CN114127289A - 用于降低嗜神经侵袭和疼痛的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于降低受试者中的区域性嗜神经侵袭和疼痛的组合物。还描述了降低区域性嗜神经侵袭和相关疼痛的方法。

Description

用于降低嗜神经侵袭和疼痛的组合物和方法

相关申请的交叉引用

要求于2019年5月17日提交的美国临时专利申请No.62/849,166的权益，其内容通过援引整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于降低受试者中的嗜神经侵袭和疼痛的组合物。还描述了降低嗜神经侵袭和相关疼痛的方法。

背景技术

实体瘤的转移是癌症进展的标志，并且患者中癌症从其起源肿瘤扩散到相对远的位置通常是患者预后不良的表征。嗜神经侵袭(perineural invasion，PNI)是肿瘤转移的独特形式，涉及肿瘤起源细胞在与以下相关、沿着以下以及在以下内的区域性迁移：神经纤维的神经弓上、神经周围和神经内层(Gasparini et al.Cancers 11:893,2019)。尽管通常在癌症诸如胰腺癌症的早期阶段以及更远处转移出现之前就检测到了PNI，但PNI通常与肿瘤复发、疼痛和总体生存预后不良相关。

KRAS是由Kirsten大鼠肉瘤2病毒癌基因同源癌基因编码的GTPase蛋白，属于RAS蛋白家族。KRAS中的突变长期以来一直与多种癌症类型相关，并且特别是胰腺癌症。KRAS突变等位基因G12D先前已被靶向用于治疗实体瘤和抑制细胞迁移(参见美国专利No.9,080,173和美国专利公开No.2014/0314854)。其中描述的RNA干扰(RNAi)组合物证明了肿瘤大小的减小以及肿瘤生长和细胞迁移的抑制。然而，并未示出或先前提出由突变KRAS RNAi剂对PNI(一种独特的、非固有形式的癌症转移)的特异性抑制。

发明内容

本文提供了组合物，所述组合物包括靶向选自以下的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRASG12A，所述组合物用于抑制或预防受试者中实体瘤的区域性嗜神经侵袭或与此类嗜神经侵袭相关的疼痛。还描述了此类组合物在制备用于抑制或预防此类区域性嗜神经侵袭或疼痛的药剂中的用途。

本文还描述了用于通过向有此需要的受试者(即诊断患有实体瘤或怀疑患有实体瘤或易患实体瘤的受试者)给药治疗有效量的组合物来降低实体瘤的区域性嗜神经侵袭的方法，所述组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。还描述了用于降低由实体瘤的嗜神经侵袭引起的疼痛的类似方法。

上述以及其他目的、特征和优势将从以下参考所附附图进行的详细描述中变得更加显而易见。

附图的简要说明

图1A-1D示出了siRNA转染后KRAS RNA转录物水平的降低。将MIA PaCa-2细胞用siG12D(G12D)、siG12C(G12C)、抗荧光素酶siRNA(LUC)或乱序siRNA(SCR)(最后两个作为阴性对照)转染或模拟转染。使用实时PCR测量KRAS mRNA水平。结果表示为相对mRNA水平(三个样品的平均值)±标准偏差。使用学生T检验计算p值。图1A和1B示出了siG12D的作用。图1C和1D示出了siG12C的作用。

图2A-2D示出了siRNA转染后KRAS蛋白水平的降低。用siG12C(G12C)或作为阴性对照的乱序siRNA(SCR)转染MIA PaCa-2细胞。图2A和2C：在48和72小时后使用蛋白质印迹(Western Blot)测量KRAS蛋白水平。将抗β-肌动蛋白抗体用作负载对照。图2B和2D：A和C中示出结果的量化。结果表示为带像素面积(三个样本的平均值)±标准偏差。使用学生T检验计算p值。

图3A-3C示出了MIA PaCa-2–DRG共培养试验。将MIA-PaCa-2集落在用siG12D、siG12C或作为阴性对照的乱序siRNA转染后48小时铺板于靠近新分离的小鼠DRG。监测共培养物中MIA PaCa-2细胞向DRG的迁移。图3A：低放大率图像，示出由四个MIA PaCa-2集落包围的DRG。图3B：在共培养第13天，所述不同治疗的代表性图像。图3C：共培养试验的定量总结，比较用siG12D、siG12C或乱序siRNA转染后的MIA PaCa-2细胞的PNI。

