CN114133346B - 蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法 - Google Patents

蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及天然活性物质提取方法的技术领域，具体公开了一种蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法。蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，包括了原料预处理、蒜氨酸提取、大蒜素制备、大蒜素提取等步骤；通过使用酶活抑制剂对蒜粒进行预处理，抑制蒜粒中酶解反应的发生，继而通过Na/K磷酸缓冲液提取蒜氨酸酶，使得蒜氨酸酶和蒜氨酸分离，蒜氨酸可直接提纯成为产品，也可以与Na/K磷酸抽提液中的蒜氨酸酶发生酶解反应制备高纯度大蒜素。本申请设计的生产线可同时制得蒜氨酸与大蒜素两种高价值产品，且产品提取率和纯度较高，品质佳。

Description

蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法
技术领域
本申请涉及天然活性物质提取方法的技术领域，更具体地说，它涉及一种蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法。
背景技术
大蒜素（Allicin）是从葱科葱属植物中提取的一种有机硫化合物，学名为二烯丙基硫代亚磺酸酯，具有浓烈的大蒜气味，遇热易挥发。生物化学分析证明，新鲜大蒜中并不含有大蒜素，而含有它的前体-蒜氨酸。蒜氨酸以不稳定无臭的形式存在于大蒜中，在大蒜被破坏后，大蒜中的蒜氨酸酶被激活，催化蒜氨酸分解合成为大蒜素。
目前，大蒜素常见的提取方法一般采用如下几种：
第一种，水蒸气蒸馏法设备简单，成本低，但此方法的弊端在于：提取条件的温度较高，极易造成大蒜素的挥发损失，因此导致大蒜素在提取物种的含量仅为5%左右；
第二种，有机溶剂萃取法，常采用甲醇、丙酮、乙醚等溶剂作为提取液，但此方法的缺点在于有机溶剂用量大，易残留，影响产品品质，且有些溶剂毒性较大，不适用于食品领域。
本申请人认为上述相关提取方法存在如下缺陷：第一，大蒜素的提取率以及纯度还有待提高；第二，上述方法的生产线仅能够对大蒜素进行提取，而无法提取得到部分具有高附加价值的蒜氨酸，造成蒜氨酸的浪费。
发明内容
为了提高大蒜素的提取率以及纯度，并且提高产线的附加价值，本申请提供了一种蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法。
本申请提供的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，采用如下的技术方案：
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，包括如下步骤：
原料预处理：蒜粒预先浸泡于酶活抑制剂中，所述酶活抑制剂包括冰醋酸和盐酸羟胺，控制酶活抑制剂pH值为3.5～5，浸泡6～12h；在1～15℃、浸泡于酶活抑制剂条件下破碎蒜粒，得到蒜泥原料；使用Na/K磷酸缓冲液对蒜泥原料进行抽提，得到含有蒜氨酸酶的Na/K磷酸抽提液和含蒜氨酸的蒜泥渣；
蒜氨酸提取：使用浓度为20wt%～30wt%乙醇溶液浸提蒜泥渣，固液分离得到蒜氨酸粗品；真空浓缩除去乙醇，得到蒜氨酸溶液；蒜氨酸溶液干燥得到蒜氨酸产品；
大蒜素制备：将Na/K磷酸抽提液加入至蒜氨酸溶液中，并加入5’-磷酸吡哆醛辅酶进行酶解反应，得到大蒜油粗品；
大蒜素提取:使用浓度为70wt%～95wt%乙醇溶液浸提大蒜油粗品，得到精制大蒜素，真空浓缩干燥得到大蒜素。
通过采用上述技术方案，冰醋酸增强了大蒜细胞的通透性，盐酸羟胺可以随着冰醋酸进入大蒜细胞，对蒜氨酸酶起到较好的酶活抑制作用，阻碍了蒜氨酸酶与蒜氨酸发生酶解发应；同时，冰醋酸提供酸性环境，中和蒜泥渣的碱性，使得盐酸羟胺维持长效酶活抑制作用，冰醋酸和盐酸羟胺在抑制蒜氨酸酶活性方面起到协同增效的作用；
蒜粒在低温下破碎，由于蒜氨酸酶在低温状态下的酶活力较低，因此低温能够进一步阻碍酶解发应的发生；并且冰醋酸在此温度范围内结晶，易引起大蒜细胞的游离水结晶膨胀，导致大蒜细胞破裂，从而促进蒜氨酸和蒜氨酸酶溶出；Na/K磷酸缓冲液可提取蒜氨酸酶，而大量的蒜氨酸则留存在蒜泥渣中；
