CN114150011A - 异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母及构建方法，构建方法为：向酿酒酵母中导入优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS与SmKSL、优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24与CYP76AK6、优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR和优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5；得到重组酿酒酵母，实验证明，本发明的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母使鼠尾草酸的产量提高，重组菌1鼠尾草酸产量为2.85mg/L，重组菌2鼠尾草酸产量为7.52mg/L，重组菌3鼠尾草酸产量为20.32mg/L，本发明的方法可以人工合成鼠尾草酸。

Description

异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母及构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母及构建方法。
背景技术
萜类化合物是一类生物次生代谢的产物，其中许多物质具有特殊的生理功能或较高的经济价值，如抗肿瘤药物、抗炎镇痛药物、高级香料、环保杀虫剂和除草剂等。异戊二烯(C5)是萜类化合物结构构成的基本单元。根据构成萜类化合物基本单位异戊二烯单元的数量，可将常见的萜类化合物分为半萜类(1单元，C5)、单萜类(2单元，C10)、倍半萜类(3单元，C15)、二萜类(4单元，C20)、酯萜类(5单元，C25)、三萜类(6单元，C30)。
鼠尾草酸(Carnolic acid，简称CA)是一种三环二萜酚类物质，化学式为C20H28O4，分子量为332.4339，是一种无色至淡黄色粉末晶体，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。目前在三叶鼠尾草(Salvia trijuga Diels)、南欧丹参(Salvia sclarea)鼠尾草(Salvia japonica Thunb)中发现CA的存在，CA由于具有良好的药理和生物活性，如抗炎、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗神经退行性疾病等，已引起人们的极大兴趣。同时，由于CA具有安全无毒并且耐高温等特性，所以也被广泛应用于很多其他的领域，如医药化妆品领域、食品添加剂、保健品和香料等行业。鼠尾草酸目前主要来源于植物提取，但植物来源有限，部分植物生长周期长，不能满足市场需求，导致部分药物价格高。化学方法可以合成具有有效供应策略的产品，但产生的废液对环境有一定危害，具有环保问题。因此利用合成生物学技术构建微生物细胞工厂合成鼠尾草酸具有重要价值及意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母。
本发明的第二个目的是提供第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌产铁锈醇和鼠尾草酸中的应用。
本发明的第四个目的是提供第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌。
本发明的第五个目的是提供第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌的构建方法。
本发明的第六个目的是提供第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌产铁锈醇和鼠尾草酸中的应用。
本发明的第七个目的是提供第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌。
本发明的第八个目的是提供第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌的构建方法。
本发明的第九个目的是提供第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母重组菌产铁锈醇和鼠尾草酸中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：向酿酒酵母中导入优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS、优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmKSL、优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AK6、优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR和优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5；得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌1；
所述优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmKSL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AK6的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5由细胞色素SpCytb5的C端截短28个氨基酸序列获得；
所述细胞色素SpCytb5核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
所述酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1a。
第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
向上述重组菌1中导入过氧化氢酶编码基因ScCTT1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌2；过氧化氢酶编码基因ScCTT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
向上述重组菌2中导入内质网折叠促进因子HAC1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌3；所述内质网折叠促进因子HAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法构建的第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌1。
第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
上述第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法构建的第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌2。
第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
上述第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法构建的第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌3。
第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
本发明的优点：
实验证明，本发明的方法获得的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母使鼠尾草酸的产量提高，重组菌1鼠尾草酸产量为2.85mg/L，重组菌2鼠尾草酸产量为7.52mg/L，重组菌3鼠尾草酸产量为20.32mg/L，本发明的方法可以人工合成鼠尾草酸。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所用的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1a(ATCC：208352)(购买时间，2016.6，网址：https://www.atcc.org/)为出发菌株。
酿酒酵母的公开是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限定。其它酿酒酵母也可以用于本发明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、第一种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母(重组菌1)的构建方法(1)模块购建
根据NCBI上提供的Salvia miltiorrhiza来源的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS(GenBank:EU003997.1)和SmKSL(GenBank:EF635966.2)、铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1(GenBank:JX422213)、细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR(GenBank:CBX24555)与Salvia pomifera来源的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24(GenBank:KT157044.1)与CYP76AK6(GenBank:KT157045.1)。细胞色素b5编码基因SpCytb5来源于Sci Rep，2017，7,8855(https://doi.org/10.1038/s41598-017-09592-5)，针对酿酒酵母进行密码子优化后通过化学合成的方法(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)合成：
