CN114133927A - 一种稀土纳米探针的抗体修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种稀土纳米探针的抗体修饰方法，包括：利用高温热分解方法制备均匀的稀土发光纳米探针，并用盐酸去除稀土发光纳米探针在制备过程中混杂的配体，将稀土发光纳米探针与含有巯基的配体混合，使稀土发光纳米探针表面包含巯基基团；将蛋白A分子与含有马来酰亚胺基和羧基琥珀酰亚胺基的有机物进行混合，使蛋白A分子表面引入马来酰亚胺基；将包含巯基的稀土发光纳米探针与引入马来酰亚胺基的蛋白A分子混合，使稀土发光纳米探针与蛋白A相连，并于抗体分子混合，得到抗体修饰的稀土发光纳米探针。本发明可以建立高灵敏、快速、便捷、高特异性的检测方法，有望应用于靶向成像、疾病诊断、卫生防疫、食品检测等众多领域。
Description
技术领域
本发明实施例涉及化学技术领域，尤其是一种稀土纳米探针的抗体修饰方法。
背景技术
稀土纳米探针具备可近红外激发、发光谱带窄、发光稳定、斯托克斯位移大、荧光背景低、可CT/MRI造影成像等诸多优点，目前利用稀土纳米发光探针已被应用于检测分析领域，特别是基于稀土上转换纳米发光探针的免疫检测研究，通过稀土纳米粒子表面连接抗体实现免疫检测、靶向细胞等应用。其基本原理是抗体修饰的稀土纳米发光探针作为标记物，通过抗原与抗体特异性结合，抗体捕获抗原，实现稀土纳米探针的靶向检测或成像。但是对于某些含量较低的样本，当稀土纳米探针捕获能力弱的情况下，将难于用检测或成像，灵敏度低，特异性差。针对稀土纳米发光探针表面抗体的修饰技术进行改进，将极大提高免疫检测的特异性。
经对现有技术的文献检索发现利用稀土纳米探针表面的氨基或羧基配体基团直接与抗体进行修饰，而这种直接修饰的方法通常会导致抗体免疫检测活性的FAB端连接到稀土纳米探针的表面，从而丧失和抗原的特异性连接活性。蛋白A(Recombinant ProteinA)源自葡萄球菌细胞壁的组成成分，能特异性的结合免疫分子的Fc区域，具有和抗体的Fc端特异性连接的能力，因此，将蛋白A分子修饰到稀土纳米探针表面来连接抗体，发展稀土纳米探针的表面抗体修饰技术将极大改善稀土纳米探针免疫检测或靶向成像的特异性识别能力。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明创造的实施例提供一种稀土纳米探针的抗体修饰方法，包括：
利用高温热分解方法制备均匀的稀土发光纳米探针，并用盐酸去除稀土发光纳米探针在制备过程中混杂的配体，将稀土发光纳米探针与含有巯基的配体混合，使稀土发光纳米探针表面包含巯基基团；
将蛋白A分子与含有马来酰亚胺基和羧基琥珀酰亚胺基的有机物进行混合，使蛋白A分子表面引入马来酰亚胺基；
将包含巯基的稀土发光纳米探针与引入马来酰亚胺基的蛋白A分子混合，使稀土发光纳米探针与蛋白A相连，并于抗体分子混合，得到抗体修饰的稀土发光纳米探针。
进一步地，还包括：
将稀土氯化物与十八烯、油酸在氩气环境下加热至100-200℃，维持至少30分钟，使稀土氯化物完全溶解得到淡黄色的澄清溶液，冷却至室温；
加入甲醇加热至70-90℃，保持至少30分钟，使甲醇完全蒸发，继续加热至280-320℃，保持至少90分钟后冷却至室温，利用乙醇离心纯化，取离心物分散于正己烷中得到稀土发光纳米探针。
进一步地，取正己烷混合物并加入盐酸，超声至少3小时去除混杂的配体，离心至少20分钟，取离心物分散于水中。
进一步地，将蛋白A溶液和SMCC溶液按照1:5-7的比例混合，室温下搅拌至少1小时，离心，将离心物分散于缓冲液中。
进一步地，蛋白A溶液为蛋白A与pH为7.5的HEPES和NaCl的混合液，SMCC溶液为SMCC与pH为7.5的HEPES和NaCl的混合液。
进一步地，稀土发光纳米探针为包含镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇或钪中至少一种元素。
进一步地，抗体为各种抗体蛋白，包含：人IgG抗体，兔抗羊IgG抗体，或anti-HER2抗体。