乙醇溶液对蒜氨酸的溶解度较高，蒜氨酸可以充分溶解在乙醇溶液中，蒜氨酸的提取率较高；并且蒜泥渣中的大分子物质如纤维素、蛋白质等在醇溶液中易沉淀，蒜氨酸的纯度提高，产线上可得到高纯度、高提取率的蒜氨酸产品，产线的价值提高；
而蒜氨酸溶液可在Na/K磷酸抽提液含有的蒜氨酸酶以及5’-磷酸吡哆醛辅酶因子作用下，进行酶解反应，转化为大蒜素；相较于常规大蒜素的制备方法，即酶解反应在大蒜破碎时进行，本申请的大蒜素制备步骤中大蒜素初始纯度较高，可简化后期大蒜素的提取纯化步骤，仅使用乙醇溶液提取大蒜素即可得到高纯度高提取率的大蒜素产品；
综上所述，第一，本申请中的各个步骤操作简单，便于进行工业化生产，大蒜原料中的活性成分被充分提取；第二，本产线可同时得到蒜氨酸产品和大蒜素产品，可根据客户需求灵活切换生产路线，节约生产成本；第三，本申请制得的产品纯度以及提取率较高，产品品质优良。
优选的，所述原料预处理步骤中控制酶活抑制剂pH为4。
通过采用上述技术方案，酶活抑制剂的pH值低于4时，蒜氨酸酶的活性显著降低，虽然对蒜氨酸酶具有较好的抑制作用，但蒜氨酸酶易钝化，酶活力下降超过40%，不利于后期大蒜素的制备；酶活抑制剂的pH值高于4时，酶活抑制剂对蒜氨酸酶的抑制作用减弱；因此在此pH值下，酶活抑制剂对蒜氨酸酶的抑制效果较好，并且后续蒜氨酸酶与蒜氨酸进行酶解反应，提高大蒜素的提取率和纯度。
优选的，所述原料预处理步骤中蒜粒在4～6℃条件下进行破碎。
通过采用上述技术方案，由于蒜氨酸酶对温度敏感，高于此温度范围时，蒜氨酸酶活性的抑制效果减弱；而低于此温度范围时，蒜氨酸酶的蛋白质结构中的游离水结晶膨胀，导致蒜氨酸酶的结构受到低温冲击，部分蒜氨酸酶变性失效，酶活降低，因此在此温度范围内，酶活抑制剂对蒜氨酸酶的抑制效果较好，同时蒜氨酸酶的结构完整，有利于后期大蒜素的制备。
优选的，所述原料预处理步骤中，蒜粒在无氧条件下进行破碎。更优选的，所述无氧条件为氮气气氛。
通过采用上述技术方案，破碎设备中可通入氮气，蒜粒在无氧条件下进行破碎，使得蒜氨酸的硫原子无法被氧化为亚砜，一方面降低蒜氨酸的变质的可能性，另一方面进一步抑制蒜氨酸酶解反应的进行。
优选的，所述Na/K磷酸缓冲液中还添加有稳定剂，所述稳定剂占Na/K磷酸缓冲液的1wt%～5wt%，所述稳定剂为甘油、蔗糖、5’-磷酸吡哆醛中的一种或多种。更优选的，所述稳定剂为5’-磷酸吡哆醛。
通过采用上述技术方案，甘油、蔗糖、5’-磷酸吡哆醛等物质作为稳定剂，可提高蒜氨酸酶的稳定性，避免蒜氨酸酶在提取过程中变性失活。5’-磷酸吡哆醛几乎不溶于乙醇溶液中，因此在后续大蒜素提取步骤中易析出沉淀，从而使得大蒜油的纯度提高。
可选的，所述蒜氨酸提取步骤中蒜泥渣与乙醇溶液的料液比为1:（2～4），乙醇溶液的提取温度为10～30℃，提取时间9～24h。
通过采用上述技术方案，乙醇溶液在此操作参数下能够对蒜氨酸进行充分提取，且蒜氨酸的稳定性较好，蒜氨酸的品质得到进一步提升；同时能够兼顾生产成本，减少乙醇溶液的使用。
优选的，所述大蒜素制备步骤中Na/K磷酸抽提液与蒜氨酸溶液的重量比为1:（3～7），酶解温度30～35℃，酶解时间1～3h。
通过采用上述技术方案，在此条件下，蒜氨酸酶活性较高，蒜氨酸酶与蒜氨酸之间的酶解反应完成充分，大蒜素的产率提高，大蒜素后期的提取率以及纯度提升。
优选的，所述大蒜素提取步骤中使用的乙醇溶液浓度为75wt%。
通过采用上述技术方案，此浓度下的乙醇溶液对蒜氨酸酶的沉淀作用较好，有利于进一步提高大蒜素的纯度。
优选的，所述大蒜素提取步骤中大蒜油粗品与乙醇溶液的料液比为（2.5～5）:1，乙醇溶液的提取温度为20～30℃，提取时间3～6h。
通过采用上述技术方案，在充分提取大蒜油的前提下，减少乙醇溶液的使用，减少有机溶剂的残留，提高大蒜素的品质。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中通过使用酶活抑制剂对蒜粒进行预处理，抑制蒜粒中酶解反应的发生，继而通过Na/K磷酸缓冲液提取蒜氨酸酶，使得蒜氨酸酶和蒜氨酸分离，蒜氨酸可进行提纯成为产品，也可以与Na/K磷酸抽提液中的蒜氨酸酶发生酶解反应制得高纯度大蒜素；
2、本申请中通过严格控制原料预处理步骤的蒜粒破碎条件，如pH值、无氧环境，使得酶解反应进一步得到抑制，但蒜氨酸酶的酶活力几乎无损失，有利于后续大蒜素制备步骤中蒜氨酸充分转化成大蒜素。