优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS(SEQ ID NO.1)、优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmKSL(SEQ ID NO.2)、优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1(SEQ ID NO.3)、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24(SEQ ID NO.4)、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AK6(SEQ ID NO.5)、优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR(SEQ ID NO.6)和优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5由细胞色素SpCytb5的C端截短28个氨基酸序列获得；得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌1；所述细胞色素SpCytb5核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
利用表1引物对及模板分别
PCR扩增URA3U，PPGK1，SmCPS，TADH2片段，融合获得URA3U-PPGK1-SmCPS-TADH2；PCR扩增将片段PTDH3，SmKSL，TTDH2，片段，融合获得PTDH3-SmKSL-TTDH2；
PCR扩增片段PPGK1，SmCPR，t28SpCytb5，TCYC1片段，融合获得PPGK1-SmCPR～GGG～t28SpCytb5-TCYC1；
PCR扩增片段PTEF1，CYP76AH24，TTDH2片段，融合获得PTEF1-CYP76AH24-TTDH2；
PCR扩增片段PTDH3，CYP76AK6，TADH2，PTDH3片段，融合获得PTDH3-CYP76AK6-TADH2-PTDH3；
PCR扩增片段CYP76AH1，TADH2，HIS3，URA3D片段，融合获得CYP76AH1-TADH2-HIS3-URA3D。
表格1重组菌1构建引物及模板
Figure BDA0003360017010000041
Figure BDA0003360017010000051
(2)感受态制备
酿酒酵母W303-1a在YPD液体培养基中培养12h后取300μL加入至3mL新鲜YPD液体培养基中，培养5h。3000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用灭菌的ddH2O洗涤菌体，在3000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂水溶液加入菌体中，轻轻吹打使细胞悬浮均匀，室温下放置5min后在3000rpm常温离心5min收集菌体，制备酵母感受态细胞。
(3)酵母转化
将鲑鱼精DNA(市售，Solarbio，10mg/ml)进行开水煮沸5min，然后快速放入准备好的冰上冷却。向步骤(2)获得的酵母感受态细胞中加入240μL PEG3350(50％W/V，50gPEG3350/100ml水)，36μL 1.0M醋酸锂水溶液，10μL煮沸后冷却的鲑鱼精DNA，加入URA3U-PPGK1-SmCPS-TADH2，PTDH3-SmKSL-TTDH2，PPGK1-SmCPR～GGG～t28SpCytb5-TCYC1，PTEF1-CYP76AH24-TTDH2，PTDH3-CYP76AK6-TADH2-PTDH3，CYP76AH1-TADH2-HIS3-URA3D片段各200ng，补水至总体积360μL，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mL YPD液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂布在缺失组氨酸的SC培养基平板进行筛选，获得重组菌1。
实施例2、第二种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母(重组菌2)的构建方法(1)模块购建
向重组菌1中导入过氧化氢酶编码基因ScCTT1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌2。(过氧化氢酶编码基因ScCTT1的来源，酿酒酵母Saccharomycescerevisiae)
所述过氧化氢酶编码基因ScCTT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
利用表2引物对及模板分别PCR扩增METU，hpnMX6，PTDH3，ScCTT1，TADH2，METD片段，融合获得METU-hpnMX6-PTDH3-ScCTT1-TADH2-METD。
表2重组菌2构建引物及模板
Figure BDA0003360017010000061
(2)重组菌1感受态制备
重组菌1感受态制备方法参考实施例1中(2)的方法。
(3)酵母转化
将鲑鱼精DNA(市售，Solarbio，10mg/ml)进行开水煮沸5min，然后快速放入准备好的冰上冷却。向重组菌1感受态细胞中加入240μL PEG3350(50％W/V，50g PEG3350/100ml水)，36μL 1.0M醋酸锂水溶液，10μL煮沸后冷却的鲑鱼精DNA，加入200ng METU-hpnMX6-PTDH3-ScCTT1-TADH2-METD片段，补水至总体积360μL，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mL YPD液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂布在添加潮霉素的YPD固体培养基平板进行筛选，获得重组菌2。
实施例3、第三种异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母(重组菌3)的构建方法
向重组菌2中导入内质网折叠促进因子HAC1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌3。
所述内质网折叠促进因子HAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。基因来源酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)
利用表3引物对及模板分别PCR扩增TRP1U，PPGK1，HAC1，TADH2，MET17，TRP1D片段，融合获得TRP1U-PPGK1-HAC1-TADH2-MET17-TRP1D。
表格3重组菌3构建引物及模板
Figure BDA0003360017010000071
(2)重组菌2感受态制备
重组菌2感受态制备方法参考实施例1中(2)的方法。
(3)酵母转化
将鲑鱼精DNA(市售，Solarbio，10mg/ml)进行开水煮沸5min，然后快速放入准备好的冰上冷却。向重组菌2感受态细胞中加入240μL PEG3350(50％W/V，50g PEG3350/100ml水)，36μL 1.0M醋酸锂水溶液，10μL煮沸后冷却的鲑鱼精DNA，200ng TRP1U-PPGK1-HAC1-TADH2-MET17-TRP1D片段，补水至总体积360μL，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mL YPD液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂布在缺失甲硫氨酸的SC培养基平板进行筛选，获得重组菌3。
实施例4、重组菌生产鼠尾草酸
(1)重组菌培养和产物提取
将实施例1、2、3中得到的重组酿酒酵母菌株重组菌1、重组菌2、重组菌3连同W303-1a，在SC培养基上活化。分别挑单菌落于2ml YPD液体培养基中制备发酵种子液(30℃,220rpm，16h)，离心收集菌体，转移至含30mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，调节OD至0.5进行培养(30℃，220rpm)，4d后，取2ml菌液离心收集细胞，加入与菌体等体积石英砂，1mL正己烷，震荡30min，然后在12000rpm常温条件下离心2min，取上清过0.22mm有机膜后备用。
(2)液质联用测定鼠尾草酸
液相条件：流动相A和B分别为0.1％的磷酸水溶液和纯乙腈溶液，洗脱梯度程序为：0-35min 60％B，流速1.0mL/min；35-60min,90％B，流速1.7mL/min；60-90min，60％B，流速1.0mL/min；色谱柱：依利特C18(4.6mm×250mm)；检测波长230nm，进样量10μL。
质谱条件：离子源，ESI，负离子模式；扫描方式，一级全扫描。
(3)检测结果
A.酿酒酵母W303-1a没有检测到鼠尾草酸；
B.重组菌1：
提取重组菌1发酵产物，可以检测到少量鼠尾草酸的产生，其产量为2.85mg/L；
C.重组菌2：
提取重组菌2发酵产物，可以检测到鼠尾草酸的产生，其产量为7.52mg/L；
D.重组菌3：
提取重组菌3发酵产物，可以检测到鼠尾草酸的产生，其产量为20.32mg/L；
