CN114134198A - 用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法，所述试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液；其中，所述渗透缓冲液包括以下组分：ε‑聚赖氨酸、十二烷基‑β‑D‑麦芽糖苷、甘氨酸；所述荧光染色液中染色组分选自荧光素二乙酸酯、5(6)‑羧基‑2',7'‑二氯荧光素二乙酸酯、5‑氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)‑羧基荧光素二乙酸酯、6‑羧基荧光素二乙酸酯、5‑羧基荧光素二乙酸酯、5‑硝基‑二乙酸荧光素和6‑硝基‑二乙酸荧光素中的一种或几种。本发明的试剂利用广谱抑菌剂ε‑聚赖氨酸作为载体运输荧光染色液穿透细胞壁进入菌体细胞质中的作用，经激发光激发而产生荧光，菌落被识别计数，配合使用可以加速菌体生长速率的培养基，大大提高了微生物检测效率。

Description

用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法。

背景技术

微生物个体微小、种类繁多，包括细菌、真菌、病毒等群体。微生物菌落，是由单个或多个微生物细胞在适宜条件下培养后生长繁殖而形成的能够被我们所识别的细胞集团。微生物菌落数量监测分析在多个行业中应用广泛，对于保障产品的质量与安全至关重要。

近年来，随着经济的快速发展，人们生活水平得到了显著提高，人们对于生活品质的要求越来越高，关于食品、医药、化妆品及环境等卫生问题的曝光率增加明显，其中，霉菌和酵母数量超标是一大重点问题。

目前，霉菌和酵母菌落数量的相关检测标准有：GB 4789.15-2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》、GB/T 13092-2006《饲料中霉菌总数测定方法》、SN/T 4675.28-2016《出口葡萄酒中细菌、霉菌及酵母的计数》、ISO16212-2017《化妆品微生物学酵母与霉菌的计数》等，均采用的是传统的平板计数法。该方法准确性相对较高，数据重现性较好，但是操作过程复杂，对专业技能有一定要求，并且检测周期长，时效性差，检测结果具有滞后性，待样品中污染的微生物种类和数量搞清楚后，一些损失已经无法挽回。

随着现代生物技术水平的快速提高，微生物快速检测方法不断涌现，如显色培养计数法、测试片法、ATP生物发光法等。其中，显色培养基计数法是利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应而显色的原理来检测微生物的新型方法；测试片法可以说是改良版的显色培养计数法，利用纸片、无纺布等作为实验载体，承载相应的显色培养基，只需加入待检液，经过一定时间的培养后，对所要测试的微生物生长和变化情况进行判断，从而确定食品中微生物的种类和数量。显色培养计数法和测试片法都是在传统的平板计数法基础上改进的微生物检测方法，二者均是利用菌落显色原理而实现菌体标记易于识别的效果，但在检测时间上与传统方法相比优势不大。测试片法虽然在检测步骤上简化较多，省去了培养基的配置、灭菌、分装等操作，使用方便，但是其常用载体滤纸、无纺布等由于间隙较大，部分菌体在其中生长从而无法被观察到，导致计数结果比实际偏低，尤其是对于菌量较大的样品，常会出现菌落显示模糊，边界不清晰的情况，造成计数困难，其检出效果大打折扣。ATP生物发光法操作简便、快速、高效，但是其检测灵敏度有限，检测结果的准确性依赖于外部校准，并且属于破坏性荧光标记，无法用于后期溯源分析。

薄膜过滤计数法在《中华人民共和国药典》中是药品微生物限度检查的一种重要技术手段，在进出口食品，如饮料、葡萄酒等食品相关微生物检测标准中也有应用。样品稀释液在使用滤膜过滤后，将滤膜转移至相应培养基中进行扩大培养，待一定时间后取出并计数，能够满足大体积样品的微生物检测需求，尤其适用于检测含有微生物生长抑制剂的样品。荧光染色计数法通过荧光标记微生物细胞，在短时间内快速积累放大信号，从而实现检测效果。该技术检测灵敏度高、周期短，能够实现真正意义上的快速检测。