具体实施方式
若无特殊说明，本申请原料的来源如下所示：
蒜粒：采购于山东金乡；
盐酸羟胺：采购于衢州波涛化工有限公司，CAS：5470-11-1；
Na/ K磷酸缓冲液：采购于上海齐源生物科技有限公司，货号26-680；
5’-磷酸吡哆醛：采购于上海禾午生物科技有限公司，CAS：54-47-7。
实施例
实施例1
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，按照如下工艺步骤进行：
原料预处理：
向水池中注入100kg水，投入0.5kg盐酸羟胺，搅拌混匀；在100rpm的搅拌速率下，向水池中持续注入冰醋酸，直至水池中溶液pH值为3.5，得到酶活抑制剂；
大蒜剥去外皮，洗净捞出；称取50kg完整洁净的蒜粒放入酶活抑制剂中，20℃下浸泡6h；浸泡完成后，将蒜粒与酶活抑制剂一同转移至粉碎机中，粉碎机外设有冷却夹套，使得粉碎机内的温度控制在1℃，粉碎机粉碎匀浆，得到蒜泥原料；
向蒜泥原料中加入50kgNa/K磷酸缓冲液，1℃下浸提30min，后离心30min，吸取上清液，上清液即为含有蒜氨酸酶的Na/K磷酸抽提液；下层固体即为含蒜氨酸的蒜泥渣；
蒜氨酸提取：
蒜泥渣称重，向蒜泥渣中按照料液比（蒜泥渣的重量与乙醇溶液的体积比）1:2投入浓度为20wt%的乙醇溶液，在10℃下浸提24h；
浸提结束后，物料转移至孔径为100目滤膜上进行一次过滤，收集一次滤液；将滤液转移至分子量为10000的超滤膜上，在50kPa的压力下进行二次过滤，超滤膜截留一次滤液中的蛋白质以及多糖等大分子物质，收集二次滤液，得到蒜氨酸粗品；
将蒜氨酸粗品转移至低温真空蒸发器中，在20℃下蒸发2h，除去乙醇和部分水，得到蒜氨酸溶液；
将蒜氨酸溶液继续在低温真空蒸发器中蒸发干燥，直至得到晶体状的蒜氨酸产品；
大蒜素制备：
称取0.5kg Na/K磷酸抽提液和4kg蒜氨酸溶液，混合均匀后加入0.01kg 5’-磷酸吡哆醛辅酶，将混合液升温至30℃，保温反应3h，得到大蒜油粗品；
大蒜素提取:
大蒜油粗品称重，向大蒜油粗品中按照料液比1:6加入浓度为95wt%的乙醇溶液浸提，浸提液体升温至20℃，提取6h；
浸提结束后，物料转移至分子量为10000的超滤膜上，在50kPa的压力下过滤，超滤膜截留滤液中的蒜氨酸酶等大分子物质，收集滤液；
将滤液转移至低温真空蒸发器中，在20℃下蒸发干燥，直至得到大蒜素产品。
实施例2-8
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例1的区别点在于，原料预处理步骤中的工艺参数不同，具体工艺参数如下表所示。
表1.原料预处理步骤中的工艺参数
参数 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
酶活抑制剂pH值 3.5 5 4 4
酶活抑制剂浸泡时间/h 6 6 6 6
破碎温度/℃ 1 1 1 15
破碎环境 空气气氛 空气气氛 空气气氛 空气气氛
浸提温度/℃ 1 1 1 15
参数 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8
酶活抑制剂pH值 4 4 4 4
酶活抑制剂浸泡时间/h 6 6 6 12
破碎温度/℃ 4 6 6 6
破碎环境 空气气氛 空气气氛 氮气气氛 氮气气氛
浸提温度/℃ 4 6 6 6
实施例9
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例8的区别点在于，原料预处理步骤中，50kgNa/K磷酸缓冲液先加入0.5kg甘油，混合均匀后再对蒜泥原料进行浸提。
实施例10
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例8的区别点在于，原料预处理步骤中，50kgNa/K磷酸缓冲液先加入0.5kg5’-磷酸吡哆醛，混合均匀后再对蒜泥原料进行浸提。
实施例11
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例8的区别点在于，原料预处理步骤中，50kgNa/K磷酸缓冲液先加入2.5kg5’-磷酸吡哆醛，混合均匀后再对蒜泥原料进行浸提。
实施例12
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例8的区别点在于，原料预处理步骤中，50kgNa/K磷酸缓冲液先加入1.5kg5’-磷酸吡哆醛，混合均匀后再对蒜泥原料进行浸提。
