胶原材料为未经任何酶处理、任何化学交联或任何物理交联(例如通过脱氢热处理DHT、紫外线照射等)的不溶性胶原材料。实际上，任何一种后面的处理都可能显著改变天然组织材料中存在的端肽结构和/或天然交联。
天然交联纤维胶原材料适宜源自含有50w/w％至100w/w％胶原和0w/w％至50w/w％弹性蛋白、优选70w/w％至95w/w％和5w/w％至30w/w％弹性蛋白的天然来源组织，根据涉及水解和RP-HPLC的已知方法的修改，通过锁链素/异锁链素测定进行测量(例如，参见Guida E.等人，1990Development and validation of a high performancechromatography method for the determination of desmosines in tissues，于Journal of Chromatography中或Rodriguqe P 2008Quantification of Mouse LungElastin During Prenatal Development，于The Open Respiratory Medicine Journal中)。此类组织的实例包括脊椎动物，特别是哺乳动物(例如猪、牛、马、绵羊、山羊、兔)腹膜或心包膜、胎盘膜、小肠粘膜下层(SIS)和真皮。此类组织优选猪、牛或马。感兴趣的组织是猪、牛或马的腹膜和真皮。
优选的是，天然交联纤维胶原材料选自由猪真皮和猪腹膜或心包膜组成的组。
通常，胶原主要是I型胶原、III型胶原或其混合物。胶原还可包括一定比例的特别是II型、IV型、VI型或VIII型胶原，或这些或任何胶原类型的任何组合。
通常，天然交联纤维胶原材料含有50w/w％至100w/w％的胶原和0w/w％至50w/w％的弹性蛋白，优选70w/w％至95w/w％和5w/w％至30％w/w的弹性蛋白。
源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是来自通过类似于EP-B1-1676592的“实施例”中所述方法制备的猪、牛或马的腹膜或心包膜的胶原膜，该方法包括碱处理、酸处理和有机溶剂处理，然后切成通过0.5mm筛的碎片。
另一种源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是Geistlich
Figure BDA0003403731420000061
(购自Geistlich Pharma AG)，其已被切成通过0.5mm筛的碎片。
另一种源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是通过类似于EP-B1-2654816实施例7所述的方法制备的猪真皮，该方法包括碱处理、酸处理、冷冻干燥和有机溶剂洗涤，然后切成通过0.5mm筛的碎片。
感兴趣的是，天然交联纤维胶原材料包括成熟的胶原纤维，其显示出三重螺旋性，如圆二色光谱所示。这种纤维确实形成了一种支架，其有利于口腔组织再生细胞，特别是骨再生细胞和PDL再生细胞的定植。
天然交联纤维胶原材料必须以通过0.5mm筛的碎片的形式存在。此类碎片通常通过包括离心研磨和胶原碎片筛分的过程研磨天然交联纤维胶原获得。
以通过0.5mm筛的碎片形式存在的天然交联纤维胶原材料的特点对于通过锥形系统和18#(0.838mm内径)套管的挤出至关重要。实际上，如对许多原型进行的试验所示，当在干燥的植入物组合物中使用天然交联材料的较大碎片，例如通过0.6mm或0.7mm筛的碎片时，通过对干燥的植入物组合物进行再水化和均匀混合获得的植入物制剂存在堵塞18#套管的重大风险。
纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比是通过锥形系统和18#(内径0.838mm)套管挤出的另一个关键参数。
实际上，如对许多原型进行的试验所示，当纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比低于1.8或高于4.5时，通过再水化和均匀混合获得的植入物制剂不容易注射，通过锥形系统和18#(0.838mm内径)套管挤出所需的力太高。这是一个意想不到的结果，对此似乎没有直接的解释。挤出所需的力从1.8至1.5急剧增加，但从4.5至6适度增加。然而，如对许多原型进行的试验所示，当比率大于4.5(例如5)时，挤出植入物制剂所需力的再现性不够。只有当纳米结晶羟基磷灰石与胶原的比率为1.8至4.5时，才能获得商用植入物产品所需的高再现性。
因此，纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比的范围为1.8至4.5至关重要。
优选的是，纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.5至4.2。在该范围内，挤出所需的力通常较小。
更优选的是，纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.5至4.0。实际上发现，对于纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比的可注射式水性植入物制剂，在较小的力下挤出结果的再现性最高。
为了增强可注射式水性植入物制剂的可挤出性，适宜使用通常的灭菌辐照剂量(通常为27kGy至33kGy)通过伽马射线或X射线辐照对干燥植入物组合物进行灭菌。这种处理实际上会破坏天然交联纤维胶原中的某些键，从而有利于其流动性和可挤出性。
术语“可注射式水性植入物制剂”是指通过将25w/w％至45w/w％的干燥植入物组合物与药学上可接受的水性载体再水化并均匀混合而制备的植入物制剂，其能够方便地注射到人体或动物体内进行口腔组织再生，特别是牙周囊袋内，可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管挤出。
通常，可注射式水性植入物制剂可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过60N的力挤出。
通常，药学上可接受的水性载体是无菌水、无菌等渗盐水溶液、血液或其馏分，通常是患者自身的血液。
可注射式水性植入物制剂优选通过将25w/w％至45w/w％的干燥植入物组合物、更优选30w/w％至40w/w％的干燥植入物组合物与无菌水、无菌等渗盐水溶液或血液再水化和均匀混合来获得。当使用该量的干燥植入物组合物时，可注射式水性植入物制剂是一种可通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过60N的力从注射器中挤出的新制剂。