综上所述，目前对于真核微生物的检测，尤其是真菌细胞壁结构复杂坚韧，荧光染料直接进入困难，染色效率不高，以及存在着检测操作困难、抑制剂、残渣干扰、容易二次污染等问题，导致真核微生物检测分辨率、计数灵敏度低的问题。如何研发一种将薄膜培养与非破坏性荧光染色这两项技术结合起来，提高检测灵敏度和便捷性，是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法。以解决现有检测过程中，染色试剂通过破坏微生物菌体而被其吸收代谢、无法短时间内产生荧光信号的试剂、检测速度慢、误差大，以及检测过程复杂，容易产生交叉污染的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供用于真核微生物快速计数的试剂，所述试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液；

其中，所述渗透缓冲液包括以下组分：ε-聚赖氨酸、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、甘氨酸；

所述荧光染色液中染色组分一种脂肪酶荧光底物，其选自荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯、5-氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、6-羧基荧光素二乙酸酯、5-羧基荧光素二乙酸酯、5-硝基-二乙酸荧光素和6-硝基-二乙酸荧光素中的一种或几种。

优选地，所述渗透缓冲液中，各组分的含量为：ε-聚赖氨酸的摩尔浓度为50μmol/L～400μmol/L、十二烷基-β-D-麦芽糖苷质量百分数为0.1％～0.5％、甘氨酸的摩尔浓度为1mmol/L～10mmol/L。

本发明的渗透缓冲液中，ε-聚赖氨酸富含阳离子，与带有阴离子的物质有强的静电作用力并且对细胞壁和细胞膜有良好的穿透力，基于这一特性，ε-聚赖氨酸做为荧光染色液进入菌体细胞的载体，其与甘氨酸合用有增效作用。

十二烷基-β-D-麦芽糖苷是一种去垢剂，属于烷基糖苷类非离子型表面活性剂，常用于抽提和溶解蛋白质，稳定酶活性和激活酶以及细胞膜研究。经试验验证，采用上述渗透缓冲液可以在20min内实现菌体有效标记效果。

本发明的渗透缓冲液可以在不破坏菌体细胞整体有机体系的情况下改变菌体细胞壁(膜)的通透性，从而克服细胞壁(膜)的渗透屏障，降低胞外物质的传质阻力，使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用，从而提高其稳定性和催化效率，即在不破坏菌体细胞整体内部有机系统的前提下改变壁(膜)的通透性，使荧光染色液高效进入细胞体内，在胞内酶的催化作用下产生荧光物质，快速积累并且不会泄露至细胞外部。

优选地，所述复溶液为二甲基亚砜。

优选地，所述荧光染色液的浓度为100～500μg/mL。

本发明另一方面还提供一种用于真核微生物快速计数的装置，所述装置包括微生物培养盒以及上述所述试剂；其中，所述微生物培养盒具有一盒体，所述盒体包括容纳槽以及与所容纳槽配合的盖体，所述容纳槽内从槽的底部向上依次铺设有第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜；

所述盖体内设有用于将所述第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜压于所述容纳槽底部的压板。压板能够让滤膜与吸水纸紧密贴合，同时还能防止样品稀释液溢至第二层吸水纸上，吸水纸材质为纤维素，吸水后体积不变。

优选地，所述滤膜为孔径为0.8μm的混合纤维素酯滤膜。

优选地，所述装置还包括荧光检测仪。

本发明还提供一种利用所述的装置检测真核微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、取含待测真核微生物样品；