实施例13-16
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例12的区别点在于，在蒜氨酸提取步骤中的各个工艺参数不同，具体参数如表2所示。
表2.蒜氨酸提取步骤中的工艺参数
参数 实施例12 实施例13 实施例14 实施例15 实施例16
乙醇溶液的浓度/wt% 20 20 20 20 30
蒜泥渣与乙醇溶液的料液比 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4
提取温度/℃ 10 10 30 30 30
提取时间/h 24 24 24 9 9
实施例17-20
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例15的区别点在于，在大蒜素制备步骤中的各个工艺参数不同，具体参数如表3所示。
表3.大蒜素制备步骤中的工艺参数
参数 实施例15 实施例17 实施例18 实施例19 实施例20
Na/K磷酸抽提液与蒜氨酸溶液重量比 1:8 1:7 1:3 1:5 1:5
酶解温度/℃ 30 30 30 30 35
酶解时间/h 3 3 3 3 1
实施例21-25
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例20的区别点在于，在大蒜素提取步骤中的各个工艺参数不同，具体参数如表4所示。
表4.大蒜素制备步骤中的工艺参数
参数 实施例20 实施例21 实施例22
乙醇溶液的浓度/wt% 95 70 75
大蒜油粗品与乙醇溶液的料液比 1:6 1:6 1:6
提取温度/℃ 20 20 20
提取时间/h 6 6 6
参数 实施例23 实施例24 实施例25
乙醇溶液的浓度/wt% 75 75 75
大蒜油粗品与乙醇溶液的料液比 1:5 1:2.5 1:2.5
提取温度/℃ 20 20 30
提取时间/h 6 6 3
对比例
对比例1
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例1的区别点在于：酶活抑制剂中未添加冰醋酸。
对比例2
蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，与实施例1的区别点在于：酶活抑制剂中未添加盐酸羟胺。
性能检测试验
检测方法
对蒜氨酸产品的提取率和纯度进行检测，结果如表5所示。：
表5.实施例1-25及对比例1-2蒜氨酸提取率和纯度的检测成果
检测对象 提取率/% 纯度/% 检测对象 提取率/% 纯度/% 检测对象 提取率/% 纯度/%
实施例1 0.048 81.3 实施例10 0.066 84.4 实施例19 0.069 84.9
实施例2 0.039 81.1 实施例11 0.065 84.2 实施例20 0.069 85.1
实施例3 0.047 82.8 实施例12 0.067 84.5 实施例21 0.071 85
实施例4 0.042 81.9 实施例13 0.07 85.2 实施例22 0.072 84.8
实施例5 0.051 82.9 实施例14 0.071 84.9 实施例23 0.069 85.3
实施例6 0.05 82.3 实施例15 0.07 85.3 实施例24 0.07 85.1
实施例7 0.063 84.3 实施例16 0.072 85.5 实施例25 0.072 85.2
实施例8 0.065 84.6 实施例17 0.07 85.1 对比例1 0.011 74.6
实施例9 0.064 83 实施例18 0.071 85.2 对比例2 0.008 56.3
对蒜氨酸产品的提取率和纯度进行检测，结果如表6所示。
表6. 实施例1-25及对比例1-2大蒜素提取率和纯度的检测成果
检测对象 提取率/% 纯度/% 检测对象 提取率/% 纯度/% 检测对象 提取率/% 纯度/%
实施例1 0.53 78.9 实施例10 0.74 84.1 实施例19 0.84 85.9
实施例2 0.54 80.5 实施例11 0.73 86.1 实施例20 0.86 86.1
实施例3 0.57 81.3 实施例12 0.75 85.4 实施例21 0.87 87.4
