CN114159502A - 蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物、制备方法及应用 - Google Patents

蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物、制备方法及应用。本发明所提供的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，是以中药藿香、葛根、陈皮、白芷、茯苓、大枣、黄芩、白芍药为原料经过超微粉碎，再经复合生物酶进行低温酶解，将酶解液进行接种蜡样芽孢杆菌发酵，收集发酵液经过滤、灌装最终得到的成品。本发明通过复合生物酶解提取工艺可以最大限度的获得中药的活性成分，再经过蜡样芽孢杆菌发酵工艺，所得蜡样芽孢杆菌发酵制品掺混动物的饲料中可以达到更好预防治疗腹泻的效果。

Description

蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，相应的还涉及该蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，以及上述的中药组合物在动物饲料中的应用。
背景技术
腹泻是动物常见的一类疾病,通常是由多病原、多因素引起，病因复杂，临床诊治困难。动物腹泻可导致大量电解质丢失、脱水、营养不良等症状，甚至导致动物死亡。用抗菌素治疗动物腹泻时，很容易造成胃肠菌群紊乱。
蜡样芽孢杆菌在生长过程中产生多种活性物质对致病菌或条件致病菌有明显的抑制作用；同时蜡样芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中的游离氧，形成肠道低氧环境，不利于肠道需氧生物的生长繁殖（球虫），促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其他致病菌的生长。蜡样芽孢杆菌能分泌各种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率，同时蜡样芽孢杆菌能合成多种维生素，提高动物抗病能力，促进动物生长。
现代医学研究表明，许多中药富含多糖类、生物碱类、有机酸类、蛋白质、常量元素、微量元素、挥发油类等。上述物质具有激活免疫细胞、增强免疫力，抗病毒、抗细菌、抗应激的作用。中药防治动物疾病具备残留少、耐药性少、副作用少等优点。
目前有不少针对动物抗腹泻中药组合、抗腹泻微生物发酵制剂的报道，但是将中药组合物利用微生物生物发酵技术相结合的产品鲜有报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题，结合蜡样芽孢杆菌发酵的优势，本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料：
10~20份藿香、10~14份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药。
优选的，上述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料：10~19份藿香、10~13份葛根、10~23份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~14份黄芩、10~15份白芍药。
优选的，上述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料10~18份藿香、10~12份葛根、10~22份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~13份黄芩、10~15份白芍药。
优选的，上述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料10~17份藿香、10~12份葛根、10~21份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~12份黄芩、10~15份白芍药。
优选的，上述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料10~16份藿香、10~12份葛根、10~20份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~11份黄芩、10~15份白芍药。
优选的，上述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，按重量份数，包括如下原料10~15份藿香、10~12份葛根、10~20份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~10份黄芩、10~15份白芍药。
进一步的，本发明还提供了上述蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）将中药原料超微粉碎，得中药超微粉；中药原料具体为：10~20份藿香、10~15份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药；以上的“份”为重量份；
（2）在中药超微粉加水，调节pH值后添加复合生物酶Ⅰ进行酶解处理，将所获得的第一酶解液离心，得到第一酶解上清液；在残渣中加入复合生物酶Ⅱ，酶解残渣，获得第二酶解液，离心第二酶解液，得到第二酶解上清液；合并第一酶解上清液与第二酶解上清液，浓缩至其质量的1/3～3/4，灭菌；
（3）合并后的酶解液接种蜡样芽孢杆菌进行发酵，12～48h后收集发酵液，经过滤、灌装得到成品。
优选的，（1）中，超微粉碎条件为：将中药原料混合均匀，采用超微粉碎机粉碎20~35min，至细度大于1500目。
优选的，（2）中，中药超微粉与水的重量比为1:9；调节pH至4.5～5.5；添加0.1%（重量）的复合生物酶Ⅰ；50~60℃搅拌酶解2～3h；
其中，复合生物酶Ⅰ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种。
优选的，（2）中，酶解离心条件为：以转速4000r/min离心10min；
残渣分别加入0.1%（重量）复合生物酶Ⅱ；50~60℃搅拌酶解2~3h，得二次酶解液。