图4示出了在用阴性对照乱序siRNA转染后孵育20天，所述MIA PaCa-2–DRG共培养试验的代表性图像。底部图是顶部图中的框所指示的放大部分。

图5示出了在用靶向KRAS G12C的siRNA转染后孵育20天，所述MIA PaCa-2–DRG共培养试验的代表性图像。底部图是顶部图中的框所指示的放大部分。

图6示出了在用靶向KRAS G12D的siRNA转染后孵育20天，所述MIA PaCa-2–DRG共培养试验的代表性图像。底部图是顶部图中的框所指示的放大部分。

所述序列的简要说明

本文提供的核酸和/或氨基酸序列使用如37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出。仅示出了每个核酸序列的一条链，但应理解互补链包括在对展示链的任何引用中。将序列表作为命名为2142 12 2_ST25，创建于2020年5月16日，约9Kb的ASCII文本文件提交，其通过援引并入本文。在序列表中：

SEQ ID NO:1为野生型KRAS蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:2为KRAS G12D蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:3为KRAS G12C蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:4为KRAS G12V蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:5为KRAS G12R蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:6为KRAS G12S蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:7为KRAS G12A蛋白的DNA编码序列。

SEQ ID NO:8为被设计靶向野生型KRAS的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:9为被设计靶向野生型KRAS的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:10为被设计靶向KRAS G12D的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:11为被设计靶向KRAS G12D的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:12为被设计靶向KRAS G12C的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:13为被设计靶向KRAS G12C的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:14为HIV-1Tat细胞穿透肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15为MPG细胞穿透肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16为Pep-1细胞穿透肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17和18为KRAS转录物的正向和反向PCR引物。

SEQ ID NO:19和20为β-肌动蛋白的正向和反向PCR引物。

具体实施方式

I.术语

除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与此公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数引用。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括/包含(comprise)”意指“包括(include)”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。在冲突的情况下，以包括术语解释的本说明书为准。另外，所有的材料、方法和实例都是说明性的而不旨在限制。

给药：通过选择的途径将组合物引入受试者中。可以通过本领域技术人员已知的任何途径给药活性化合物或组合物。给药可以是局部的或全身的。局部给药的实例包括但不限于局部给药(topical administration)、瘤内给药、皮下给药、肌内给药、鞘内给药、眼内给药、眼局部给药或通过吸入给药向鼻粘膜或肺给药。另外，局部给药包括通常用于全身给药的给药途径，例如通过将血管内给药引导至特定器官的动脉供应。因此，在特定实施方式中，当这种给药靶向供应特定器官的脉管系统时，局部给药包括动脉内给药和静脉内给药。局部给药还包括将活性化合物和剂并入可植入装置或构建体(诸如本文描述的药物递送装置)中，其在延长的时间间隔内释放活性剂和化合物以获得持续的治疗作用。通过本领域已知的插入作为给定治疗区域的组织或组织环境的任何方式“植入”可植入装置。

全身给药包括被设计为经由循环系统将活性化合物或组合物广泛分布于全身的任何给药途径。因此，全身给药包括但不限于动脉内和静脉内给药。当此类给药旨在通过循环系统吸收和分布于全身时，全身给药还包括但不限于局部给药、皮下给药、肌内给药或通过吸入给药。

改变的表达：受试者中或来自受试者的生物样品中的生物分子(例如，RNA(mRNA、miRNA等)或蛋白质)的表达偏离了以下表达：如果受试者中或来自受试者的生物样品中的相同生物分子对于与该分子相关的生物条件具有正常或未改变的特征。正常表达可以在对照、群体标准和其他类似的基线表达测量中找到。生物分子的改变的表达可能与疾病诸如癌症相关。与此相关的术语包括患病风险增加以及疾病本身。表达可以以增加或减少的方式改变。RNA或蛋白质表达的定向改变可能与由直接作用于与病理病症相关的分子，或者由间接作用于此类分子(例如，其中改变的表达导致下游表达的变化，从而影响病理相关分子)所产生的治疗益处相关。

反义抑制剂：是指与其杂交的靶核酸分子的区域至少部分互补的寡聚化合物。如本文所用，“特异性于”靶核酸分子的反义抑制剂或反义寡核苷酸(也称为“反义化合物”)是与靶核酸分子特异性杂交并调节靶核酸分子表达的一种化合物。如本文所用，“靶”核酸是反义化合物被设计为与其特异性杂交和调节其表达的核酸分子。反义寡核苷酸的非限制性实例包括引物、探针、反义吗啉代、RNA干扰(RNAi)剂诸如小(或短)干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小(或短)发夹RNA(shRNA)和核酶。因此，可以将这些化合物作为单链、双链、环形、分支或发夹化合物引入，并且这些化合物可以包含结构元件诸如内部或末端凸起或环。双链反义化合物可以是杂交以形成双链化合物的两条链，或具有足够的自互补性以允许杂交和形成完全或部分双链化合物的单条链。