当通过将30w/w％至40w/w％的以上定义的干燥植入物组合物与无菌水或无菌等渗盐水溶液再水化和均匀混合获得可注射式水性植入物制剂时，通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管挤出可注射式水性植入物制剂所需的力低于40N，优选低于20N。
当可注射式水性植入物制剂通过将30w/w％至40w/w％的以上定义的干燥植入物组合物与血液的再水化和均匀混合获得时，挤出可注射式水性植入物制剂(包含在药学上可接受的载体中的30w/w％至40w/w％的干燥植入物组合物)所需的力低于45N，优选低于25N。
国际PCT专利申请WO-2019/115795的发明中使用的干燥植入物组合物可通过包括以下步骤的方法制备：
(a)提供源自天然骨的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒，
(b)通过包括碱处理、酸处理和有机溶剂处理的工艺制备研磨天然交联纤维胶原材料，并切成通过0.5mm筛的碎片，
(c)将(b)中获得的研磨天然交联纤维胶原混合物添加到水溶液中，剧烈搅拌以获得胶原浆料，添加(a)中制备的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒并剧烈搅拌，pH保持为4.2至7.5，
(d)干燥(c)中获得的含有纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原的混合组合物，并且
(e)通过伽马射线或X射线的辐照对(d)中获得的干燥植入物组合物进行灭菌。
如上所述，源自天然骨的陶瓷纳米结晶羟基磷灰石颗粒是通过能够保存天然骨的纳米结晶结构的方法而源自天然骨的颗粒。
通过上述方法获得的高纯度骨矿物可研磨和筛分，以具有所需的尺寸。
作为选择，可使用研磨和筛分步骤由Geistlich Bio
Figure BDA0003403731420000081
(购自GeistlichPharma AG)生产具有所需尺寸的源自天然骨的陶瓷颗粒。
步骤(b)的研磨天然交联纤维胶原可通过类似于EP-B1-2654815实施例7所述的方法制备，该方法包括在水中将猪、牛、马、山羊或兔皮研磨成0.5mm至30mm的碎片；使用水溶性溶剂(如醇或酮)去除水分；使用氯化烃(如二氯乙烷或二氯甲烷)或非氯化烃(如己烷或甲苯)脱脂；用pH值高于12.0的强无机碱和pH值为0至1的强无机酸处理胶原；冷冻干燥并清洁海绵中的干胶原纤维(由诸如醇、醚、酮和氯化烃等有机溶剂获得)；在真空下去除溶剂；并通过涉及离心式磨机和胶原碎片筛分的步骤进一步将清洁的胶原海绵切成通过0.5mm筛的碎片。
步骤(b)的研磨天然交联纤维胶原也可通过类似于EP-B1-1676592中所述的方法制备，该方法包括通过机械处理猪、牛、马的腹膜或心肌膜以去除肉和油脂；用水洗涤；用1％至5％的氢氧化钠溶液处理；用水洗涤；用0.2％至0.8％的盐酸酸化；用水洗涤直至pH为3.5；用NaHCO3溶液中和；用水洗涤；使用水溶性溶剂(如醇或酮)脱水；使用烃(如己烷)脱脂；并通过涉及离心式磨机和胶原碎片筛分的步骤进一步将清洁的胶原膜切成通过0.5mm筛的碎片。
在步骤(c)中，将步骤(b)中制备的研磨天然交联纤维胶原添加至水溶液中并剧烈混合，以获得胶原浆料，然后将步骤(a)中制备的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒添加至胶原浆料中并与之剧烈混合。
通常，步骤(c)中测得的pH为4.2至7.5，优选4.5至7.5。
步骤(d)通常包括通过冷冻干燥或空气干燥(优选在减压下)干燥(c)中获得的含有纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原的混合组合物。
步骤(b)中获得的干燥植入物组合物的含水量通常为3％至7％，通过卡尔·费歇尔滴定法(Karl Fischer titration)测定。
步骤(d)之后可选地是步骤(e)，即通过伽马射线或X射线辐照灭菌，通常，使用通常的辐照剂量进行灭菌，通常为27kGy至33kGy。
发明国际PCT专利申请WO-2019/115795进一步涉及一种用于口腔组织再生的新型可注射式水性植入物制剂，该可注射式水性植入物制剂可通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过60N的力挤出，其包含25w/w％至45w/w％的上述干燥植入物组合物，其用无菌水或无菌等渗盐水溶液再水化并均匀混合。
当可注射式水性植入物制剂包含30w/w％至40w/w％的上述干燥植入物组合物(其用无菌水或无菌等渗盐水溶液进行再水化和均匀混合)时，通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长套管挤出可注射式水性植入物制剂所需的力低于40N，通常低于20N。
已经观察到骨形成细胞可以在本发明的可注射式水性植入物制剂中体外生长。这表明可注射式水性植入物制剂具有很高的生物相容性，在植入时提供了一种非常接近于发生再生的自然体内环境的基质。
上述可注射式水性植入物制剂不能在保持其挤出特性的同时通过伽马射线或X射线辐照灭菌。实际上，当该制剂受到伽马射线或X射线辐照时，会释放自由基，由此导致胶原不受控制地交联，从而使制剂不可通过18#(内径0.838mm)的套管挤出，或仅在使用过高而无法手动施加的力时才能通过此类套管挤出。
发明内容
现已发现，当向上述含有胶原的可注射式水性植入物制剂中添加足量的抗坏血酸时，可通过伽马射线或X射线辐照对其进行灭菌，同时保持其挤出特性：抗坏血酸用于清除伽马射线或X射线辐照灭菌过程中释放的自由基，从而避免胶原不受控制的交联。与该灭菌期间预计消耗的量相比，抗坏血酸应过量添加。
灭菌后的可注射式水性植入物制剂(因此含有一些残余的抗坏血酸，通常为至少0.05w/w％)可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管挤出，挤出力与灭菌前可注射式水性植入物制剂的相同。灭菌的可注射式水性植入物制剂于室温储存至少9个月的时间时，仍能保持这些挤出特性。
因此，本发明涉及一种可注射式水性植入物制剂，该可注射式水性植入物制剂已通过伽马射线或X射线辐照灭菌，并包含25w/w％至45w/w％的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，可注射式水性植入物制剂的特征在于其含有至少0.05％(w/w)的抗坏血酸。
上述灭菌的可注射式水性植入物制剂于室温储存至少9个月的时间时，仍保持这些挤出特性。
可注射式水性植入物制剂于室温储存至少9个月的时间后保持稳定，特别是关于其挤出行为。