实施例4 0.58 82 实施例13 0.77 85.3 实施例22 0.9 87.2
实施例5 0.6 81.6 实施例14 0.76 85 实施例23 0.91 88.6
实施例6 0.62 82.4 实施例15 0.78 85.2 实施例24 0.89 87.4
实施例7 0.68 85.3 实施例16 0.77 85.5 实施例25 0.92 88.9
实施例8 0.68 85.1 实施例17 0.81 86.7 对比例1 0.25 65.1
实施例9 0.7 85 实施例18 0.8 86.2 对比例2 0.43 77.3
结合对比例1/2和实施例1，并结合表5-6可以看出：
仅使用盐酸羟胺浸泡蒜粒（对比例1），对蒜粒的抑制作用微弱，蒜氨酸的提取率仅为0.011%，纯度仅为74.6%；而仅使用冰醋酸浸泡蒜粒（对比例2），对蒜粒几乎无抑制作用，蒜氨酸的提取率显著降低，仅为0.008%，纯度仅为56.3%，均远低于实施例1的蒜氨酸提取率和纯度，表明：冰醋酸和盐酸羟胺复配而成的酶活抑制剂对蒜粒中蒜氨酸酶的抑制作用明显；
而对比例1中大蒜素的提取率为0.25%，纯度为65.1%，对比例2中大蒜素的提取率为0.43%，纯度为77.3%，均远低于实施例1的大蒜素提取率和纯度，表明：冰醋酸和盐酸羟胺复配而成的酶活抑制剂不易使得蒜氨酸酶失活，能够充分保持酶活力。
结合实施例6-9，并结合表5-6可以看出：无氧环境对蒜氨酸和蒜氨酸酶之间的酶解反应抑制作用明显，能够使得蒜粒中的蒜氨酸和蒜氨酸酶充分保留，有利于后续的提取，使得蒜氨酸和大蒜素的提取率均显著提高。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
原料预处理：蒜粒预先浸泡于酶活抑制剂中，所述酶活抑制剂包括冰醋酸和盐酸羟胺，控制酶活抑制剂pH值为3.5～5，浸泡6～12h；在1～15℃、浸泡于酶活抑制剂条件下破碎蒜粒，得到蒜泥原料；使用Na/K磷酸缓冲液对蒜泥原料进行抽提，得到含有蒜氨酸酶的Na/K磷酸抽提液和含蒜氨酸的蒜泥渣；
蒜氨酸提取：使用浓度为20wt%～30wt%乙醇溶液浸提蒜泥渣，固液分离得到蒜氨酸粗品；真空浓缩、除去乙醇，得到蒜氨酸溶液；蒜氨酸溶液干燥得到蒜氨酸产品；
大蒜素制备：将Na/K磷酸抽提液加入至蒜氨酸溶液中，并加入5’-磷酸吡哆醛辅酶进行酶解反应，得到大蒜油粗品；
大蒜素提取:使用浓度为70wt%～95wt%乙醇溶液浸提大蒜油粗品，得到精制大蒜素，真空浓缩干燥得到大蒜素。
2.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述原料预处理步骤中控制酶活抑制剂pH为4。
3.根据权利要求2所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述原料预处理步骤中蒜粒在4～6℃条件下进行破碎。
4.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述原料预处理步骤中，蒜粒在无氧条件下进行破碎。
5.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述Na/K磷酸缓冲液中还添加有稳定剂，所述稳定剂占Na/K磷酸缓冲液的1wt%～5wt%，所述稳定剂为甘油、蔗糖、5’-磷酸吡哆醛中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述蒜氨酸提取步骤中蒜泥渣与乙醇溶液的料液比为1:（2～4），乙醇溶液的提取温度为10～30℃，提取时间9～24h。
7.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述大蒜素制备步骤中Na/K磷酸抽提液与蒜氨酸溶液的重量比为1:（3～7），酶解温度30～35℃，酶解时间1～3h。
8.根据权利要求1所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述大蒜素提取步骤中使用的乙醇溶液浓度为75wt%。
9.根据权利要求8所述的蒜氨酸和大蒜素联合提取制备方法，其特征在于：所述大蒜素提取步骤中大蒜油粗品与乙醇溶液的料液比为1:（2.5～5），乙醇溶液的提取温度为20～30℃，提取时间3～6h。
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