癌症：瘤形成的产物是赘生物(肿瘤或癌症)，其是由于过度的细胞分裂导致的组织异常生长。瘤形成是增殖性疾患的一个实例。“癌症细胞”是赘生性细胞，例如从肿瘤分离的细胞或细胞系。

实体瘤诸如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴类恶性肿瘤、胰腺癌症、乳腺癌症、肺癌症(诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌症、前列腺癌症、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、宫颈癌症、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在特定实施方式中，通过描述的组合物和方法靶向治疗的癌症是转移，包括实体瘤转移，而不是原发性(起源)肿瘤。应当注意，虽然术语转移通常用于大体上所有从原发性肿瘤扩散的癌症，但存在不同形式的癌症迁移，它们由不同的生物信号驱动并响应于不同的生物信号。这种独特迁移的一个实例是区域性嗜神经侵袭，其区别于远端转移(distantmetastase)，后者通常由于肿瘤细胞渗漏到血流中并借助于循环系统扩散而远离原发性肿瘤。

血液肿瘤的实例包括：白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、急性髓细胞性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性粒细胞性(粒细胞)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

化疗剂：一种抗癌症剂，在以异常细胞生长或增生为特征的疾病的治疗中具有疗效作用。此类疾病包括癌症、自身免疫性疾病以及以增生性生长为特征的疾病诸如银屑病。本领域技术人员可以容易地识别化疗剂(例如，参见Slapak and Kufe,Principles ofCancer Therapy,Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine,14thedition；Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17 in Abeloff,Clinical Oncology 2^nd ed.,

2000 Churchill Livingstone,Inc；Baltzer L,Berkery R(eds):Oncology PocketGuide to Chemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer DS,KnobfMF,Durivage HJ(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。化疗剂的非限制性实例包括ICL诱导剂，诸如美法仑(Alkeran^TM)、环磷酰胺(Cytoxan^TM)、顺铂(Platinol^TM)和白消安(Busilvex^TM、Myleran^TM)。化疗剂包括小分子、核酸、肽和基于抗体的治疗剂；所有这些的实例都是本领域已知的。免疫调节剂是化疗剂的其他实例，可增强受试者免疫系统对异物(诸如肿瘤，包括实体瘤)的活性。

药物递送装置(DDD)：向受试者提供治疗剂诸如反义抑制剂或化疗剂的装置。DDD的非限制性实例包括药物洗脱植入物和支架。LODER植入物在本文中描述，在特定的实例中，用于与RNAi剂一起使用，并且是说明性的DDD。

化合物的有效量：足以在被治疗的受试者中获得期望作用的化合物的量。在治疗过程期间，可以将有效量的化合物以单一剂量或以数个剂量给药，例如每日给药。然而，化合物的有效量将取决于施用的化合物、被治疗的受试者、病痛严重性和类型以及化合物的给药方式。

可注射组合物：药学上可接受的流体组合物，其包括至少一种活性成分，例如核酸包括RNAi剂、肽或抗体。活性成分通常溶解或悬浮于生理学上可接受的载体中，并且该组合物可以额外地包括少量的一种或多种无毒辅助物质，诸如乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等。可用于与本公开的组合物一起使用的这样的可注射组合物是常规的；适当的制剂在本领域中是公知的。

局部药物洗脱器(LODER)：毫米级药物递送可插入装置(DDD)或植入物，由其中并入了给定药物的聚合物组成。药物，诸如但不限于RNAi剂、小分子、肽或抗体，会在一段时间内释放到周围环境中，其将根据LODER组合物而变化。例如，在特定的实施方式中，LODER可以在数小时、数天、数周且甚至数月的时间内释放药物。除了聚合物和药物之外，LODER还可以包含改变(修饰)与LODER制造和/或体内内部环境相关的疏水性和/或pH的剂。特定的LODER制剂的实例在本文中进一步描述。

微RNA(miRNA)：短的单链RNA分子，通常为18-24个核苷酸长。由转录的非编码DNA的较长前体分子在细胞中内源性产生的miRNA可以抑制翻译，或通过与靶核酸的互补或近互补杂交来直接切割靶mRNA(Boyd,Lab Invest.,88:569-578,2008)。如本文所用，“微RNA序列”包括成熟的miRNA序列和前体序列两者。如本文所用，微RNA“种子序列”是与靶核酸完全互补的短序列，通常为约7个核苷酸长。