其中，复合生物酶Ⅱ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种。
优选的，（2）中，浓缩条件为：70℃减压旋转蒸发浓缩至质量为原来二分之一。
优选的，（3）中，发酵步骤为：合并的酶解液经121℃巴氏灭菌30min后，向其按1：0.5-1.0通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种5%~15%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速150~300rpm，，发酵温度35~40℃，时间24~48小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，视为发酵结束。
优选的，（3）中，发酵液经膜过滤收集清液，加入防腐剂包含但不限于苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、纳他霉素和丙酸钙，再加入101果汁澄清剂，低速搅拌2h后，经过10000r/min离心5~10min，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15min。
优选的，蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将中药原料超微粉碎，得中药超微粉；所述的中药原料为：10~20份藿香、10~15份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药；以上的“份”为重量份；
（2）在中药超微粉加水，调节pH值后添加复合生物酶Ⅰ进行酶解处理，将所获得的第一酶解液离心，得到第一酶解上清液；在残渣中加入复合生物酶Ⅱ，酶解残渣，获得第二酶解液，离心，得到第二酶解上清液，合并第一酶解上清液与第二酶解上清液，浓缩至其质量的1/3～3/4，灭菌；
中药超微粉与水的重量比为1:9；调节pH至4.5~5.5；添加0.1wt%的复合生物酶Ⅰ；50～60℃下搅拌酶解2~3h；
复合生物酶Ⅰ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种；
两次酶解离心条件为：以转速4000r/min离心10min；
在残渣中加入0.1%（重量）复合生物酶Ⅱ；于50~60℃下搅拌酶解2~3h，得二次酶解液；
复合生物酶Ⅱ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种；
浓缩条件为：70℃减压旋转蒸发浓缩至其质量的1/2；
（3）合并的酶解液经121℃巴氏灭菌30min后，向其按1：0.5-1.0的通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种5%~15%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速150~300rpm，，发酵温度35~40℃，时间24～48小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，结束发酵，经过滤、灌装得到成品。
通过上述的方法制备获得的抗腹泻中药组合物在动物饲料中的应用，也是本发明所要保护的范围。
本发明的有益效果在于：
通过复合生物酶解提取工艺可以最大限度的获得中药的活性成分，再经过蜡样芽孢杆菌发酵工艺，所得蜡样芽孢杆菌发酵制品掺混动物的饲料中可以达到更好预防治疗腹泻的效果。
本发明中通过动物小鼠实验，验证了蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高剂量组在4-6h时间段内与空白对照组相比差异极显著，与盐酸洛哌丁胺组比较，蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高剂量组与中剂量组小鼠腹泻次数皆无显著差异。这说明本发明所提供的中药组合物对于抗腹泻具有较显著的效果。
具体实施方式
下面通过具体实例形式对本发明进行进一步详细说明，但本发明并不局限于此，凡是与本申请相同或相近的技术方案均属于本发明的内容。
实施例1
蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取藿香17份、葛根13份、陈皮18份、白芷4份、茯苓10份、大枣15份、黄芩10份、白芍药10份，混匀，超微粉碎机粉碎30分钟，至其细度达到1500目以上；
（2）取（1）中超微粉100重量份加入蒸馏水900重量份；利用10wt%的盐酸溶液调pH至5左右，加入0.1g酸性纤维素酶和0.1g酸性果胶酶，55℃下水浴搅拌酶解2小时，获得第一酶解液；将第一酶解液4000r/min离心10min，获得第一酶解上清液，备用；
（3）在残渣中加入0.1g的酸性蛋白酶和0.1g的α-淀粉酶，60℃下搅拌酶解2小时，得二次酶解液；于4000r/min下离心10min，获得第二酶解上清液；
（4）将第一酶解上清液和第二酶解上清液合并，于70℃减压旋转蒸发，浓缩至其质量的二分之一；
（5）将（4）中的浓缩液经121℃巴氏灭菌30分钟后，向其按1：0.5通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种5%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速150rpm，，发酵温度37℃，时间24小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，发酵结束，即得发酵液；
（6）发酵液经膜过滤收集清液，加入0.35g山梨酸钾，再加入101果汁澄清剂沉淀其中沉淀物，低速搅拌2小时后，经过10000r/min离心5分钟，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15分钟，即得成品。
实施例2
蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取藿香17份、葛根13份、陈皮18份、白芷4份、茯苓10份、大枣15份、黄芩10份、白芍药10份，混匀，超微粉碎机粉碎30分钟，至其细度达到1500目以上；