步骤二、将所述含待测真核微生物样品加入到所述滤膜上，待其完全吸收后，弃掉所述第二吸水纸；

步骤三、将所述滤膜贴合于所述第一吸水纸上；

步骤四、向所述容纳槽内加入培养基培养一定时间；

步骤五、向所述培养后的容纳槽内加入渗透缓冲液和用复溶液配制的所述荧光染色液；

步骤六、将所述容纳槽置于培养箱内倒置培养后，用荧光检测仪计数检测。

优选地，所述培养基为30g/L的麦芽浸粉、20g/L的葡萄糖、5g/L的大豆蛋白胨、2g/L的酵母浸粉、1g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的硫酸镁、5mg/L的维生素B2、0.1g/L的氯霉素，溶剂为蒸馏水。

优选地，所述真核微生物为霉菌或酵母菌。

本发明中，霉菌和酵母同属于真菌，在自然界中分布广泛，种类繁多、数量惊人。霉菌和酵母不但能够使食品、生活用品及生产原料等腐败变质，还能引起人、动物和植物的病害。霉菌是丝状真菌的统称，是指能在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌(少数例外)。霉菌细胞壁结构复杂，主要由几丁质、蛋白质、甘露聚糖和葡聚糖组成，其中几丁质构成网状结构，使细胞壁具有坚韧的机械性能。酵母菌是指以出芽生殖为主，其营养阶段为单细胞的一类真菌。酵母菌其细胞壁主要含有葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、脂类物质，少许几丁质。

酯酶(Esterase)是一类相对于脂肪酶(Lipase)而言能够催化酯键形成或断开的水解酶，通常是指羧酸酯酶(EC3.1.1)，主要作用于短链脂肪酸(Cn≤10)形成的酯键，作用底物需是溶解状态。酯酶普遍存在于动物、植物和微生物体内，具有高效、迅速等特点。

细胞荧光染色效率高低受多种因素影响，例如，温度、溶剂、PH、底物浓度、酶的活性、酶的数量、细胞结构等，尤其是菌体细胞壁(膜)结构复杂坚韧，对酶底物具有透过性屏障作用，导致酶解效率低下。细胞透性化技术(cell permeabilization)可以在不造成细胞裂解、不破坏细胞内部结构的情况下改善细胞壁(膜)的通透性，使得小分子物质以及一些大分子物质能够自由进出细胞。根据处理方式的不同，透性化技术可以分为物理、生物、化学和分子生物学三种处理方法，本发明使用的是化学试剂处理法。

羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)及其衍生物在细胞内被非特异性酯酶水解为羧基荧光素(CF)，区别于传统的荧光素，CF带有特殊的负电荷，能够延长其在细胞内的存留时间。

对于霉菌和酵母的传统培养通常涉及的载体是琼脂培养基或培养装置，例如3MPetrifilmTM快速霉菌酵母测试片。

本发明所涉及的待测样品可从多种来源获得或源自多种来源。来源可为液体、固体、半固体、凝胶状材料以及它们的组合。样品稀释液是指一定质量或体积上述来源的样品经一定体积的稀释液稀释之后的样品。

本发明的培养基包含多种本领域中已知的可促进霉菌和酵母生长繁殖的营养物质，例如碳源(例如，各种糖类)；氮源(例如，酵母提取物、蛋白提取物、麦芽提取物)；无机盐(例如，硫酸镁、硫酸锌、氯化钙、)；任选地，缓冲剂(例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠)；生长因子(例如，维生素、氨基酸、激素)以及任选地，抗生素(例如，氯霉素、四环素，用于抑制细菌生长)。

本发明具有如下优点：

1、本发明的检测装置组成简单，本发明的检测方法能够进行霉菌和酵母菌定量检测，不需要进行准备工作，对人员要求较低的能够快速上手，且能够保证检测工作的准确性和标准性；

2、本发明的计数方法能够在取样阶段快速进行接种检测工作，有效地避免了由于检测时间过长而导致微生物数量发生变化的问题，并且还有利于后期添加其他特异性试剂，克服了传统法需将固体培养基保温至46℃后再与菌液混合，容易导致菌体热损伤或者避免干燥过程中的营养损失的缺陷；