可注射式水性植入物制剂可含有0.1w/w％至1w/w％的抗坏血酸。根据一个实施方式，其含有0.2w/w％至0.5w/w％的抗坏血酸。
纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5。可以为2.5至4.2。根据一个实施方式，为2.5至4.0.根据一个实施方式，为3.9至4.1。
表述“通过筛分确定尺寸为xμm至yμm的颗粒”表示通过“yμm”筛但被“xμm”筛保留的颗粒。因此，表述“源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒通过筛分确定为50μm至200μm”表示“通过200μm筛但被50μm筛保留的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒”。实施例11)中说明了选择通过筛分确定尺寸为100μm至150μm尺寸和125μm至180μm的此类颗粒。
当使用基于光散射的激光方法(如M.Konert等人，1997，Sedimentology 44：523-535中所述)来确定源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的尺寸时，由于此类颗粒的长方形/纵向形状远不是球形，因此将会测量大得多的尺寸(参见图5，左侧)。例如，当使用该方法确定通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的此类颗粒的尺寸时，结果显示平均值为189.94μm，其中10％的颗粒超过281.87μm。
源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒通过筛分确定尺寸优选为100μm至180μm。
根据一个实施方式，源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm。
术语“天然交联纤维胶原材料”指通过允许保留其端肽结构及其天然交联的大部分的工艺而源自天然组织材料的纤维胶原材料。此类天然交联纤维胶原材料为未经任何酶处理、任何化学交联或任何物理交联(例如通过脱氢热处理DHT、紫外线照射等)的不溶性胶原材料。实际上，任何一种后面的处理都可能显著改变天然组织材料中存在的端肽结构和/或天然交联。
天然交联纤维胶原材料适宜源自含有50w/w％至100w/w％胶原和0w/w％至50w/w％弹性蛋白、优选70w/w％至95w/w％和5w/w％至30w/w％弹性蛋白的天然来源组织，根据涉及水解和RP-HPLC的已知方法的修改，通过锁链素/异锁链素测定进行测量(例如，参见Guida E.等人，1990Development and validation of a high performancechromatography method for the determination of desmosines in tissues，于Journal of Chromatography中或Rodriguqe P 2008Quantification of Mouse LungElastin During Prenatal Development，于The Open Respiratory Medicine Journal中)。此类组织的实例包括脊椎动物，特别是哺乳动物(例如猪、牛、马、绵羊、山羊、兔)腹膜或心包膜、胎盘膜、小肠粘膜下层(SIS)和真皮。此类组织优选猪、牛或马。感兴趣的组织是猪、牛或马的腹膜和真皮。
优选的是，天然交联纤维胶原材料选自由猪真皮和猪腹膜或心包膜组成的组。
通常，天然交联纤维胶原材料含有50w/w％至100w/w％的胶原和0w/w％至50w/w％的弹性蛋白，优选70w/w％至95w/w％和5w/w％至30％w/w的弹性蛋白。
源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是来自通过类似于EP-B1-1676592的“实施例”中所述方法制备的猪、牛或马的腹膜或心包膜的胶原膜，该方法包括碱处理、酸处理和有机溶剂处理，然后切成通过0.5mm筛的碎片。
另一种源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是Geistlich Bio-
Figure BDA0003403731420000121
(购自Geistlich Pharma AG)，其已被切成通过0.5mm筛的碎片。
另一种源自天然组织的合适的天然交联纤维胶原材料是通过类似于EP-B1-2654816实施例7所述的方法制备的猪真皮，该方法包括碱处理、酸处理、冷冻干燥和有机溶剂洗涤，然后切成通过0.5mm筛的碎片。
通过伽马射线或X射线辐照灭菌的上述定义的可注射式水性植入物制剂可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过60N的力进行挤出，例如使用实施例93)中详细描述的挤出试验。这种力可以手动施加在注射器上。在灭菌前的可注射式水性植入物制剂上发现了相同的挤出特性。
优选地，可注射式水性植入物制剂包含30w/w％至40w/w％的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的得自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4。
然后，可以通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过30N的力挤出可注射式水性植入物制剂。这种力可以很容易地手动施加至注射器上。
根据一个实施方式，可注射式水性植入物制剂包含29.5w/w％至30.5w/w％的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的得自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5。
然后，可以通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过10N的力挤出可注射式水性植入物制剂。这种力可以方便地手动施加至注射器上，即使是小尺寸的注射器。
本发明还涉及一种包含可注射式水性植入物制剂的即用型注射器。这种注射器便于在上颌骨-面部手术中使用，通过18#套管注射上述用于口腔组织再生的可注射式水性植入物制剂。