进一步地，将连接有蛋白A的稀土发光纳米探针与抗体分子混合离心，通过BCA蛋白试剂盒测试离心上清液中未连接的抗体数量以确定稀土发光纳米探针连接的抗体数目。
进一步地，含有巯基的配体中，配体一端含有稀土配体的基团，包括：羧基，磷酸基团，或氨基，另一端包含巯基基团。
进一步地，巯基基团包含COOH-PEG2000-SH，NH2-PEG2000-SH或DSPE-PEG2000-SH中的至少一种。
本发明实施例中，利用高温热分解方法可以制备高度均匀的稀土发光纳米探针，合成高度均匀的稀土纳米粒子如图1所示。将油相稀土纳米发光探针用盐酸去配体的方式，去掉合成过程中的相关配体，然后将去配体后的稀土纳米发光探针与含有巯基的配体相混合，使稀土纳米发光探针表面具有巯基基团。将蛋白A分子与含有马来酰亚胺基的磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)分子混合，由于SMCC分子表面具有胺反应性的-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)，可以和蛋白A复合，从而在蛋白A分子表面引入了马来酰亚胺基。将修饰了表面巯基配体的稀土纳米发光探针与3蛋白A复合物按一定比例混合，蛋白A复合物上面的马来酰亚胺基和纳米粒子表面的巯基反应，从而实现稀土纳米发光探针的表面蛋白A连接,形成稀土纳米发光纳米探针@蛋白A结构。稀土纳米发光探针与抗体分子等比例混合，利用蛋白A对抗体分子的Fc端的强捕获能力，实现定向抗体分子的连接，最终实现稀土纳米发光探针@蛋白A@抗体的结构。
本发明是稀土纳米发光探针的表面修饰技术，根据稀土纳米发光探针掺杂不同的发光中心产生不同颜色的多色荧光，连接不同的抗体可实现多多标检测。若是上转换稀土纳米发光探针，可以在近红外光激发下实现低背景噪声的检测。将化学修饰偶联标记技术的高灵敏高特异性、免疫反应的高特异性与稀土纳米发光探针的窄带低噪声背景发光特性三者相结合，建立高灵敏、快速、便捷、高特异性的检测方法，有望应用于靶向成像、疾病诊断、卫生防疫、食品检测等众多领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为抗体修饰原理示意图。
图2为Yb/Tm离子掺杂的稀土发光纳米粒子的扫描电镜测试图。
图3为稀土Yb/Tm掺杂纳米探针连接抗体数统计图。
图4为Yb/Er离子掺杂的稀土发光纳米粒子的扫描电镜测试图。
图5为稀土Yb/Er掺杂纳米探针连接抗体数统计图。
图6为稀土Lu离子掺杂的纳米粒子的扫描电镜测试图。
图7为稀土Lu掺杂纳米探针连接抗体数统计图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
稀土Yb/Tm掺杂纳米探针修饰抗体：
1、Yb3+/Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的制备：将1mmol的稀土氯化物(其中包括0.79mmol YCl3·6H2O,0.2mmol YbCl3·6H2O，0.01mmol TmCl3·6H2O)放入容量为100ml的三颈瓶中，然后加入15ml的十八烯和6ml的油酸中不断搅拌。在氩气环境保护下，缓慢加热到150℃维持30min，待稀土氯化物完全溶解后，得到颜色略有淡黄澄清透明的溶液。然后冷却到室温下，将10ml甲醇溶液中(溶有4mmol的NH4F、2.5mmol的NaOH)加到三颈瓶中，然后缓慢加热到80℃，保持30min，将溶液中的甲醇完全蒸发掉，然后将溶液加热到300℃，该温度保持90min后冷却到室温，乙醇离心纯化，分散在正己烷中备用。扫描电镜得到Yb3+/Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子，结果见图2，从图2可以看出，所获得的Yb3+/Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子颗粒均匀，粒径约28nm。
2、Yb3+/Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的水相转移：取上述5mL溶解在有机相正己烷中的稀土发光纳米粒子(10mg/mL)与5mL0.1M的盐酸混合超声4小时，13000rpm离心20分钟，分散在水溶液中。