3、本发明的计数方法有效避免了微生物细胞受损的缺陷，实现溯源分析，适用于各种环境，计数试剂和装置容易携带和运输，检测的过程中不污染环境；

4、本发明的计数装置采用滤膜作为载体时，菌体生长紧凑，不易扩散，且空白部分作为白色背景，与菌体颜色区别度较大，使菌体更容易识别；

6、该用于真核微生物快速计数的试剂利用广谱抑菌剂ε-聚赖氨酸做为载体运输荧光染色液穿透细胞壁进入菌体细胞质中的作用，荧光试剂中不发光的酶底物在菌体内参与新陈代谢时发生酶解反应，底物将独立的发光基团释放到菌体的细胞质中，发光基团在细胞内经过一段时间的积累后，经激发光激发而产生荧光，菌落即被识别计数，配合使用可以加速菌体生长速率的培养基，大大提高了检测效率，将检测时间由传统平板计数方法的72h～120h、试纸片的48h，减少为28h。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1A和图1B为本发明实施例提供的微生物培养盒的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的用于检测真核微生物的方法检测酵母菌菌落数的结果照片图；

图3为本发明实施例提供的用于检测真核微生物的方法检测霉菌的检测结果的照片图；

图4为本发明实施例提供的用于检测真核微生物的方法检测禾谷镰刀菌、黑曲霉、交链孢霉、金灰青霉、烟曲霉以及混合菌样的计数结果照片图；

图5为本发明实施例提供的渗透缓冲液对检测结果的影响的对照图，其中，A：第一组检测结果的照片图；B：第二组检测结果的照片图；

图6为本发明实施例提供的不同渗透缓冲液组分对检测结果影响的照片图，其中，A：第一组检测结果的照片图；B：第二组检测结果的照片图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供用于真核微生物快速计数的试剂，该试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液二甲基亚砜；其中，渗透缓冲液包括以下组分：ε-聚赖氨酸、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、甘氨酸；

荧光染色液组分为选自荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯、5-氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、6-羧基荧光素二乙酸酯、5-羧基荧光素二乙酸酯、5-硝基-二乙酸荧光素和6-硝基-二乙酸荧光素中的一种或几种。

荧光染色液是将上述荧光染色液组分溶于复溶液二甲基亚砜制得。

渗透缓冲液中，各组分的含量为：ε-聚赖氨酸的摩尔浓度为50μmol/L～400μmol/L、十二烷基-β-D-麦芽糖苷质量百分数为0.1％～0.5％、甘氨酸的摩尔浓度为1mmol/L～10mmol/L。

荧光染色液的浓度为100～500μg/mL。该真核微生物为霉菌或酵母菌。

本发明的用于真核微生物快速计数的装置，该装置包括微生物培养盒、荧光检测仪以及上述试剂；其中，微生物培养盒具有一盒体，盒体包括容纳槽以及与所容纳槽配合的盖体，容纳槽内从槽的底部向上依次铺设有第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜；盖体内设有用于将第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜压于容纳槽底部的压板。滤膜为孔径为0.8μm的混合纤维素酯滤膜。

本发明利用上述装置对真核微生物的计数方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、取含待测真核微生物样品；

步骤二、将含待测真核微生物样品加入到滤膜上，待其完全吸收后，弃掉第二吸水纸；

步骤三、将滤膜贴合于第一吸水纸上；

步骤四、向容纳槽内加入培养基培养一定时间，其中，培养基为30g/L的麦芽浸粉、20g/L的葡萄糖、5g/L的大豆蛋白胨、2g/L的酵母浸粉、1g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的硫酸镁、5mg/L的维生素B2、0.1g/L的氯霉素，溶剂为蒸馏水；

步骤五、向培养后的容纳槽内加入用渗透缓冲液和复溶液配制的荧光染色液；

步骤六、将容纳槽置于培养箱内倒置培养后，用荧光检测仪计数检测。

实施例1、用于真核微生物快速计数的试剂

本实施例提供用于真核微生物快速计数的试剂，该试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液；其中，渗透缓冲液包括以下组分：ε-聚赖氨酸、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、甘氨酸。