本发明还涉及制备上述可注射式水性制剂的方法，该方法包括将通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片添加到无菌水或等渗溶液中，并在超过60℃的温度在酸性pH下均匀混合以制得胶原浆料，向胶原浆料中添加源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以致纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，并均匀混合，添加0.15w/w％至0.5％w/w的抗坏血酸并均匀混合，并且通过伽马射线或X射线辐照灭菌。
上述可注射式水性植入物制剂也可通过国际PCT专利申请WO-2019/115795中所述的方法获得，该方法包括在无菌水或无菌等渗盐溶液中再水化并均匀混合25w/w％至45w/w％的干燥植入物组合物(基本上由通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物组成)，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，然后添加0.15w/w％至0.5w/w％的抗坏血酸并均匀混合，并且通过伽马射线或X射线辐照灭菌。
通常，通过伽马射线或X射线辐照灭菌以25Gy至33Gy进行。
上述含有可注射式水性植入物制剂的即用型注射器通常如下制备：将上述可注射式水性制剂引入注射器中，并通过伽马射线或X射线辐照填充的注射器进行灭菌。即用型注射器可使用至少9个月的时间。
附图说明
将参考本发明优选实施方式的说明性示例和附图进一步详细描述本发明，其中：
图1表示Medmix注射器混合系统(Medmix，SP 003-00M-02/B，目录号507211)，(1)是含有干燥生物材料的注射器，(2)是带有开孔式鲁尔出口的注射器盖，其与任何鲁尔套管兼容，(3)是在混合过程中关闭注射器的开孔盖，(4)是混合装置，其在移除柱塞后为挠性混合器，(5)是柱塞，其可移除以混合注射器中的材料，然后可复位以推出材料。
图2是Medmix注射器混合系统附带的操作说明中规定的Medmix混合程序的副本。
图3A和3B表示通过将实施例中的干燥植入物组合物2和4分别与等渗盐水(曲线(1)和(3))或新鲜人血(曲线(2)和(4))再水化并均匀混合而获得的可注射式水性植入物制剂的挤出曲线。
图4是使用CV1000共焦旋转圆盘显微镜以561nm激光照射激发的可注射式水性植入物制剂4的显微镜图像，可注射式水性植入物制剂4通过将干燥植入物组合物4(实施例6中制备)用人血再水化并均匀混合而获得：生长的MC3T3 CytoLight红血球在明亮的光线下可见。
图5在左侧表示源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的扫描电子显微照片(SEM)，在右侧表示合成β-TCP颗粒的SEM。
具体实施方式
以下实施例说明本发明而不限制其范围。
实施例1制备原料
1)制备通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰 石细颗粒
如US-A-5417975实施例1至4所述，由皮质骨或松质骨制备纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒，分别使用100μm至150μm或125μm至180μm的额外筛分步骤，即分别选择通过150μm筛但未通过100μm筛的颗粒或通过180μm筛但未通过125μm筛的颗粒。
作为选择，如下制备纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒：研磨Geistlich
Figure BDA0003403731420000141
小颗粒(购自Geistlich Pharma AG，CH-6110，Switzerland)，使用喷枪小心撞击，并分别在100μm至150μm(通过150μm筛但未通过100μm筛的颗粒)或125μm至180μm(通过180μm筛但未通过125μm筛的颗粒)进行额外筛分步骤。
将上述制备的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒(通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm)储存在玻璃瓶中直至使用。
2)制备胶原A
猪皮在绞肉机中研磨成1mm至20mm的碎片。使用水溶性溶剂(如醇或酮)去除水。胶原纤维使用氯化烃(如二氯乙烷或二氯甲烷)或非氯化烃(如己烷或甲苯)脱脂。去除溶剂后，胶原用pH值高于12的强无机碱处理6至24小时，并用pH值为0至1的强无机酸处理1至12小时。用水洗涤去除多余的酸，并在存在溶胀调节剂(如无机盐)的情况下将悬浮液均质化为0.5％至2％的胶原纤维均匀悬浮液。悬浮液通过冷冻干燥进行干燥，所得海绵的干燥胶原纤维用不同的有机溶剂(如醇、醚、酮和氯化烃)相继洗涤，然后在真空下蒸发溶剂，使溶剂残留量小于1％。
使用剪刀手工切割1×1cm清洁的胶原海绵片。首先使用包括0.5mm至4.0mm筛的切碎机，然后使用包括梯形孔的0.5mm筛的离心式磨机(Retsch，ZM200)，进一步切碎切割片。剪切片直接用离心式磨机交替研磨。
由此获得由通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原碎片组成的胶原A。
3)制备胶原B
用机械方法使幼猪的腹膜与肉和油脂完全分离，在流动水下洗涤，并用2％NaOH溶液处理12小时。然后在流动水下洗涤膜，并用0.5％的HCl酸化。在材料在其整个厚度上被酸化后(约15分钟)，洗涤材料，直至获得pH 3.5。然后用7％的盐水收缩材料，用1％的NaHCO3溶液中和，并在流动水下洗涤。材料然后用丙酮脱水，用正己烷脱脂。
材料用乙醇醚干燥，并用包括0.5mm至1.0mm的梯形筛的切碎机研磨(例如，Fritsch的Pulverisette 25，参见www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25，或Retsch的SM300，www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm)。
切割的胶原纤维段进一步使用具有0.5mm筛(包括梯形孔)的离心式磨机(Retsch，ZM200)切碎。
由此获得由通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原碎片组成的胶原B。
实施例2含有纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原的混合组合物的干燥和灭菌
含有纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原的混合组合物(如下文实施例3至8所述获得)通过减压下冷冻干燥或空气干燥进行干燥，并通过伽马射线或X射线辐照灭菌。
