CN114166784B - 乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于乳制品质量检测领域，公开了乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法。申请人在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。选取了乳制品中糠氨酸含量定量预测模型建立的最优算法与最佳特征波段，实现了等乳制品中糠氨酸含量进行快速准确检测，有较强的实用性，可广泛应用于乳制品生产中。
Description
技术领域
本发明属于乳制品质量检测领域，具体涉及乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法。
背景技术
在原料牛奶热加工工艺的热处理过程中，随着温度升高、消毒杀菌和灭菌，对牛奶乳成份产生热损失(Ⅰ类指标，如乳清蛋白和免疫相关蛋白等)和热生成(Ⅱ类指标，如糠氨酸和乳果糖等)，糠氨酸(美拉德反应)、乳果糖(乳糖异构化反应)含量常用于评价牛奶的热加工程度。
乳品业正在致力于完善食品的质量安全检测体系，以生产出富含乳铁蛋白等重要天然营养成份的高品质乳制品。目前主要采用高效液相色谱和毛细管色谱串联质谱等方法检测Ⅱ类热敏指标糠氨酸含量，在高效液相色谱法测定糠氨酸过程中，需要阻止美拉德反应、使糠氨酸能够充分游离出蛋白质或肽链，必须使用实验室易制毒危险品浓盐酸(浓度不小于 6mol/L)，受到实验室安全要求限制，此外，这些方法存在检测成本高、耗时长、技术要求高等不足。中红外光谱技术结合琅勃-比尔定律，通过对特征吸收谱带强度的测量来分析组分的含量，可用于乳成份的定量检测和分析，具有便捷、高效、高通量的技术优势，目前已被广泛应用于奶牛生产性能和乳品成份分析。然而，还没有乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法，故本发明利用中红外光谱MIR建立乳制品中糠氨酸含量检测模型，对乳制品进行无损、方便、低成本和快速的检测，为乳制品快速检测提供技术支撑。
发明内容：
本发明的目的在于提供了乳制品中糠氨酸含量的快速自动检测方法，利用该方法可对 UHT高温灭菌乳等乳制品中糠氨酸含量进行快速检测。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法：
1.采集水牛奶样本中的红外光谱中特征波段为1084.10cm-1-1207.55cm-1、1334.87 cm-1-1481.47cm-1、1639.65cm-1-1967.58cm-1、2079.46cm-1-2287.79cm-1、2457.55cm-1-2542.42cm-1、2920.51cm-1-2932.08cm-1与3665.10cm-1-3881.15cm-1中的MIR数据；
2、将测定所得到的MIR数据代入none+PLSR(n_component＝25)模型中，即可输出乳制品中糠氨酸含量的预测结果。
以上所述的方法中，优选的，步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
本发明的保护内容还包括：上述检测方法用于检测乳制品中糠氨酸含量。
与现有技术相比，本发明优点在于：
1.在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择+多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。
2.选取了乳制品中糠氨酸含量定量预测模型建立的最优算法与最佳特征波段，准确性较好。
3.实现了等乳制品中糠氨酸含量进行快速检测，是一种快速、准确、低成本的检测技术，大大的缩短了样品的测定时间，大幅度提高了检测效率，有较强的实用性，可广泛应用于乳制品生产中。
附图说明
图1为未经处理的乳制品样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)。
图2为选取的七个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)。
图3为模型乳制品数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
1.实验材料
为了采集具有代表性和多样性的高温灭菌乳样本，在中国不同地区的商超，每月采集不同批次、不同品牌商品高温灭菌乳，要求采样标准符合GB25190。在2020年11月—2021 年9月期间共采集了199个高温灭菌乳样本，品牌包含：蒙牛纯牛奶、伊利纯牛奶、光明纯牛奶、完达山纯牛奶、君乐宝纯牛奶、贵州山花纯牛奶、蒙牛特仑苏纯奶、伊利金典纯奶、三元纯牛奶、三元方小白、三元梦幻盖、三元酪蛋白、三元极致、特仑苏有机、金典有机、新希望纯牛奶、认养一头牛纯奶、圣牧有机纯奶、黑沃纯牛奶等，在0-4℃冷库中贮存。
2.中红外光谱测定与采集
将样品倒入直径3.5cm，高9cm的圆柱形样品管中，使用FOSS公司的MilkoScanTM7RM 乳成分检测仪，将固体光纤探头伸到液体中，对样品进行混匀后扫描。
3.高温灭菌乳中糠氨酸的真实(参考)值检测方法
采用中华人民共和国农业行业标准巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定(NY/T 939—2016)对糠氨酸含量进行测定。
3.1仪器、设备和试剂
Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪配备DAD检测器；Kromat universilLP-C18色谱柱(4.6*250nm，5μm)；隔膜真空泵(津腾)；Millipak超纯水仪(E-POD/Q-POD)；KQ250E 型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；KjeltecTM 8400自动凯氏定氮仪配消化炉；100-1000微升移液枪(Thermo)；智能恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；分析天平(0.0001g)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