3、Yb3+/Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的表面巯基修饰：将上述通过盐酸去配体后的稀土上转换纳米粒子稀释为5mg/mL，加入20mg DSPE-PEG2000-SH，剧烈搅拌过夜，13000rpm离心20分钟，重新分散在水溶液中。
4、蛋白A复合物的制备：配置蛋白A 10mg/mL分撒在50mM HEPES,100mM NaCl的pH为7.5的溶液中，取磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，2mg/mL溶解在50mM HEPES,100mM NaCl,pH为7.5)，按蛋白A：SMCC为1：6的比例进行混合，室温下搅拌一个小时。之后，副产物通过超速离心三次(18000g，15min)除去，重新分散在50mM的HEPES缓冲溶液中(100mM NaCl，pH为6.5)。
5、蛋白A复合物修饰稀土纳米探针：将步骤3中获得的稀土纳米探针与蛋白A复合物以1:20的摩尔比进行混合，室温下搅拌反应1小时，之后通过超滤离心除去没有反应的蛋白(15000g，30min)，然后重复分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为8.5)。
6、抗体偶连：将待修饰的兔抗羊IgG抗体分子分散在50mM的HEPES溶液中(100mMNaCl，pH为8.5)，将5步骤获得的稀土纳米探针与抗体分子以1:4的摩尔比例混合，室温下搅拌90分钟，超滤心除去没有连接的抗体(14000g,20min),获得的稀土纳米探针@蛋白A@抗体复合物重新分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为7.5)，4℃条件下保存备用。另外，上述离心中，上清液中收集到的未连接的抗体可通过BCA蛋白试剂盒确定没有连接的抗体含量，反向计算出抗体稀土纳米探针连接的数目，与对照组(使用未连接蛋白A的水相稀土纳米探针)对比连接抗体的数目的结果由图3所示，可见修饰了蛋白A复合物后的稀土纳米探针可以有效连接抗体，具备明显优势的抗体连接能力。
实施例2
稀土Yb/Er掺杂纳米探针修饰抗体
1、Yb3+/Er3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的制备：将1mmol的稀土氯化物(其中包括0.78mmol YCl3·6H2O,0.2mmol YbCl3·6H2O，0.02mmol ErCl3·6H2O)放入容量为100ml的三颈瓶中，然后加入15ml的十八烯和6ml的油酸中不断搅拌。在氩气环境保护下，缓慢加热到150℃维持30min，待稀土氯化物完全溶解后，得到颜色略有淡黄澄清透明的溶液。然后冷却到室温下，将10ml甲醇溶液中(溶有4mmol的NH4F、2.5mmol的NaOH)加到三颈瓶中，然后缓慢加热到80℃，保持30min，将溶液中的甲醇完全蒸发掉，然后将溶液加热到300℃，该温度保持90min后冷却到室温，乙醇离心纯化，分散在正己烷中备用。扫描电镜得到Yb3+/Er3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子，结果见图4，从图4可以看出，所获得的Yb/Er离子掺杂的稀土发光纳米粒子颗粒均匀，粒径约25nm。
2、Yb3+/Er3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的水相转移：取上述5mL溶解在有机相正己烷中的稀土发光纳米粒子(10mg/mL)与5mL0.1M的盐酸混合超声4小时，13000rpm离心20分钟，分散在水溶液中。
3、Yb3+/Er3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子的表面巯基修饰：将上述通过盐酸去配体后的稀土上转换纳米粒子稀释为5mg/mL，加入20mg DSPE-PEG2000-SH，剧烈搅拌过夜，13000rpm离心20分钟，重新分散在水溶液中。