1)冷冻干燥
从50ml注射器中，从后侧将团块填充至1ml环烯烃共聚物(COC)注射器中。每1ml注射器填充约0.5ml体积。将注射器从两侧封闭储存在4℃的冰箱中5小时。然后将注射器两侧打开并放置在冻干机中的金属板上，每个注射器处于平卧位置，以便与金属板有较大的接触表面。然后启动以下冻干程序：
1.在7小时内冷冻至-40℃
2.在-40℃保持4小时
3.在20小时内于-10℃和850μbar进行一次干燥
4.在6小时内于+20℃和100μbar进行二次干燥
作为选择，粘性胶原-纳米结晶羟基磷灰石团块不是在注射器中冷冻干燥，而是在不锈钢板上或直径小于25mm且深度小于10mm的小型不锈钢模板中冷冻干燥。冷冻干燥后获得的干燥材料通过使用具有1.5mm至10mm筛的离心式磨机(Retsch，ZM200)粉碎成0.1mm至2mm大小的颗粒。通过磨机进行粉碎，可使重组最终产品中的纳米结晶羟基磷灰石颗粒更小。
作为选择，为了粉碎，将粘性胶原-纳米结晶羟基磷灰石团块挤出注射器的标准鲁尔出口，并在不锈钢板上形成为直线。然后将材料照此冷冻干燥。
2)空气干燥
粘性胶原-纳米结晶羟基磷灰石块(例如，形成为直线)或者在30℃和10mbar的真空烘箱中用空气干燥24小时。
用手将干燥的直线分成5mm至10mm长的棒。
然后将颗粒状材料或小棒填充到3ml注射器混合系统(MEDMIX，SP003-00M-02/B，目录号507211)中，该系统具有带开孔式鲁尔接口的注射器盖和开孔盖(MEDMIX，CP 000-76M/D，目录号506964)。
3)灭菌
通过减压下冻干或空气干燥获得的干燥植入物组合物在注射器中以27kGy至33kGy的伽马射线或X射线辐照进行灭菌。
根据卡尔·费歇尔滴定法测定，灭菌后干燥产品中的含水量为3％至7％。
对如实施例3至8中所述制备的干燥植入物组合物1至6，执行关于干燥植入物溶液的冷冻干燥、空气干燥和伽马射线或X射线辐照灭菌的上述步骤。
实施例3制备干燥植入物组合物1(包含通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原A，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
水和盐酸(2M)在烧杯中用刮铲混合。添加在实施例1中获得的磨碎的胶原A，并小心地将其推入液体中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机(CosearchGmbH，Speedmixer DAC400.1FVZ)在4分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料。在混合过程中稍微加热胶原浆料。然后将胶原浆料在4℃的冰箱中冷却30分钟。
用高速混合机在2分钟内以2500rpm再次混合胶原浆料。然后，将实施例1中制备的通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在2分钟内以2000rpm混合团块。所得pH值为约4.5。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000171
胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物1，其含有通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原A，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0，并在使用脱矿质水进行再水化后提供4.5的pH(如实施例9所述进行)。
实施例4制备包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原B的干燥植入物组合物2，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
将实施例1中获得的磨碎的胶原B小心地推入脱矿质水中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机在1分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料。然后将胶原浆料在水浴中加热至70℃持续4小时。然后将胶原浆料于环境温度或在冰箱或水浴中冷却30分钟。
用高速混合机在2分钟内以2500rpm再次混合胶原浆料。然后，将实施例1中制备的通过筛分测定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在2分钟内以2000rpm混合团块。所得pH值为6.2。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000181
胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物2，其含有通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原B，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0，并在使用脱矿质水进行再水化后提供6.2的pH(如实施例9所述进行)。
实施例5制备包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及2份胶原A和1份胶原B的混合物的干燥植入物组合物3，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.67
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
水和盐酸(2M)在烧杯中用刮铲混合。将实施例1中获得的磨碎的胶原B小心地推入液体中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机在2分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料，所得pH为0.9至1。然后在20分钟内在水浴中将胶原浆料加热至70℃。然后将胶原浆料在25℃水浴中冷却30分钟。
添加实施例1中获得的磨碎的胶原A并小心地推入胶原浆料中以润湿所有胶原。然后用高速混合机在4分钟内以2500rpm混合浆料。
最后，将实施例1中制备的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在2分钟内以2000rpm混合团块。所得pH为约4.5。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000182