具体的，渗透缓冲液中，各组分的含量为：ε-多聚赖氨酸100μmol/L、十二烷基-β-D-麦芽糖苷质量百分含量为0.2％、甘氨酸1mmol/L；

复溶液为二甲基亚砜；

荧光染色液：150μg/mL的5-羧基荧光素二乙酸酯，荧光染色液的制备方法为将荧光染色组分5-羧基荧光素二乙酸酯溶解在复溶液二甲基亚砜中形成。

作为可变换的实施方式，荧光染色液组分可选自荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯、5-氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、6-羧基荧光素二乙酸酯、5-羧基荧光素二乙酸酯、5-硝基-二乙酸荧光素和6-硝基-二乙酸荧光素中的一种或几种。

实施例2、用于真核微生物快速计数的装置

本实施例的用于真核微生物快速计数的装置，该装置包括微生物培养盒和实施例1的用于真核微生物快速计数的试剂。

如图1A和图1B所示，该微生物培养盒具有一盒体，盒体包括容纳槽200以及与所容纳槽配合的盖体100，容纳槽200内从槽的底部向上依次铺设有第一吸水纸210、第二吸水纸220以及滤膜230；盖体100内设有用于将第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜压于容纳槽底部的压板。

具体的，该微生物培养盒可以为直径50mm、深度5mm的圆形培养皿，容纳槽为培养皿的皿底，盖体为培养皿的皿盖；皿底内从底部向上依次铺设有第一吸水纸、第二吸水纸和滤膜，滤膜的为直径47mm，孔径为0.8μm的混合纤维素酯滤膜，皿盖上设有将滤膜、第一吸水纸、第二吸水纸压于皿底底部压板，该压板环设于沿皿盖周侧设置。

实施例3、对真核微生物的计数方法

本实施例提供用于真核微生物的计数的方法，其包括以下步骤：

步骤一、打开实施例2制备的培养皿的盖子，加入含酵母菌的待测样品，样品的添加体积≤5mL；

将含酵母菌的待测样品稀释液加入到滤膜中央，盖上培养皿盖，待稀释液被完全扩展吸收后，去掉第二吸水纸；

步骤二、将吸附有酵母菌的滤膜转移至培养皿底部的第一吸水纸上，使滤膜与第一吸水纸吸附贴合，保证两者之间不存在气泡；

步骤三、将1.3mL液体培养基添加至培养皿的底部，盖上培养皿盖，放入28℃±1℃培养箱倒置培养28h±4h，其中，培养基为30g/L的麦芽浸粉、20g/L的葡萄糖、5g/L的大豆蛋白胨、2g/L的酵母浸粉、1g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的硫酸镁、5mg/L的维生素B2、0.1g/L的氯霉素，溶剂为蒸馏水；

步骤四、用复溶液二甲基亚砜配制150μg/mL的5-羧基荧光素二乙酸酯的荧光染色液后，将荧光染色液全部加入到渗透缓冲液中，混匀后，得到染色混合液；

步骤五、向培养皿中加入1.3mL染色混合液，盖上培养皿的皿盖，放入原培养箱正置培养20min；

步骤六、将培养后的培养皿置于含有490nm激发波长的荧光检测仪中计数，检测结果如图3所示。

本实施例中，可根据待测样品溶液体积的不同，更换不同厚度的吸水垫片，满足不同样品检测的需求，本实施例检测方法中，最大检测样品体积为5ml。

如图2为按照本实施例方法检测菌落总数的检测结果的照片图。本实施例的计数方法采用荧光法将检测周期缩短至28h。

实施例4、用于真核微生物的计数方法

本实施例按照实施例3的方法分别对禾谷镰刀菌、黑曲霉、交链孢霉、金灰青霉、烟曲霉以及混合菌样进行检测，其检测过程中所采用的荧光染色溶液、渗透缓冲液相同，其他培养条件根据菌株的不同适当调整，检测结果如图4所示。