(4)实施例所用培养基
YPD液体培养基：葡萄糖终浓度为20g/L，酵母浸粉终浓度为10g/L，蛋白胨终浓度为20g/L，以蒸馏水配制。YPD固体培养基则在YPD液体培养基中加20g/L的琼脂粉。
SC培养基：葡萄糖终浓度为2g/L，无氨基酵母氮源(YNB)终浓度为6.7g/L，氨基酸混合物终浓度为0.2g/L，20g/L的琼脂粉,以蒸馏水配制，缺失氨基酸混合物指去掉氨基酸混合物中的对应成份。
氨基酸混合物：甘氨酸，2.0g；丙氨酸，2.0g；甲硫氨酸，2.0g；赖氨酸，2.0g；精氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；天冬酰胺，2.0g；天冬氨酸，2.0g；苯丙氨酸，2.0g；半胱氨酸，2.0g；脯氨酸，2.0g；酪氨酸，2.0g；谷氨酸，2.0g；缬氨酸，2.0g；苏氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；异亮氨酸，2.0g；肌醇，2.0g；谷氨酰胺，2.0g；对氨基苯甲酸0.2g；腺嘌呤，0.5g；亮氨酸10g；甲硫氨酸，2g；色氨酸，2g；组氨酸，2g；尿嘧啶，2g。
序列表
<110> 天津大学
<120> 异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母及构建方法
<160> 77
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcctctt tgtcctctac cattttgtct agatctccag ctgctagaag aagaattact 60
ccagcttctg ctaaattgca tagaccagaa tgttttgcta cttctgcttg gatgggttcc 120
tcttctaaaa acttgtcttt gagctaccag ctgaaccaca agaaaatttc tgttgctact 180
gttgatgccc cacaagttca tgatcacgat ggtactactg ttcatcaagg tcatgatgcc 240
gttaagaaca ttgaagatcc aatcgagtac atcagaacct tgttgagaac tactggtgat 300
ggtagaattt ccgtttctcc atatgatact gcttgggttg ctatgatcaa agatgttgaa 360
ggtagagatg gtccacaatt cccatcttca ttggaatgga tcgtccaaaa tcaattggaa 420
gatggttctt ggggtgacca aaagttgttt tgtgtttacg atagactggt caacaccatt 480
gcttgtgttg ttgctttgag atcttggaat gttcatgccc ataaggttaa gagaggtgtc 540
acttacatca aagaaaacgt cgacaaattg atggaaggta acgaagaaca tatgacctgt 600
ggttttgaag ttgtctttcc agctttgttg caaaaggcta agtctttggg tattgaggat 660
ttgccatatg attcaccagc tgttcaagaa gtttaccacg ttagagaaca gaagttgaag 720
agaatcccat tggaaatcat gcacaagatc cctactagct tgttgttctc tttggaaggt 780
ttggaaaatt tggactggga caagttgttg aagttgcaat ctgctgatgg ttcctttttg 840
acttctccat cttctactgc tttcgccttt atgcaaacta aggacgaaaa gtgctaccaa 900
ttcatcaaga acactatcga cacttttaat ggtggtgctc cacatactta tccagttgat 960
gtttttggta gattgtgggc cattgataga ttgcaaagat tgggtatctc caggtttttc 1020
gaaccagaaa ttgctgattg cttgtcccat attcataagt tctggactga taagggtgtg 1080
ttctctggta gagaatctga attctgcgat atcgatgata cctctatggg tatgagattg 1140
atgagaatgc atggttacga tgttgatcca aacgtcttga gaaacttcaa gcaaaaggac 1200
ggtaaattct cttgttacgg tggtcaaatg atcgaatctc catctccaat ctacaacttg 1260
tacagagctt cccaattgag atttccaggt gaagaaatct tggaggatgc taagagattt 1320
gcctacgatt tcttgaaaga gaagttggct aacaaccaga tattggataa gtgggttatc 1380
tctaaacact tgccagacga aatcaagttg ggtttagaaa tgccatggtt ggctactttg 1440
ccaagagttg aagctaagta ctacattcaa tattacgccg gttctggtga tgtttggatt 1500
ggtaaaacac tgtacagaat gcccgaaatc tctaacgata cttaccatga tttggccaag 1560
accgatttca aaagatgcca agctaaacac caattcgagt ggttgtatat gcaagaatgg 1620
tacgaatctt gcggtatcga agaattcggt atctctagaa aggacctgtt gttgtcttac 1680
tttttggcta ccgcttccat tttcgaattg gaaagaacta acgaaagaat tgcttgggcc 1740
aagtctcaaa ttattgccaa gatgattacc tcgttcttca acaaagaaac cacttccgaa 1800
gaagataaga gagccttgtt gaacgaattg ggtaacatta acggtttgaa cgatacaaat 1860
ggtgcaggta gagaaggtgg tgctggttct attgctttag ctactttgac tcaattcttg 1920
gagggtttcg atagatacac cagacatcaa ttgaagaatg cttggtctgt ttggttgacc 1980
caattgcaac atggtgaagc tgatgatgct gaattattga ctaacacctt gaacatttgc 2040
gctggtcata ttgccttcag ggaagaaatt ttagctcaca atgagtacaa ggccctgtct 2100
aacttgactt ctaaaatctg tagacagctg agcttcatcc agtccgaaaa agaaatgggt 2160
gtagaaggtg aaattgccgc caaatcttcc attaagaaca aagaactgga agaggacatg 2220
cagatgttgg ttaagttggt tttggaaaag tacggtggta tcgacagaaa cattaagaag 2280
gcttttttgg ctgttgccaa gacctattac tatagagctt atcatgctgc cgataccatt 2340
gatacccata tgtttaaggt tttgtttgag ccagttgcct aa 2382
<210> 2
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtccttgg cttttaatcc agctgctact gctttttctg gtaatggtgc tagatccaga 60
agagaaaatt tcccagtcaa acacgttacc gttagaggtt ttccaatgat cactaacaag 120
tcatccttcg ctgttaagtg taacttgact actactgact tgatgggtaa gattgccgaa 180
aagtttaagg gcgaagattc taattttcca gctgccgctg ctgttcaacc agctgctgat 240
atgccatcta acttgtgtat tatcgacacc ttgcaaagat tgggtgttga cagatacttc 300
agatccgaaa ttgataccat cttggaagat acctacagat tgtggcagag aaaagaaaga 360
gccattttct ctgataccgc tattcatgct atggctttta gactgttgag agtcaaaggt 420
tacgaagtct cttctgaaga attggctcca tatgctgatc aagaacatgt tgacttgcaa 480
accattgaag ttgctaccgt tattgagttg tatagagctg ctcaagaaag aaccggtgaa 540
gatgaatctt ccttgaaaaa attgcatgct tggactacca ccttcttgaa gcaaaagttg 600
ttgaccaatt ccattccaga caagaagttg cataagttgg ttgagtacta cctgaagaac 660
taccacggta ttttggatag aatgggtgtc agacaaaact tggacttgta cgatatctct 720