4、蛋白A复合物的制备：配置蛋白A 10mg/mL分撒在50mM HEPES,100mM NaCl的pH为7.5的溶液中，取磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，2mg/mL溶解在50mM HEPES,100mM NaCl,pH为7.5)，按蛋白A：SMCC为1：6的比例进行混合，室温下搅拌一个小时。之后，副产物通过超速离心三次(18000g，15min)除去，重新分散在50mM的HEPES缓冲溶液中(100mM NaCl，pH为6.5)。
5、蛋白A复合物修饰稀土纳米探针：将步骤3中获得的稀土纳米探针与蛋白A复合物以1:20的摩尔比进行混合，室温下搅拌反应1小时，之后通过超滤离心除去没有反应的蛋白(15000g，30min)，然后重复分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为8.5)。
6、抗体偶连：将待修饰的兔抗羊IgG抗体分子分散在50mM的HEPES溶液中(100mMNaCl，pH为8.5)，将5步骤获得的稀土纳米探针与抗体分子以1:4的摩尔比例混合，室温下搅拌90分钟，超滤心除去没有连接的抗体(14000g,20min),获得的稀土纳米探针@蛋白A@抗体复合物重新分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为7.5)，4℃条件下保存备用。另外，上述离心中，上清液中收集到的未连接的抗体可通过BCA蛋白试剂盒确定没有连接的抗体含量，反向计算出抗体稀土纳米探针连接的数目，与对照组(使用未连接蛋白A的水相稀土纳米探针)对比连接抗体的数目的结果由图5所示，可见修饰了蛋白A复合物后的稀土纳米探针可以有效连接抗体，具备明显优势的抗体连接能力。
实施例3
稀土Lu掺杂纳米探针修饰抗体
1、Lu离子掺杂的稀土发光纳米粒子的制备：将1mmol的稀土氯化物(其中包括1mmol LuCl3·6H2O)放入容量为100ml的三颈瓶中，然后加入15ml的十八烯和6ml的油酸中不断搅拌。在氩气环境保护下，缓慢加热到150℃维持30min，待稀土氯化物完全溶解后，得到颜色略有淡黄澄清透明的溶液。然后冷却到室温下，将10ml甲醇溶液中(溶有4mmol的NH4F、2.5mmol的NaOH)加到三颈瓶中，然后缓慢加热到80℃，保持30min，将溶液中的甲醇完全蒸发掉，然后将溶液加热到300℃，该温度保持90min后冷却到室温，乙醇离心纯化，分散在正己烷中备用。扫描电镜得到Yb3+/Er3+离子掺杂的稀土发光纳米粒子，结果见图6，从图6可以看出，所获得的Lu离子掺杂的稀土发光纳米粒子颗粒均匀，粒径约30nm。
2、Lu离子掺杂的稀土纳米粒子的水相转移：取上述5mL溶解在有机相正己烷中的稀土发光纳米粒子(10mg/mL)与5mL 0.1M的盐酸混合超声4小时，13000rpm离心20分钟，分散在水溶液中。
3、Lu离子掺杂的稀土发光纳米粒子的表面巯基修饰：将上述通过盐酸去配体后的稀土纳米粒子稀释为5mg/mL，加入20mg DSPE-PEG2000-SH，剧烈搅拌过夜，13000rpm离心20分钟，重新分散在水溶液中。
4、蛋白A复合物的制备：配置蛋白A 10mg/mL分撒在50mM HEPES,100mM NaCl的pH为7.5的溶液中，取磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，2mg/mL溶解在50mM HEPES,100mM NaCl,pH为7.5)，按蛋白A：SMCC为1：6的比例进行混合，室温下搅拌一个小时。之后，副产物通过超速离心三次(18000g，15min)除去，重新分散在50mM的HEPES缓冲溶液中(100mM NaCl，pH为6.5)。
5、蛋白A复合物修饰稀土纳米探针：将步骤3中获得的稀土纳米探针与蛋白A复合物以1:20的摩尔比进行混合，室温下搅拌反应1小时，之后通过超滤离心除去没有反应的蛋白(15000g，30min)，然后重复分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为8.5)。