Figure BDA0003403731420000191
纳米结晶羟基磷灰石-胶原组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物3，其含有通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及2份胶原A和1份胶原B的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.67，并在使用脱矿质水进行再水化后提供4.5的pH(如实施例9所述进行)。
实施例6制备包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及2份胶原A和1份胶原B的混合物的干燥植入物组合物4，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.67
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
将实施例1中获得的磨碎的胶原B小心地推入脱矿质水中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机在1分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料。然后在20分钟内在水浴中将胶原浆料加热至70℃。然后将胶原浆料在25℃水浴中冷却30分钟。
添加实施例1中获得的磨碎的胶原A并小心地推入胶原浆料中以润湿所有胶原。然后用高速混合机在4分钟内以2500rpm混合浆料。
最后，将实施例1中制备的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在2分钟内以2000rpm混合团块。所得pH为6.0。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000192
Figure BDA0003403731420000201
纳米结晶羟基磷灰石-胶原组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物4，其含有通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及2份胶原A和1份胶原B的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.67，并在使用脱矿质水进行再水化后提供6.0的pH(如实施例9所述进行)。
实施例7制备包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原A的干燥植入物组合物5，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
将磨碎的胶原A小心地推入液体中以润湿所有胶原。添加实施例1中制备的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒，并将烧杯用螺旋盖关闭。水-胶原-纳米结晶羟基磷灰石浆料通过旋涡混合器在1分钟内均匀混合，并通过匙勺在1分钟内均匀混合。
所得pH为6.1。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000202
纳米结晶羟基磷灰石-胶原组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物5，其含有通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原A，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0，并在使用脱矿质水进行再水化后提供6.1的pH(如实施例9所述进行)。
实施例8制备包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原B的干燥植入物组合物6，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原A的重量比为2.0
制备胶原-纳米结晶羟基磷灰石组合物
将磨碎的胶原A小心地推入脱矿质水中以润湿所有胶原。添加实施例1中制备的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒，并将烧杯用螺旋盖关闭。水-胶原-纳米结晶羟基磷灰石浆料通过旋涡混合器在1分钟内均匀混合，并通过匙勺在1分钟内均匀混合。
所得pH为5.8。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000211
纳米结晶羟基磷灰石-胶原组合物的干燥
如实施例2所述，在减压下通过冷冻干燥或空气干燥进行干燥以及灭菌。
由此获得干燥植入物组合物6，其含有通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原A，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.0，并在使用脱矿质水进行再水化后提供5.8的pH(如实施例9所述进行)。
实施例9通过将干燥植入物组合物在注射器中再水化制备含有可注射式水性植入物制剂的即用型注射器
1)通过再水化和均匀混合干燥植入物组合物制备含有可注射式水性植入物制剂 的即用型注射器
a)使用三通旋塞阀鲁尔接口适配器和1ml注射器
2)使用三通旋塞阀鲁尔(Luer-Lok)适配器(BD Connecta，三通旋塞，目录号394600)、Vaclok注射器(Qosina，Vaclok注射器，目录号C1097)和正常一次性辅助注射器1ml(Luer-Lok)对1ml产品注射器中的干燥、无菌纳米结晶羟基磷灰石-胶原组合物进行再水化。
使胶原再水化的液体为脱矿质水、等渗盐水溶液、pH值为7.4的含有150mM磷酸钠缓冲液的PBS溶液(通过将NaH2PO4溶解在脱矿质水中并用氢氧化钠调节pH制备)或血液。
已知或测量注射器中干生物材料(在实施例3至8之一中获得的干燥植入物组合物)的重量。在补充注射器中填充一定量的再水化液体，以获得含有38重量％的干生物材料的可注射糊剂。