tactacagaa cttctaaggc tgccaacaga ttctctaatt tgtgctctga agatttcttg 780
gctttcgcta gacaagattt caacatttgc caagctcaac accagaaaga attgcaacaa 840
ttgcagagat ggtacgctga ttgcaaattg gatactttga agtacggtag agatgttgtt 900
agagtcgcta actttttgac ctccgctatt attggtgatc cagaattgtc tgatgtcaga 960
atcgttttcg ctcaacacat cgttttggtt accagaatcg atgatttctt cgatcacaga 1020
ggttccagag aagaatccta caagattttg gagttgatca aagagtggaa agaaaaacca 1080
gcagctgaat acggttcaga agaagtcgaa attttgttca ccgctgttta caacaccgtt 1140
aacgaattgg ctgaaagggc tcatgttgaa caaggtagat ctgttaagga cttcctgatt 1200
aagttgtggg ttcagatctt gtccatcttc aagagagaat tagatacctg gtctgatgat 1260
actgctttga ccttggatga ttacttgtct gcttcttggg tttctattgg ttgcagaatc 1320
tgcatcttga tgtccatgca attcatcggt atcaagttgt ctgacgagat gttgctatcc 1380
gaagaatgta ttgatttgtg caggcacgtt agtatggttg ataggttgtt gaacgatgtc 1440
cagacctttg aaaaagagcg taaagaaaac accggtaact ctgttacttt gttgttggct 1500
gctaacaagg acgattcttc attcacagaa gaagaagcca ttaggatcgc taaagaaatg 1560
gctgaatgta acagacgtca attgatgcaa atcgtttaca agaccggtac tatcttccca 1620
agacaatgta aggacatgtt tttgaaggtc tgcagaattg gttgttactt gtacgcttct 1680
ggtgatgaat tcacttctcc acaacaaatg atggaagata tgaagtcctt ggtctacgaa 1740
ccattgacta ttcatccatt ggttgccaac aatgtcagag gtaagtaa 1788
<210> 3
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggattctt ttccattgtt ggctgctttg ttttttattg ctgctactat tacttttttg 60
tcttttagaa gaagaagaaa tttgccgcct ggtccatttc catatccaat tgttggtaat 120
atgttgcaat tgggtgctaa tccacatcaa gtttttgcta aattgtctaa aagatatggt 180
ccattgatgt ctattcattt gggttctttg tatactgtta ttgtttcttc tcctgaaatg 240
gctaaagaaa ttttgcatag acatggtcaa gttttttctg gtagaactat tgctcaagct 300
gttcatgctt gtgatcatga taaaatttct atgggttttt tgcctgttgc ttctgaatgg 360
agagatatga gaaaaatttg taaagaacaa atgttttcta atcaatctat ggaagcttct 420
caaggtttga gaagacaaaa attgcaacaa ttgttggatc atgttcaaaa atgttctgat 480
tctggtagag ctgttgatat tagagaagct gcttttatta ctactttgaa tttgatgtct 540
gctactttgt tttcttctca agctacggaa ttcgactcta aagctactat ggaattcaaa 600
gagattattg aaggtgttgc tactattgtt ggtgttccaa attttgctga ttattttcca 660
attttgagac catttgatcc acaaggcgtt aagaggagag ctgatgtttt ttttggtaag 720
ttgttggcga agattgaggg ttaccttaat gaaagattgg aatctaaaag agcgaaccca 780
aatgcaccta agaaagacga ttttctcgag atagtggttg atattattca agccaacgaa 840
ttcaagttaa agactcacca ttttactcat ttgatgttgg atttgtttgt tggtggttct 900
gatactaata ctacttctat tgaatgggct atgtctgaat tggttatgaa tcctgataaa 960
atggctagat tgaaagctga attgaaatct gttgctggtg atgaaaaaat tgttgatgaa 1020
tctgctatgc caaaattgcc atatttgcaa gctgttatta aagaagttat gagaattcat 1080
cctcctggtc cattgttgtt gccaagaaaa gctgaatctg atcaagaagt taatggttat 1140
ttgattccaa aaggtactca aattttgatt aatgcttatg ctattggtag agatccatct 1200
atttggactg acccggagac ttttgatcct gaacgctttt tagataacaa aattgatttt 1260
aagggtcaag attatgaatt gttgccattt ggttctggta gaagagtttg tcctggtatg 1320
ccattggcta ctagaatttt gcatatggct actgctactt tggttcataa ttttgattgg 1380
aaattggaag atgattctac tgctgctgct gatcatgctg gtgaattgtt tggtgttgct 1440
gttagaagag ctgttccatt gagaattatt ccaattgtta aatcttaa 1488
<210> 4
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgttgcaat tgggttctca accacacgaa acttttgcta agctgtctaa aaagtacggc 60
ccattgatgt ctattcactt gggttcatta tacaccgtca tcgtttcttc accagaaatg 120
gccaaagaaa tcatgcataa gtacggtcaa gttttctccg gtagaactat tgctcaagca 180
gttcatgctt gtgatcacga taagatttct atgggttttt tgccagttgg tgctgaatgg 240
cgtgatatga gaaaaatctg caaagaacag atgttctccc accagtctat ggaagattca 300
caaaacttga gaaagcagaa gttgcaacag ttgttggatt acacccaaaa gtgttctgaa 360
gaaggtagag gtatcgatat tagagaagct gctttcatta ccaccttgaa cttgatgtct 420
gctaccttgt tttctatgca agctaccgaa ttcgattcca aggttaccat ggaattcaaa 480
gaaattatcg aaggtgttgc ctccatagtt ggtgttccaa attttgctga ttacttccca 540
attttgaggc catttgatcc acaaggtgtt aagagaaggg ctgatgttta cttcggtaga 600
ttattgggtt tgatcgaggg ttacttgaac gaaaggattg aattcagaaa ggctaatcca 660
aacgctccaa agaaggatga ttttttggaa accttggttg atgctttgga tgccaaagac 720
tacaagttga aaactgaaca tttgacccac ctgatgttgg atttgtttgt tggtggttct 780
gaaacttcca ccactgaaat tgaatggatc atgtgggaat tagttgcctc tccagaaaaa 840
atggctaagg ttaaggctga attgaagtct gttatgggtg gtgaaaaggt tgttgacgaa 900
tctatgatgc caagattgcc atacttgcaa gctgttgtca aagaatccat gagattgcat 960
ccaccaggtc ctttgttgtt gccaagaaaa gctgaatctg atcaagttgt caacggctac 1020