糠氨酸标准品(德国Iris公司)；甲醇HPLC级(默克试剂)；三氟乙酸HPLC级(默克试剂)；尼龙66 0.22μm欧美国家进口膜(津腾)；1ml一次性注射器；盐酸AR(Keshi 试剂)；硫酸AR(Keshi试剂)；乙酸铵AR(Keshi试剂)；0.1％标准盐酸(BOLINDA试剂)；氢氧化钠AR(欧博凯试剂)；硼酸AR(沪试)；溴甲酚绿指示剂级(沪试)；甲基红指示剂级(沪试)；硫酸铵GR(索莱宝试剂)；无水乙醇AR(KNOWLES试剂)
3.2实验方法
3.2.1制备样品水解液
吸取2.00mL奶样,置于带螺旋盖耐热试管中，加入6.00mL 10.6mol/L盐酸溶液,混匀。密闭试管,置于干燥箱，在110℃下加热水解加热约1h后,轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后用滤纸过滤，滤液供测定。
3.2.2KjeltecTM 8400自动凯氏定氮仪测定乳蛋白
(1)试样的消煮
将样品称量至250ml消化管中，加入1片Kjeltabs 7g K2SO4+0.8g CuSO4·5H2O，加入12ml浓硫酸，仪器参数设置如下：
(2)上机测定
将消煮完的样品放入蒸馏单元，开启蒸馏单元后置换消化管。
3.2.3Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪测定糠氨酸
(1)样品的制备
移取1.00ml试样水解液，加入5.00ml的6g/L乙酸铵溶液，混匀，过0.22μm水相滤膜, 滤液供上机测定。
(2)色谱条件
色谱柱:Kromat universil LP-C18色谱柱(4.6*250nm，5μm)
柱温：32℃
流动相：0.1％三氟乙酸溶液为流动相A,甲醇为流动相B。
洗脱梯度如下：
| 序号 | 时间min | 流速mL/min | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 1 | — | 1.00 | 100.0 | 0.0 |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 86.8 | 13.2 |
| 3 | 16.50 | 1.00 | 0.0 | 100.0 |
| 4 | 25.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 |
| 5 | 30.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 |
(3)测定
利用流动相A和流动相B的混合液(50：50)以1ml/min的流速平衡色谱系统。然后，用初始流动相平衡系统直至基线平稳。注入10μL 3mol/l盐酸溶液，以检测溶剂的纯度。注入10μL待测溶液测定糠氨酸含量。
3.2.4结果计算
(1)凯式定氮结果计算：
T＝样品标准酸消耗量B＝空白
N＝标准酸浓度
％蛋白＝N x F
奶及奶制品：F＝蛋白因子＝6.38
(2)糠氨酸结果计算
糠氨酸含量以质量分数F计，数值以毫克每百克蛋白质(mg/100g蛋白质)表示：
式中：
At——测试样品中糠氨酸峰面积的数值；
Astd——糠氨酸标准溶液中糠氨酸峰面积的数值；
Cstd——糠氨酸标准溶液的浓度，单位为毫克每升(mg/L)；
D—测定时稀释倍数(D＝6)；
m—样品水解液中蛋白质浓度,单位为克每升(g/L)；
计算结果保留至小数点后一位。
4.有效样本的选择
199个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了14个异常样本，选择了185个样本进行模型的建立与优化。
实施例1：
乳制品中糠氨酸含量的预测模型算法的选择：
本申请目的为建立乳制品中糠氨酸含量的定量预测模型，所以使用建模算法为回归算法。回归算法种类很多，本实施例主要使用了岭回归(Ridge)与偏最小二乘回归(PLSR)算法进行模型建立与对比，理由如下：
岭回归是线性回归的一种。只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果。正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化，l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降。岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
偏最小二乘回归算法是多特征样本中非常有效的算法之一。中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表。同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
实施例2：
定量预测模型算法的选择：
本实施例每个样本对应一条MIR光谱数据。将大于4000cm-1部分和水吸收区域去除进行建模，比较分析模型的准确度，并不使用任何预处理方法，以确定算法的准确度，结果如下表：
算法比较结果:
| 算法 | Rc | RMSEC | Rp | RMSEP |
| Ridge | 0.7043 | 2.2618 | 0.6176 | 3.1090 |
| PLSR | 0.8419 | 1.7193 | 0.6305 | 3.0682 |
经过两种算法比较结果，PLSR在训练集和测试集上效果更好，所以最终选择PLSR算法进行建模。
实施例3：
中红外光谱检测乳制品中糠氨酸含量的方法的建立：
1.建模数据集的划分
本实施例中的建模数据集划分中，80％为训练集，20％为测试集。训练集与测试集的比例为4：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证。
2.建模MIR数据预处理方法的筛选
有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础。有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种。本实施例主要对光谱数据进行特征预处理，首先，采用SG(卷积平滑)、MSC(多元散射校正)、SNV(标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行特征预处理，
3.建模特征波段的手动选择过程及确定