本发明的用于检测真核微生物适用于霉菌和酵母的快速计数检测，其中霉菌代表菌属有青霉属(Penicillum)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、链格孢霉属(Alternaria)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、芽枝霉属(Cladosporium)、枝霉属(Thamnidium)等。

酵母代表菌属有假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、隐球酵母属(Cryotococcus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等。

试验例1

按照实施例3的用于检测真核微生物的方法，对含酵母菌的样品进行检测；

1、渗透缓冲液对检测结果的影响：

第一组中：正常检测，加入渗透缓冲液和荧光染色液；

第二组中：不加入渗透缓冲液，只添加荧光染色液体，其他检测条件与第一组相同。

检测结果如图5所示，A为第一组检测结果的照片图，B为第二组检测结果的照片图。

2、十二烷基-β-D-麦芽糖苷对检测结果的影响：

第一组中：正常检测，加入渗透缓冲液和荧光染色液

第二组中：渗透缓冲液中不加入十二烷基-β-D-麦芽糖苷，其他检测条件均与第一组相同。

检测结果如图6所示，A为第一组检测结果的照片图，B为第二组检测结果的照片图。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于真核微生物快速计数的试剂，其特征在于，所述试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液；

其中，所述渗透缓冲液包括以下组分：ε-聚赖氨酸、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、甘氨酸；

所述荧光染色液中染色组分选自荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯、5-氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、6-羧基荧光素二乙酸酯、5-羧基荧光素二乙酸酯、5-硝基-二乙酸荧光素和6-硝基-二乙酸荧光素中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的用于真核微生物快速计数的试剂，其特征在于，

所述渗透缓冲液中，各组分的含量为：ε-聚赖氨酸的摩尔浓度为50μmol/L～400μmol/L、十二烷基-β-D-麦芽糖苷质量百分数为0.1％～0.5％、甘氨酸的摩尔浓度为1mmol/L～10mmol/L。

3.如权利要求1所述的用于真核微生物快速计数的试剂，其特征在于，

所述复溶液为二甲基亚砜。

4.如权利要求1所述的用于真核微生物快速计数的试剂，其特征在于，

所述荧光染色液的浓度为100～500μg/mL。

5.一种用于真核微生物快速计数的装置，其特征在于，所述装置包括微生物培养盒以及权利要求1-4中任一所述试剂；

其中，所述微生物培养盒具有一盒体，所述盒体包括容纳槽以及与所容纳槽配合的盖体，所述容纳槽内从槽的底部向上依次铺设有第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜；

所述盖体内设有用于将所述第一吸水纸、第二吸水纸以及滤膜压于所述容纳槽底部的压板。

6.如权利要求5所述的用于真核微生物快速计数的装置，其特征在于，

所述滤膜为孔径为0.8μm的混合纤维素酯滤膜。

7.如权利要求5所述的用于真核微生物快速计数的装置，其特征在于，

所述装置还包括荧光检测仪。

8.一种利用权利要求5所述的装置检测真核微生物的方法，其特征在于，

所述方法包括以下步骤：

步骤一、取含待测真核微生物样品；

步骤二、将所述含待测真核微生物样品加入到所述滤膜上，待其完全吸收后，弃掉所述第二吸水纸；

步骤三、将所述滤膜贴合于所述第一吸水纸上；

步骤四、向所述容纳槽内加入培养基培养一定时间；

步骤五、向所述培养后的容纳槽内加入渗透缓冲液和用复溶液配制的荧光染色液；

步骤六、将所述容纳槽置于培养箱内倒置培养后，用荧光检测仪计数检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述培养基为30g/L的麦芽浸粉、20g/L的葡萄糖、5g/L的大豆蛋白胨、2g/L的酵母浸粉、1g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的硫酸镁、5mg/L的维生素B2、0.1g/L的氯霉素，溶剂为蒸馏水。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述真核微生物为霉菌或酵母菌。

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