然后将产品注射器连接至三通旋塞阀上，并通过闭合盖关闭三通旋塞阀的180°配对物。在三通旋塞阀的第三个位置(与产品注射器成90°)，将60ml Vaclok注射器连接至系统。通过拉动Vaclok注射器的柱塞并锁定在50ml体积，从产品注射器中排出空气。然后将三通阀旋转180°以保持产品注射器中的真空，而将Vaclok注射器更换为填充有液体的辅助注射器。然后将三通阀旋转180°。由于真空，液体自动流入产品注射器并润湿产品。为了确保液体完全转移到产品注射器中，产品注射器的柱塞被拉回。在将材料从产品注射器推入辅助注射器并返回之前，使材料静置30秒以实现再水化，该系列重复40次以获得均匀混合的材料。在混合程序后，三通旋塞阀被锥形系统和钝端18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管取代。
通过将每种干燥植入物组合物1至6与脱矿质水再水化和均匀混合而获得的重组可注射式水性植入物制剂的pH值接近于冻干前测得的pH，即分别为约4.5、6.2、4.5、6.0、6.1和5.8。
b)使用3ml Medmix注射器混合系统
作为选择，在Medmix注射器混合系统(Medmix，SP 003-00M-02/B，目录号507211)中，使用脱矿质水、等渗盐水溶液、pH值为7.4的PBS溶液(含有150mM磷酸钠缓冲液)或血液对干材料的颗粒进行再水化，该系统具有带开孔式鲁尔接口的注射器盖和开孔盖(MEDMIX，CP 000-76M/D，目录号506964)，如图1所示，其中(1)是含有干生物材料的注射器，(2)是带有开孔式鲁尔出口的注射器盖，与任何鲁尔套管兼容，(3)是在混合过程中关闭注射器的开孔盖，(4)是混合装置，在移除柱塞后为挠性混合器，(5)是柱塞，可移除以混合注射器中的材料，然后可复位以推出材料。
遵循图2所示的Medmix混合程序。为了获得最佳结果，在步骤4之后，推动柱塞3次，以便将液体推入材料中，使其润湿，并执行混合步骤(步骤6)60秒。在步骤8中除去所有空气。
3)挤出试验
使用张力和压力测试装置(Zwick&Roell，BT1-FR2.5TS.D14)测试获得的重组可注射式水性植入物制剂的可挤出性。将上述制备的即用型注射器垂直放置在注射器夹持器中，并由机器向下按压柱塞，同时使用以下程序测量通过包括锥形系统和钝端18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管(Nordson EFD，Precision Tip 18GA1”，目录号7018110)的施涂器将产品压出注射器的力，：
о受到阻力之前的力：0.1N
о受到阻力之前的速度：100mm/min
о试验速度：1mm/s，位置控制
о试验结束：力限，150N
о测力传感器：200N
对于通过与脱矿质水、等渗盐水溶液或PBS溶液再水化和均匀混合获得的所有受试可注射式植入物制剂，特别是由干燥植入物组合物1至6制备的可注射式植入物制剂，测得的力不超过40N。
对于通过与血液再水化和均匀混合获得的所有受试可注射式植入物制剂，特别是由干燥植入物组合物1至6制备的可注射式植入物制剂，测得的力不超过45N。
对于通过与脱矿质水、等渗盐水溶液或PBS溶液再水化和均匀混合获得的所有受试可注射式植入物制剂(由干燥植入物组合物1、2、3、4、5和6制备)，测得的力不超过20N。
对于通过与血液再水化和均匀混合获得的所有受试可注射式植入物制剂，其由干燥植入物组合物1(包含通过筛分确定尺寸为100μm至150μm或125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原A，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0)和干燥植入物组合物2(包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原B，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0)制备，测得的力不超过25N。
参见图3A和3B，其表示通过将干燥植入物组合物2和4分别与等渗盐水或新鲜人血再水化并均匀混合而获得的可注射式水性植入物制剂的挤出曲线。
-图3(A)中，(1)和(2)是分别用等渗盐水和新鲜人血再水化干燥植入物组合物2(包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及胶原B，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为4.0)的挤出曲线。
-图3(B)中，(3)和(3)是分别用等渗盐水和新鲜人血再水化干燥植入物组合物4(包含通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以及2份胶原A与1份胶原B的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.67)的挤出曲线。
实施例10制备包含38％的源自天然骨的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原B的混合物的可注射式水性植入物制剂(含有抗坏血酸)，其中陶瓷与胶原的重量比为4.0
将实施例1中获得的磨碎的胶原B小心地推入脱矿质水中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机(FlackTech Inc.,USA)在2分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料。使用5滴2M的盐酸降低pH。在通过高速混合机在2分钟内以2500rpm进行的额外的混合步骤之后，测量pH，目的是将pH调整至3.5。然后将胶原浆料在水浴中加热至70℃，持续4小时。然后使胶原浆料置于25℃的水浴中。
用高速混合机在2分钟内以2500rpm再次混合胶原浆料。然后，将实施例1中制备的通过筛分测定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在3分钟内以2000rpm混合团块。
将2.76mg抗坏血酸/g团块(对于试验1)、1.76mg抗坏血酸/g团块(对于试验2)或1.33mg抗坏血酸/g团块(对于试验3)溶解在0.1ml水中，添加到团块中，并通过高速混合机在1分钟内以2000rpm混合，从而得到pH为6.0的可注射式水性植入物制剂。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000241
上述三种可注射式水性植入物制剂(在上述实施例9 3)中所述的试验中)中的每一个都可以通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过30N的力挤出。如此小的力可以方便地手动施加在小型注射器上。