瘤形成、恶性、癌症和肿瘤：赘生物是由过度细胞分裂引起的组织或细胞的异常生长。赘生性生长可以产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以用肿瘤的数量、体积或重量来衡量。不转移的肿瘤称为“良性”。侵袭周围组织和/或可以转移的肿瘤称为“恶性”。恶性肿瘤也被称为“癌症”。

嗜神经侵袭(PNI)：在本文中也称为“区域性嗜神经侵袭”。癌症细胞的迁移与神经有关，并且迁移到神经层(神经外膜、神经束膜和神经内膜)周围和/或其内的空间。与神经组织密切关联是将PNI与更通常限定的发生在体内距离原发性肿瘤更远距离处的转移和癌症细胞迁移区别开的因素之一。PNI(即区域性PNI)最常与胰腺癌症诸如胰腺导管腺癌、胃癌、结直肠癌症、胆道肿瘤、前列腺癌症、宫颈癌症和头颈癌症的实体瘤相关。其在通常处于癌症早期阶段的患者中出现，通常是预后不良的表征，并且通常与癌症诱导的疼痛相关。

药物剂：当向受试者或细胞适当地给药时，能够诱导期望的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。孵育包括将靶标暴露于剂足够长的时间以使剂与细胞相互作用。接触包括将固体或液体形式的剂与细胞孵育，诸如将肿瘤与在悬浮液中的或并入到药物递送装置中的所述siRNA接触。

预防或治疗疾病：预防疾病是指抑制疾病的发展，例如抑制患有冠状动脉疾病的人中的心肌梗死的发展或者抑制患有赘生物的受试者中的肿瘤的进展或转移。治疗是指在疾病或病理病症开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。在特定实例中，癌症的治疗可以包括抑制疾病的进展和/或预防疾病的复发。在另一实例中，治疗可以包括使肿瘤对额外的治疗敏感或易于接受额外的治疗，诸如免疫调节治疗。

RNA干扰(RNA沉默；RNAi)一种基因-沉默机制，其中特异性分子诸如双链RNA(dsRNA)触发同源mRNA(也称为靶RNA)的降解。双链RNA可以是或被加工成小(或短)干扰RNA(siRNA)，其作为切割RNA诱导沉默复合物(RISC)中的同源mRNA的指导。然后靶RNA的残余物也可以充当siRNA；从而产生级联效应。RNAi剂包括可以直接用作siRNA、被加工成siRNA或产生siRNA的任何核酸，例如被转录以产生RNA的DNA，该RNA进而被加工成siRNA。

有义/反义链：包含RNA转录序列(从5’至3'方向读取)的dsDNA链是有义链，并且也称为“正向”链。相反，反向互补链，其用作细胞RNA聚合酶的模板，是反义链，并且也称为“反向”链。同样，在dsRNA分子中，“有义”链对应于靶基因编码序列，以及反义链对应于其反向互补物。

小干扰RNA：合成的或天然产生的小双链RNA(dsRNA)，其可以在无脊椎动物和脊椎动物物种中诱导对表达的基因特异性抑制。这些RNA适用于干扰或抑制靶基因的表达并且包括约15至约40个核苷酸的双链RNA，在每条链上包含3'和/或5'突出端(overhang)，具有0至约5个核苷酸的长度，其中双链RNA的序列与期望干扰或抑制表达的靶基因的编码区域的部分基本相同。双链RNA可以由互补ssRNA或由形成发夹的单链RNA或由来自DNA载体的表达形成。

受试者：活的多细胞生物，包括脊椎动物生物，其是包括人和非人哺乳动物两者的类别。

易感疾病或病症的受试者：能够、倾向于或易于发展疾病或病症的受试者。应当理解，已经患有或表现出疾病或病症的症状的受试者被认为是“易感的”，因为他们已经发展成该疾病或病症。

靶序列：靶序列是ssDNA、dsDNA或RNA的一部分，在与治疗有效的寡核苷酸杂交下，导致对靶标的表达的抑制。

治疗有效量：足以在被治疗的受试者中获得期望作用的化合物的量。在治疗过程期间，可以将有效量的化合物以单一剂量或以数个剂量给药，例如每日给药。然而，有效量将取决于施用的化合物、被治疗的受试者、病痛严重性和类型以及化合物的给药方式。