ttgattccaa aaggtacaca agttttgatt aacgcttggg ctatgggtag agattcttct 1080
ttgtggaaaa acccagattc cttcgaacca gaaagattct tggatcaaaa gatcgacttc 1140
aagggtactg actacgaatt gattcctttt ggttctggta gaagagtttg tccaggtatg 1200
ccattggcta atagaatctt gcatactgtt accgccactt tggttcataa tttcgattgg 1260
aaattggaaa gaccagaagc taacgacgct cataagggtg ttttgtttgg ttttgctgtt 1320
agaagggcag ttccattgaa aatcgttcca atcaaggctt aa 1362
<210> 5
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcaggtct tgatcttgtt gtctttggct tttttggctt cttgcgttgt tgcttattct 60
agacgtagac caggtggtag aggtgctggt gatttgccac caggtccacc aagattgcca 120
attattggta atatgttgca gttgggtcaa aacccacata agtctttagc tcatttggct 180
aaaacttacg gcccattgat gtctttgaag ttgggtaatc aattcgtcgt cgttgtttct 240
tcaccagaaa tggctagaga agtcttgcaa agacatggtt tggttttctc aagaccattc 300
actccaattg ccgttcaaat tttaggtcac ggtgaagtct ctatgaacat gttgccagct 360
acttctccaa tttggaagaa gattagaaag atcgccaggg aaaagttgtt ctctaatcaa 420
gctttacatg ctaccagagc cgttagaaga gaaagattga gaaaattggc tgactacgtt 480
ggtagatgtt ctggtgctat gaatgttggt gaagctactt tcactaccat gtccaatttg 540
atgttcgcta ccttgttctc cgttgaaatt actcaatacg ccgattctga ttccgattct 600
ggtgttaaca aaaagttcag agaacacgtt aacgccatta ctagatatat gggtgttcca 660
aacattgccg atttcttccc aatttttgct ccatttgatc cacagggttt gagaagaaaa 720
ttgacctatc atctgggttc cttgttggaa ttggttcagt ctttgattga acagagattg 780
agagctagaa acgctgctac ttacagaaag aaggatgact tcttggaaat gctgttggat 840
ttgtctgaag gtgatgaata cgacttgtcc gtcaacgaaa tcaaacattt gtgcgtcgat 900
ttgattatcg ctggttctga tacttctgct gctactactg aatgggctat ggttgaattg 960
ctattgcatc cagataagtt ggctaagttg aaggctgaat tgaagtctgt tgttggtgac 1020
aagtccatca tcgaagaatc cgatatttct aagttgccat acttgcaagc taccgtcaaa 1080
gaagttttga gatatcatcc agctgctcca ttattggctc cacatttggc tgaagaagaa 1140
actcaattga acggttacat catcccaaag aacactaaga tcttcatcaa cgattggacc 1200
atctcaagag atccatctat ttggaaaaac ccagaaatgt tcgaacccga aagattcttg 1260
aacaacgata ttgatttctg cggtcagcac tttgaattga ttccatttgg ttccggtaga 1320
agaatttgtc caggtttgcc attggcttct agaatgttgc attgcatggt tgctactttg 1380
tgccataatt tcgactggga attagaaaag ggtactgagt ctaaacaatt gcaaagagag 1440
gacgtttttg gtttggcctt gcaaaaaaag attccattga gagccattcc aatcaaggtc 1500
tga 1503
<210> 6
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaaccat cttctaaaaa attgtctcca ttggatttta ttactgctat tttgaaaggt 60
gatattgaag gtgttgctcc aagaggtgtt gctgctatgt tgatggaaaa tagagatttg 120
gctatggttt tgactacttc tgttgctgtt ttgattggtt gtgttgttgt tttggcttgg 180
agaagaactg ctggttctgc tggtaaaaaa caattgcaac caccaaaatt ggttgttcca 240
aaacctgctg ctgaacctga agaagctgaa gatgaaaaaa ctaaagtttc tgtctttttt 300
ggtactcaaa ctggtactgc tgaaggtttt gctaaagctt ttgctgaaga agctaaagct 360
agatatccac aagctaaatt taaagttatt gatttggatg attatgctgc tgatgatgat 420
gagtatgaag aaaaattgaa aaaggaatct ttggcttttt tctttttggc ttcttatggt 480
gatggtgaac caactgataa tgctgctaga ttttataaat ggtttactga aggtaaagat 540
agagaagatt ggttgaaaaa tttgcagtat ggtgtttttg gtttgggtaa tagacagtat 600
gaacacttca acaagattgc tattgttgtt gatgatttaa ttactgaaca aggtggtaaa 660
aaattggttc ctgttggttt gggtgatgat gatcaatgta ttgaagatga tttttctgct 720
tggagagaat tggtttggcc tgaattggat aaattgttga gaaatgaaga tgatgctact 780
gttgctactc catatactgc tgttgttttg caatatagag ttgttttgca tgatcaaact 840
gatggtctga ttactgaaaa tggttctcca aatggtcatg ctaatggtaa tactatttat 900
gatgctcaac atccatgtag agctaatgtt gctgttagaa gagaattgca tactcctgct 960
tctgatagat cttgtactca tttggaattt gatacttctg gtactggttt ggtttatgaa 1020
actggtgatc atgttggtgt ttattgtgaa aatttgttgg aaaatgttga agaagctgaa 1080
aagcttttga atttgtctcc acaaacttat ttttctgttc atactgataa tgaagatggt 1140
actccattgt ctggttcttc tttgccacca ccatttccac catgtacttt gagaactgct 1200
ttgactaaat atgctgattt gatttctatg cctaaaaaat ctgttttggt tgctttggct 1260
gaatatgctt ctaatcaatc tgaagctgat agattgagat atttggcttc tcctgatggt 1320
aaagaagaat atgctcaata tattgttgct tctcaaagat ctttgttgga agttatggct 1380
gaatttccat ctgctaaacc accattgggt gtcttttttg ctgctattgc tccaagattg 1440
caaccaagat tttattctat ttcttcttct ccaaaaattg ctccaactag agttcatgtt 1500
acttgtgctc tagtgtatga caaaactcca actggtagaa ttcataaagg tatttgttct 1560
acttggatta aaaatgctgt tccattggaa gaatcttctg attgttcttg ggctccaatt 1620
tttattagaa attctaattt taaattgcct gctgatccaa aagttccaat tattatggtt 1680
ggtcctggta ctggtttggc tccatttaga ggttttttgc aagaaagatt ggctttgaaa 1740
gaatctggtg ctgaattggg tcctgctatc ttgttctttg gctgtagaaa tagaaagatg 1800