使用刮铲从后侧将所得团块填充到50ml注射器中，并填充到较小的0.5ml和1.0ml注射器中。然后将填充的注射器在4℃的冰箱中储存过夜，然后在3天内通过25Gy至33Gy的X射线辐照于环境温度储存和灭菌。
灭菌后不久，试验1或试验2的可注射水溶液可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过25N的力挤出。然而，试验3的可注射水溶液只能以40N至45N的力挤出。
试验1的灭菌注射水溶液中的残余抗坏血酸经测定为约1,20mg/g，这表明灭菌过程中消耗了初始2.64mg/g中的约1.44mg/g的量。因此，试验3可注射水溶液的1,33mg/g的初始量可能不足以清除其灭菌过程中释放的足够多的自由基，从而导致胶原轻微交联，这可以解释通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管挤出所需的更大的力。
于室温在注射器中储存9个月后，上述灭菌的可注射式水性植入物制剂中的每一个的挤出特性与上述灭菌后不久报告的相同，即对于试验1或2的灭菌可注射式水性植入物制剂不超过25N的可挤出性，对于试验3的灭菌可注射式水性植入物制剂不超过40N至45N的可挤出性。
实施例11制备包含30％的通过筛分确定尺寸为125μm至180μm的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒和胶原B的混合物的可注射式水性植入物制剂(含有抗坏血酸)，其中陶瓷与胶原的重量比为4.0
将实施例1中获得的磨碎的胶原B小心地推入脱矿质水中以润湿所有胶原。烧杯用螺旋盖关闭，并用高速混合机(FlackTech Inc.,USA)在2分钟内以2500rpm均匀混合水-胶原浆料。使用5滴2M的盐酸降低pH。在通过高速混合机在2分钟内以2500rpm进行的额外的混合步骤之后，测量pH，目的是将pH调整至3.5。然后将胶原浆料在水浴中加热至70℃,持续3小时。然后使胶原浆料置于25℃的水浴中。
用高速混合机在2分钟内以2500rpm再次混合胶原浆料。然后，将实施例1中制备的通过筛分测定尺寸为125μm至180μm的纳米结晶羟基磷灰石骨矿物细颗粒与胶原浆料一起添加到烧杯中，并使用高速混合机在3分钟内以2000rpm混合团块。将1.76mg抗坏血酸/g团块溶解于0.1ml水中，添加至团块，并通过高速混合机在1分钟内以2000rpm混合，从而得到pH值为6.0的可注射式水性植入物制剂。
下表规定了上述试验中使用的材料量：
Figure BDA0003403731420000261
可注射式水性植入物制剂(在上述实施例9 3)中所述的试验中)可以通过锥形系统和18#(0.838mm内径)25.4mm长的套管以不超过10N的力挤出。如此小的力可以方便地手动施加在小型注射器上。
使用刮铲从后侧将所得团块填充到50ml注射器中，并填充到较小的0.5ml和1.0ml注射器中。然后将填充的注射器在4℃的冰箱中储存过夜，然后在3天内通过25Gy至33Gy的X射线辐照于环境温度储存和灭菌。
灭菌后不久，可注射水溶液可通过锥形系统和18#(内径0.838mm)25.4mm长的套管以不超过10N的力挤出。
于室温在注射器中储存9个月后，上述灭菌的可注射式水性植入物制剂的挤出特性与上述灭菌前或灭菌后不久报告的相同。

Claims (14)

1.一种可注射式水性植入物制剂，所述制剂已通过伽马射线或X射线辐照灭菌，并包含25w/w％至45w/w％的通过筛分确定尺寸为50μm至200μm的源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒与通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片的混合物，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，其特征在于所述制剂含有至少0.05％(w/w)的抗坏血酸。
2.如权利要求1所述的可注射式水性植入物制剂，所述制剂包含30w/w％至40w/w％的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的混合物。
3.如权利要求1所述的可注射式水性植入物制剂，所述制剂包含29.50w/w％至30.50w/w％的纳米结晶羟基磷灰石颗粒的混合物。
4.如权利要求1至4中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，所述制剂包含0.1％至1％(w/w)的抗坏血酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，所述制剂包含0.2％至0.5％(w/w)的抗坏血酸。
6.如权利要求1至6中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.5至4.2。
7.如权利要求1至6中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为2.5至4.0。
8.如权利要求1至6中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为3.9至4.1。
9.如权利要求1至9中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中所述纳米结晶羟基磷灰石颗粒通过筛分确定尺寸为100μm至180μm。
10.如权利要求1至9中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中所述纳米结晶羟基磷灰石颗粒通过筛分确定尺寸为125μm至180μm。
11.如前述权利要求中任一项所述的可注射式水性植入物制剂，其中所述天然交联纤维胶原材料选自由猪真皮和猪腹膜或心包膜组成的组。
12.一种即用型注射器，所述注射器包含权利要求1至11中任一项所述的可注射式水性植入物制剂。
13.一种用于制备权利要求1至12中任一项所述的可注射式水性植入物制剂的方法，所述方法包括向无菌水或等渗溶液中添加通过0.5mm筛的天然交联纤维胶原材料碎片，并在超过60℃的温度在酸性pH下均匀混合以制得胶原浆料，向所述胶原浆料中添加源自天然骨的纳米结晶羟基磷灰石颗粒以致纳米结晶羟基磷灰石与胶原的重量比为1.8至4.5，并均匀混合，添加0.15％w/w至0.5％w/w的抗坏血酸并均匀混合，并且通过伽马射线或X射线辐照灭菌。
14.如权利要求13或14所述的方法，其中通过伽马射线或X射线辐照灭菌以25Gy至33Gy进行。
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