（2）取超微粉100重量份加入蒸馏水900重量份；
（3）采用10 wt %盐酸溶液调pH5.5左右，加入0.1g酸性纤维素酶和0.1g酸性果胶酶，55℃水浴搅拌酶解2小时，获得第一酶解液；
（4）将第一酶解液于4000r/min下离心10min，获得第一酶解上清液，备用；在残渣中加入0.1g的添酸性蛋白酶和0.1gα-淀粉酶，60℃搅拌酶解2小时，得第二酶解液，于4000r/min下离心10min，获得第二酶解上清液；
（5）将第一酶解上清液和第二酶解上清液合并，于70℃减压旋转蒸发，浓缩至其质量的二分之一；
（6）酶解液经121℃巴氏灭菌30分钟后，向其按1：1通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种10%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速200rpm，，发酵温度37℃，时间24小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，发酵结束，即得发酵液；
（7）发酵液经膜过滤收集清液，加入0.35g山梨酸钾，再加入101果汁澄清剂沉淀其中沉淀物，低速搅拌2小时后，经过10000r/min离心5分钟，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15分钟，即得成品。
实施例3
蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取藿香17份、葛根13份、陈皮18份、白芷4份、茯苓10份、大枣15份、黄芩10份、白芍药10份，混匀，超微粉碎机粉碎30分钟，至其细度达到1500目以上；
（2）取超微粉100重量份加入蒸馏水900重量份；
（3）采用10 wt %盐酸溶液调pH4.5左右，加入0.1g酸性蛋白酶和0.1gα-淀粉酶，60℃水浴搅拌酶解2小时；获得第一酶解液；将第一酶解液4000r/min离心10min，获得第一酶解上清液，备用；
（4）将第一酶解液于4000r/min下离心10min，获得第一酶解上清液，备用；
在残渣中加入0.1g的酸性纤维素酶和0.1g酸性果胶酶，55℃搅拌酶解2小时，得二次酶解液，于4000r/min下离心10min，获得第二酶解上清液；
（5）将第一酶解上清液和第二酶解上清液合并，于70℃减压旋转蒸发，浓缩至其质量的二分之一；
（6）酶解液经121℃巴氏灭菌30分钟后，向其按1：1.0通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种10%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速200rpm，，发酵温度37℃，时间24小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，发酵结束，即得发酵液；
（7）发酵液经膜过滤收集清液，加入0.35g山梨酸钾，再加入101果汁澄清剂沉淀其中沉淀物，低速搅拌2小时后，经过10000r/min离心5分钟，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15分钟，即得成品。
实施例4
蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取藿香17份、葛根13份、陈皮18份、白芷4份、茯苓10份、大枣15份、黄芩10份、白芍药10份，混匀，超微粉碎机粉碎30分钟，至其细度达到1500目以上；
（2）取超微粉100重量份加入蒸馏水900重量份；
（3）取10 wt %的盐酸溶液调pH4.8左右，加入0.1g的酸性纤维素酶和0.1g酸性果胶酶，60℃水浴搅拌酶解2小时，获得第一酶解液；
（4）将第一酶解液于4000r/min下离心10min，获得第一酶解上清液，备用，在残渣中分别加入0.1g酸性蛋白酶和0.1gα-淀粉酶，55℃搅拌酶解2小时，得第二酶解液，于4000r/min下离心10min，获得第二酶解上清液；
（5）将第一酶解上清液和第二酶解上清液合并，于70℃减压旋转蒸发，浓缩至其质量的二分之一；
（6）酶解液经121℃巴氏灭菌30分钟后，向其按1：1.0通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种15%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速250rpm，，发酵温度37℃，时间24小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，发酵结束，即得发酵液；
（7）发酵液经膜过滤收集清液，加入0.35g山梨酸钾，再加入101果汁澄清剂沉淀其中沉淀物，低速搅拌2小时后，经过10000r/min离心5分钟，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15分钟，即得成品。
实施例5
以盐酸洛哌丁胺作阳性对照药，观察实施例中制备的蜡样芽孢杆菌发酵中药制品对大黄致小鼠腹泻的预防试验。
止泻试验：选取70只体重在25克左右的昆明小白鼠，分成14组，每组5只，分别为空白组，蜡样芽孢杆菌发酵中药制品低剂量组1.25×10-3克、蜡样芽孢杆菌发酵中药制品中剂量组 2.5×10-2克、蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高剂量组 5×10-2克，盐酸洛哌丁胺对照组，每次灌胃体积为5mL，灌胃1次/天，其中空白组每天给予相同剂量的生理盐水灌胃，蜡样芽孢杆菌发酵中药制品组和盐酸洛哌丁胺组预先给药5天，末次给药前禁食(不禁水)12h，末次给药30min 后，每只小鼠100％大黄水煎剂0.5mL灌胃，随后将每只小鼠单独放于铺有白纸的鼠笼之内，每隔2h换垫纸1次，统计垫纸上湿粪多少表示泄泻次数(湿粪指近似圆形的糊状软粪，在垫纸上呈现棕色环带)，分别统计0-2h，2-4h，4-6h三个时项的泄泻次数及6h内泄泻累计次数。
表1 各组平均腹泻次数
Figure 331783DEST_PATH_IMAGE001