gactttattt atgaagatga actcaattct tttgttaaag ttggtgctat ttctgaattg 1860
attgttgctt tttctagaga aggtcctgct aaagaatatg ttcaacataa aatgtctcaa 1920
agagcttctg atatttggaa aatgatttct gatggtggtt atatgtatgt ttgtggtgat 1980
gctaaaggta tggctagaga tgttcataga actttgcata ctattgctca agaacaaggt 2040
tctttgtctt cttctgaagc tgaaggtatg gttaagaatt tgcaaactac tggtagatat 2100
ttgagagatg tttggtaa 2118
<210> 7
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcaaaat ctcatacttt tgaagaagtt gcaaaacata acaagactaa agattgttgg 60
ttgattattt ctggtaaagt ttatgatgtt actccattta tggaagatca tcctggtggt 120
gatgaagttt tgttgtctgc tactggtaaa gatgctacta atgattttga agatgttggt 180
cattctgatt ctgctagaga aatgatggat aaatatttta ttggtgaaat tgatatggct 240
actgttccat tgaaaagatc ttatattgct ccacaacaac catcttataa tcctgataaa 300
actcctgaat ttgttattaa aattttgcaa tttttggttc cattgttgat tttgggtttg 360
gcttttgctg ttagattgta tactaaagaa aaataa 396
<210> 8
<211> 1689
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 8
atgaacgtgt tcggtaaaaa agaagaaaag caagaaaaag tttactctct acaaaacggt 60
tttccgtact ctcatcaccc atacgcttct caatactcaa gaccagacgg ccctatctta 120
ctgcaagact tccatctgct ggaaaatatt gcaagtttcg atagagaaag agttccggag 180
cgtgtagtcc atgccaaagg tggtggttgt agactggagt tcgaactaac agattctttg 240
agtgatatta catacgccgc tccataccag aatgtgggtt acaaatgtcc tggtcttgtt 300
cgtttttcca ccgttggtgg tgaaagtggt acaccagaca ctgcaagaga cccaagaggt 360
gtttctttta aattctatac cgagtggggg aaccatgact gggtcttcaa caatactccc 420
gtcttcttcc tcagagacgc tattaagttt cccgtattta ttcattcgca aaagagagac 480
cctcagtctc atctgaatca gtttcaggac actaccatat actgggatta tctaacattg 540
aatccggaat caatccatca aataacttac atgtttggtg atagaggtac tcctgcttcg 600
tgggctagta tgaacgcgta ctctggtcat tccttcatca tggtcaacaa agaaggtaag 660
gacacatatg tgcaattcca cgtcttgtcg gatactggtt ttgaaacctt gactggagat 720
aaggctgctg aactgtcagg ctcccaccct gattataatc aggcaaagct gttcactcaa 780
ttgcaaaatg gcgaaaagcc aaaatttaac tgttatgtgc aaacaatgac acccgaacaa 840
gcaactaagt tcaggtattc ggtaaatgac ctaacgaaaa tatggccaca caaggaattc 900
cctttgagaa aatttggtac catcacccta acggagaatg ttgacaatta tttccaagaa 960
attgaacaag ttgcattcag tccaacgaac acttgtatcc caggtattaa gccttctaat 1020
gattccgttc tacaagccag acttttctcc tatccagaca ctcaacgtca tagattggga 1080
gccaactatc agcaattgcc cgtcaacaga ccaagaaact tgggatgtcc atactccaaa 1140
ggtgattccc aatacactgc cgaacagtgt ccatttaaag cagtgaactt ccaaagggac 1200
ggcccaatga gttactacaa tttcggtcct gagccaaatt atatttccag tttaccaaat 1260
caaactctga aattcaaaaa tgaagacaac gacgaagtat ctgataagtt caaagggata 1320
gttcttgacg aagtaacaga agtttctgtg agaaaacagg aacaagacca aatcagaaac 1380
gagcatattg ttgatgccaa aattaatcaa tattactacg tttatggtat tagtccacta 1440
gacttcgaac agccaagagc tctatatgaa aaggtataca acgatgaaca gaagaaatta 1500
ttcgttcata acgttgtttg ccacgcttgt aagatcaaag atcctaaagt caaaaagaga 1560
gttacgcaat actttggttt gctaaacgaa gatttgggta aagtcattgc agaatgcttg 1620
ggagttcctt gggaacctgt tgaccttgaa ggttatgcca agacttggtc cattgcaagt 1680
gccaattaa 1689
<210> 9
<211> 717
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
atggaaatga ctgattttga actaactagt aattcgcaat cgaacttggc tatccctacc 60
aacttcaagt cgactctgcc tccaaggaaa agagccaaga caaaagagga aaaggaacag 120
cgaaggatcg agcgtatttt gagaaacaga agagctgctc accagagcag agagaaaaaa 180
agactacatc tgcagtatct cgagagaaaa tgttctcttt tggaaaattt actgaacagc 240
gtcaaccttg aaaaactggc tgaccacgaa gacgcgttga cttgcagcca cgacgctttt 300
gttgcttctc ttgacgagta cagggatttc cagagcacga ggggcgcttc actggacacc 360
agggccagtt cgcactcgtc gtctgatacg ttcacacctt cacctctgaa ctgtacaatg 420
gagcctgcga ctttgtcgcc caagagtatg cgcgattccg cgtcggacca agagacttca 480
tgggagctgc agatgtttaa gacggaaaat gtaccagagt cgacgacgct acctgccgta 540
gacaacaaca atttgtttga tgcggtggcc tcgccgttgg cagacccact ctgcgacgat 600
atagcgggaa acagtctacc ctttgacaat tcaattgatc ttgacaattg gcgtaatcca 660
gaagcgcagt caggtttgaa ttcatttgaa ttgaatgatt tcttcatcac ttcatga 717
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacgttgaaa ttgaggctac tgcg 24
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ataatatctg tgcgtgacct aatgcttcaa ctaac 35
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttgaagcat taggtcacgc acagatatta taacatc 37
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaagaggcc atcattgttt tatatttgtt gtaaaaagta g 41