选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一。手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低。
本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：
(1)确定基本算法，由实施例2可知PLSR算法的效果较好，所以最终选择PLSR算法作为乳制品中糠氨酸含量的预测算法。
(2)确定最佳预处理。将样本去掉水波段以及大于4000cm-1部分进行实施例3中的预处理并进行比较，由结果可知，SG预处理较无预处理相比更差，MSC与SNV效果略差，diff1与diff2的过拟合较为严重，所以确定最佳预处理为：无预处理，结果如表所示：
在确定MIR数据是无预处理的基础上，建模特征波段的手动选择过程如下：
(1)去掉4000cm-1-5011.54cm-1段光谱区域，因为此区域为非中红外吸收区域。根据预实验，发现保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在在预实验之后的此步骤中，并未完全去掉水吸收相关的光谱区域。
(2)将剩下的波段区域平均分为八段。
(3)以50个波点为一组，使用PLSR算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将八个波段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成。
(4)在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段。
最终经过十一轮筛选，得到最优结果，如表所示：
最终选取的特征波段的结果为：1084.10cm-1-1207.55cm-1、1334.87cm-1-1481.47cm-1、 1639.65cm-1-1967.58cm-1、2079.46cm-1-2287.79cm-1、2457.55cm-1-2542.42cm-1、2920.51 cm-1-2932.08cm-1与3665.10cm-1-3881.15cm-1，每一段前后允许有两个波点的差距(图2)。
结果发现模型中添加第一段部分水吸收区域模型可以达到最优效果，说明乳制品中糠氨酸含量的特征波段包含第一段部分水吸收区域。
4.模型参数的筛选确定
模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数；
因为并未使用预处理，所以只需要选择算法的参数即可，偏最小二乘回归算法的参数：主成分(n_component)，参数选择结果对比如下：
根据对比结果，最终选择主成分(n_component)为25。最终得到最佳回归模型为：none+PLSR(n_component＝25)模型。训练集和测试集相关系数分别为0.8282和0.8405；训练集和测试集均方根误差分别为1.7857和2.1420。
实施例4：
乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱MIR快速批量检测方法的应用：
利用建立的乳制品中糠氨酸含量最佳回归模型none+PLSR(n_component＝25)对随机选取的6份牛奶样本(非185份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较。
模型使用方法：
1.采集水牛奶样本中的红外光谱中特征波段为1084.10cm-1-1207.55cm-1、1334.87 cm-1-1481.47cm-1、1639.65cm-1-1967.58cm-1、2079.46cm-1-2287.79cm-1、2457.55cm-1-2542.42cm-1、2920.51cm-1-2932.08cm-1与3665.10cm-1-3881.15cm-1中的MIR数据；
同时利用高效液相色谱法检测同批次乳制品中糠氨酸含量真实值。
2.将测定所得到的MIR数据代入实施例3构建的none+PLSR(n_component＝25)模型中，即可输出乳制品中糠氨酸含量的预测结果。
该模型预测的结果与真实结果接近(如下表，图3)，故该模型的准确性较高，可用于乳制品中糠氨酸含量的预测。
参考文献：
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[2]杭锋,郭本恒,任璐,等.影响超高温灭菌纯牛乳糠氨酸含量的关键点分析及控制[J].食品工业科技,2008(11):4.
[3]任璐,龚广予,王荫榆,等.复原乳中糠氨酸含量测定方法的研究[J].食品研究与开发, 2008,29(008):116-119.
[4]许国庆,赵慧芬,李克杰,等.乳与乳制品中糠氨酸含量的测定方法[J].中国奶牛,2006. [5]Roland,Van,Renterghem,et al.Furosine in consumption milk and milkpowders- ScienceDirect[J].International Dairy Journal,1996,6(4):371-382.
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Claims (3)
1.乳制品中糠氨酸含量的中红外光谱检测方法：
1）. 采集水牛奶样本中的红外光谱中特征波段为1084.10 cm-1-1207.55 cm-1 、1334.87 cm-1-1481.47 cm-1 、1639.65 cm-1-1967.58 cm-1 、2079.46 cm-1-2287.79 cm-1 、2457.55 cm-1-2542.42 cm-1、2920.51 cm-1-2932.08 cm-1与3665.10 cm-1-3881.15 cm-1 中的MIR数据；
2）. 将测定所得到的MIR数据代入none+偏最小二乘回归PLSR模型中，即可输出乳制品中糠氨酸含量的预测结果；其中，所述none指的是无预处理；偏最小二乘回归PLSR的主成分为25。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中每一段波段前后允许有两个波点的差距。
3.权利要求1所述方法在检测乳制品中糠氨酸含量中的应用。
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