6、抗体偶连：将待修饰的兔抗羊IgG抗体分子分散在50mM的HEPES溶液中(100mMNaCl，pH为8.5)，将5步骤获得的稀土纳米探针与抗体分子以1:4的摩尔比例混合，室温下搅拌90分钟，超滤心除去没有连接的抗体(14000g,20min),获得的稀土纳米探针@蛋白A@抗体复合物重新分散在50mM的HEPES溶液中(100mM NaCl，pH为7.5)，4℃条件下保存备用。另外，上述离心中，上清液中收集到的未连接的抗体可通过BCA蛋白试剂盒确定没有连接的抗体含量，反向计算出抗体稀土纳米探针连接的数目，与对照组(使用未连接蛋白A的水相稀土纳米探针)对比连接抗体的数目的结果由图7所示，可见修饰了蛋白A复合物后的稀土纳米探针可以有效连接抗体，具备明显优势的抗体连接能力。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种稀土纳米探针的抗体修饰方法，其特征在于，包括：
利用高温热分解方法制备均匀的稀土发光纳米探针，并用盐酸去除稀土发光纳米探针在制备过程中混杂的配体，将稀土发光纳米探针与含有巯基的配体混合，使稀土发光纳米探针表面包含巯基基团；
将蛋白A分子与含有马来酰亚胺基和羧基琥珀酰亚胺基的有机物进行混合，使蛋白A分子表面引入马来酰亚胺基；
将包含巯基的稀土发光纳米探针与引入马来酰亚胺基的蛋白A分子混合，使稀土发光纳米探针与蛋白A相连，并于抗体分子混合，得到抗体修饰的稀土发光纳米探针。
2.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，还包括：
将稀土氯化物与十八烯、油酸在氩气环境下加热至100-200℃，维持至少30分钟，使稀土氯化物完全溶解得到淡黄色的澄清溶液，冷却至室温；
加入甲醇加热至70-90℃，保持至少30分钟，使甲醇完全蒸发，继续加热至280-320℃，保持至少90分钟后冷却至室温，利用乙醇离心纯化，取离心物分散于正己烷中得到稀土发光纳米探针。
3.根据权利要求2所述的抗体修饰方法，其特征在于，取正己烷混合物并加入盐酸，超声至少3小时去除混杂的配体，离心至少20分钟，取离心物分散于水中。
4.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，将蛋白A溶液和SMCC溶液按照1:5-7的比例混合，室温下搅拌至少1小时，离心，将离心物分散于缓冲液中。
5.根据权利要求4所述的抗体修饰方法，其特征在于，蛋白A溶液为蛋白A与pH为7.5的HEPES和NaCl的混合液，SMCC溶液为SMCC与pH为7.5的HEPES和NaCl的混合液。
6.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，稀土发光纳米探针为包含镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇或钪中至少一种元素。
7.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，抗体为各种抗体蛋白，包含：人IgG抗体，兔抗羊IgG抗体，或anti-HER2抗体。
8.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，将连接有蛋白A的稀土发光纳米探针与抗体分子混合离心，通过BCA蛋白试剂盒测试离心上清液中未连接的抗体数量以确定稀土发光纳米探针连接的抗体数目。
9.根据权利要求1所述的抗体修饰方法，其特征在于，含有巯基的配体中，配体一端含有稀土配体的基团，包括：羧基，磷酸基团，或氨基，另一端包含巯基基团。
10.根据权利要求1或9所述的抗体修饰方法，其特征在于，巯基基团包含COOH-PEG2000-SH，NH2-PEG2000-SH或DSPE-PEG2000-SH中的至少一种。
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