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atataaaaca atgatggcct ctttgtcctc tac 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acataagaga tccgcttagg caactggctc aaacaaaa 38
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggagccagt tgcctaagcg gatctcttat gtctttacga tt 42
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attcaacgct agtattagaa ttatataact tgatgagatg agatgag 47
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agttatataa ttctaatact agcgttgaat gttagcgtca 40
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaagccaag gacatccatt ttgtttgttt atgtgtg 37
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacaaacaa aatggatgtc cttggctttt aatccag 37
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtaacttaag gagttattac ttacctctga cattgttggc 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtcagaggta agtaataact ccttaagtta ctttaatgat 40
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ataatatctg tgcgtgcgaa aagccaatta gtgtgatact aag 43
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tacgaagctt cagctgcaaa ttaaagcctt cgagcgtc 38
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agaagatggt tccatcattg ttttatattt gttgtaaaaa gtagataatt acttccttg 59
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaatataaaa caatgatgga accatcttct aaaaaattgt ctcc 44
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgagatttt gccataccac caccaacatc tctcaaatat ctaccagtag tttgc 55
<210> 28
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tatttgagag atgttggtgg tggtatggca aaatctcata cttttgaaga agttg 55
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taactaatta catgattatt caggagtttt atcaggatta taagatggtt 50
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaaactcctg aataatcatg taattagtta tgtcacgctt acattca 47
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgtgtgggg gatcacttgc aaattaaagc cttcgagcgt c 41
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcgaaggctt taatttgcaa gtgatccccc acacaccata 40
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acccaattgc aacatccatt ttgtaattaa aacttagatt agattgctat 50
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttaattacaa aatggatgtt gcaattgggt tctcaacca 39
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtaacttaa ggagttaaat ttaagccttg attggaacga ttttcaatg 49
<210> 36
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttccaatca aggcttaaat ttaactcctt aagttacttt aatgatttag tttttattat 60
taataattca tg 72
<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aacattcaac gctagtatgc gaaaagccaa ttagtgtgat actaag 46
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cactaattgg cttttcgcat actagcgttg aatgttagcg tcaa 44
<210> 39
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caagatcaag acctgcattt tgtttgttta tgtgtgttta ttcgaaacta agt 53
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cacacataaa caaacaaaat gcaggtcttg atcttgttgt cttt 44
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acataagaga tccgctcaga ccttgattgg aatggctc 38
<210> 42
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
attccaatca aggtctgagc ggatctctta tgtctttacg atttatagtt t 51
<210> 43
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aacattcaac gctagtatta gaattatata acttgatgag atgagatgag taa 53
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
caagatcaag acctgcattt tgtttgttta tgtgtgttta ttcgaaacta agt 53
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tggaaaagaa tccattttgt ttgtttatgt gtgtttattc gaaactaag 49
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acataaacaa acaaaatgga ttcttttcca ttgttggctg 40
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acataagaga tccgcttaag atttaacaat tggaataatt ctcaatggaa ca 52
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
attgttaaat cttaagcgga tctcttatgt ctttacgatt tatagtt 47
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgcaggcatg caagctagaa ttatataact tgatgagatg agatgagtaa atgac 55
<210> 50
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
taattggctt ttcgcgcttg catgcctgca ggtc 34
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tgtagagacc acatcagcac gtgatgaatt cgagctcg 38
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aattcatcac gtgctgatgt ggtctctaca ggatctgaca 40
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caagccttgt cccaaggcag cg 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggcaccttgt ccaattgaac ac 22
<210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctgggcctcc atgtctctgg attgtcacct tcaacaaatc tag 43