由表1试验结果表明，在同一时间段内蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高、中剂量组与盐酸洛哌丁胺组小鼠腹泻次数明显减少，与空白对照组之间相比差异显著，且蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高剂量组在4-6h时间段内与空白对照组相比差异极显著，与盐酸洛哌丁胺组比较，蜡样芽孢杆菌发酵中药制品高剂量组与中剂量组小鼠腹泻次数皆无显著差异。

Claims (10)

1.蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物，其特征在于，该组合物以重量份数计，包括如下原料：
10~20份藿香、10~15份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药。
2.蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将中药原料超微粉碎，得中药超微粉；所述的中药原料为：10~20份藿香、10~15份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药；以上的“份”为重量份；
（2）在中药超微粉加水，调节pH值后添加复合生物酶Ⅰ进行酶解处理，将所获得的第一酶解液离心，得到第一酶解上清液；在残渣中加入复合生物酶Ⅱ，酶解残渣，获得第二酶解液，离心第二酶解液，得到第二酶解上清液；合并第一酶解上清液与第二酶解上清液，浓缩至其质量的1/3～3/4，灭菌；
（3）将（2）中灭菌后的浓缩液接种蜡样芽孢杆菌进行发酵，12～48h后收集发酵液，经过滤、灌装得到成品。
3.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（1）中，将中药原料混合均匀，采用超微粉碎机粉碎20~35min，至细度大于1500目。
4.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（2）中，中药超微粉与水的重量比为1:9；调节pH至4.5~5.5；添加0.1wt%的复合生物酶Ⅰ；50～60℃下搅拌酶解2~3h；
其中，复合生物酶Ⅰ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种。
5.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（2）中，酶解离心条件为：以转速4000r/min离心10min；
在残渣中加入0.1%（重量）复合生物酶Ⅱ；50~60℃搅拌酶解2~3h，得二次酶解液；
其中，复合生物酶Ⅱ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种。
6.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（2）中，浓缩条件为：70℃减压旋转蒸发浓缩至其质量的1/2。
7.如权利要求2所述的一种蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（3）中，发酵步骤为：合并的酶解液经121℃巴氏灭菌30min后，向其按1：0.5-1.0的通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种5%~15%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速150~300rpm，，发酵温度35~40℃，时间24～48小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，结束发酵。
8.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，其特征在于，（3）中，发酵液经膜过滤收集清液，加入防腐剂包含但不限于苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、纳他霉素和丙酸钙中的任一种，再加入101果汁澄清剂，低速搅拌2h后，经过10000r/min离心5-10min，上清液收集灌装，经85℃巴氏灭菌15min。
9.如权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌发酵的抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将中药原料超微粉碎，得中药超微粉；所述的中药原料为：10~20份藿香、10~15份葛根、10~24份陈皮、4~8份白芷、8~12份茯苓、10~20份大枣、5~15份黄芩、10~15份白芍药；以上的“份”为重量份；
（2）在中药超微粉加水，调节pH值后添加复合生物酶Ⅰ进行酶解处理，将所获得的第一酶解液离心，得到第一酶解上清液；在残渣中加入复合生物酶Ⅱ，酶解残渣，获得第二酶解液，离心，得到第二酶解上清液，合并第一酶解上清液与第二酶解上清液，浓缩至其质量的1/3～3/4，灭菌；
中药超微粉与水的重量比为1:9；调节pH至4.5~5.5；添加0.1wt%的复合生物酶Ⅰ；50～60℃下搅拌酶解2~3h；
复合生物酶Ⅰ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种；
两次酶解离心条件为：以转速4000r/min离心10min；
在残渣中加入0.1%（重量）复合生物酶Ⅱ；于50~60℃下搅拌酶解2~3h，得二次酶解液；
复合生物酶Ⅱ为酸性纤维素酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶中的至少两种；
浓缩条件为：70℃减压旋转蒸发浓缩至其质量的1/2；
（3）合并的酶解液经121℃巴氏灭菌30min后，向其按1：0.5-1.0的通气比（v/v/m）通入无菌空气，并接种5%~15%蜡样芽孢杆菌，搅拌转速150~300rpm，，发酵温度35~40℃，时间24～48小时，至蜡样芽孢杆菌芽孢形成率90%以上，结束发酵，经过滤、灌装得到成品。
10.通过权利要求2所述的方法制备获得的抗腹泻中药组合物在动物饲料中的应用。
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