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aggtgacaat ccagagacat ggaggcccag aatacc 36
<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
attcaacgct agtatacagc agtatagcga ccagca 36
<210> 58
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcgctatact gctgtatact agcgttgaat gttagcgtca ac 42
<210> 59
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tcttttatgt tttgatttgt ttgtttatgt gtgtttattc gaaactaagt 50
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acataaacaa acaaatcaaa acataaaaga aaagaaaaaa attaaattga ataagtcag 59
<210> 61
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acataagaga tccgcacttt ggtaagatat tattataaca gaaagaattt aaagttttct 60
<210> 62
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atatcttacc aaagtgcgga tctcttatgt ctttacgatt tatagtt 47
<210> 63
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
actcattacg cacactagaa ttatataact tgatgagatg agatgagtaa atgac 55
<210> 64
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tctcatcaag ttatataatt ctagtgtgcg taatgagttg taaaattatg tataaacc 58
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgaggagaa ctagtatgtc ctgg 24
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggaagaggag tagggaatat tactggc 27
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tgtgggggat cacttctgca agccgcaaac tttcac 36
<210> 68
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gtttgcggct tgcagaagtg atcccccaca caccata 37
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atcagtcatt tccatcattg ttttatattt gttgtaaaaa gtagataatt acttccttg 59
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
aaatataaaa caatgatgga aatgactgat tttgaactaa ctagtaattc 50
<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acataagaga tccgcctgga ttacgccaat tgtcaagatc 40
<210> 72
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
attggcgtaa tccaggcgga tctcttatgt ctttacgatt tatagtt 47
<210> 73
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aacccttgca tccgatagaa ttatataact tgatgagatg agatgagtaa atgac 55
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
agttatataa ttctatcgga tgcaagggtt cgaatc 36
<210> 75
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cgttgttatt tgtgcactgt tctttgatgt tagaacaatt taggttca 48
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tgtagagacc acatcactgt tctttgatgt tagaacaatt taggttc 47
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cattgatgag gcaacgctaa ttatcaac 28

Claims (10)

1.异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：向酿酒酵母中导入优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS、优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmKSL、优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24、优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AK6、优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR和优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5；得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌1；
所述优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmCPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化的次丹参酮二烯合酶编码基因SmKSL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化的铁锈醇合酶编码基因CYP76AH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AH24的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述优化的鼠尾草酸合酶编码基因CYP76AK6的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因SmCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述优化后并截短的细胞色素b5编码基因t28SpCytb5由细胞色素SpCytb5的C端截短28个氨基酸序列获得；
所述细胞色素SpCytb5核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是所述酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1a。
3.异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向权利要求1获得的重组菌1中导入过氧化氢酶编码基因ScCTT1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌2；
所述过氧化氢酶编码基因ScCTT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向权利要求3获得的重组菌2中导入内质网折叠促进因子HAC1，得到异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母，简称重组菌3；
所述内质网折叠促进因子HAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.权利要求1或2的方法构建的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母。
6.权利要求5的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
7.权利要求3方法构建的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母。
8.权利要求7的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
9.权利要求4方法构建的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母。
10.权利要求9的异源合成鼠尾草酸的重组酿酒酵母发酵产铁锈醇和鼠尾草酸的应用。
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