肿瘤床：实体瘤周围的组织。

II.几种实施方式的概述

本文描述了组合物，该组合物包括靶向选自以下的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A，该组合物用于抑制受试者中实体瘤的区域性嗜神经侵袭或与PNI相关的疼痛。

在特定的实施方式中，实体瘤为选自胰腺癌症、肺癌症和结直肠癌症的癌症。

在一些实施方式中，反义寡核苷酸剂是RNA干扰(RNAi)剂，其在某些实施方式中是双链RNAi剂。

在进一步特定的实施方式中，反义寡核苷酸剂是RNAi剂，该RNAi剂是选自以下的siRNA：具有如本文SEQ ID NO:10所示的有义链和如本文SEQ ID NO:11所示的反义链的siRNA，或者具有如本文SEQ ID NO:8所示的有义链和如本文SEQ ID NO:9所示的反义链的siRNA，或者具有如本文SEQ ID NO:12所示的有义链和如本文SEQ ID NO:13所示的反义链的siRNA。

在一些实施方式中，该组合物在生物聚合物药物递送装置(DDD)中提供至受试者，诸如在本文描述的任何LODER实施方式的一种或多种中如本文描述的作为局部药物洗脱器(LODER)的DDD。

本文还描述了用于通过向有此需要的受试者(即诊断患有实体瘤或怀疑患有实体瘤或易患实体瘤的受试者)给药治疗有效量的组合物来降低实体瘤的区域性嗜神经侵袭的方法，该组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。

在所述方法的特定实施方式中，实体瘤为选自胰腺癌症、肺癌症和结直肠癌症的癌症。

在所述方法的某些实施方式中，反义寡核苷酸剂为RNA干扰(RNAi)剂，诸如双链RNAi剂。

在所述方法的进一步特定实施方式中，反义寡核苷酸剂是RNAi剂，该RNAi剂是选自以下的siRNA：具有如本文SEQ ID NO:10所示的有义链和如本文SEQ ID NO:11所示的反义链的siRNA，或者具有如本文SEQ ID NO:8所示的有义链和如本文SEQ ID NO:9所示的反义链的siRNA，或者具有如本文SEQ ID NO:12所示的有义链和如本文SEQ ID NO:13所示的反义链的siRNA。

在所述方法的特定实施方式中，在生物聚合物药物递送装置(DDD)中向受试者给药该组合物，诸如在本文描述的任何LODER实施方式的一种或多种中如本文描述的作为局部药物洗脱器(LODER)的DDD。

在额外的实施方式中，本文描述的方法还可以用于降低与实体瘤的区域性嗜神经侵袭相关的疼痛，通过向有此需要的受试者给药治疗有效量的组合物，该组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRASG12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。

最后，本文描述的组合物可以用于制备用于抑制受试者中的与实体瘤相关的区域性嗜神经侵袭或疼痛的药剂。

III.用于降低嗜神经侵袭的组合物和方法

本文公开了以下观察结果：被设计为特异性靶向KRAS G12D或KRAS G12C的RNAi剂可在说明性癌症细胞系(包含KRAS G12C突变的胰腺癌症细胞系MIA PaCa-2)中显著抑制嗜神经侵袭(PNI)。还公开了以下观察结果：被设计为特异性靶向并敲低(knock down)突变KRAS等位基因G12D的表达的siRNA也可以显著敲低KRAS突变等位基因KRAS G12C、KRASG12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A的表达。

因此，本文描述了用于抑制和/或预防区域性PNI的组合物和方法，通过使用抑制以下所示KRAS G12X等位基因中的一种或多种的表达的反义寡核苷酸剂诸如RNAi剂：KRASG12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。可以将此类剂理解为“靶向”所示等位基因，即使未将它们设计为特异性靶向特定的突变等位基因序列。例如，如所示，被设计为特异性靶向KRAS G12D的siRNA也可以显著敲低并因此靶向几个G12X突变等位基因的表达。

在特定的实施方式中，反义寡核苷酸剂靶向包含以下突变等位基因的KRAS序列；KRAS G12D(SEQ ID NO:2)；KRAS G12C(SEQ ID NO:3)；KRAS G12V(SEQ ID NO:4)；KRASG12R(SEQ ID NO:5)；KRAS G12S(SEQ ID NO:6)；和/或KRAS G12A(SEQ ID NO:7)。

在进一步的特定实施方式中，将反义寡核苷酸剂设计为靶向KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO：1)。

在特定的实施方式中，反义寡核苷酸剂是被设计为靶向KRAS WT序列的siRNA剂，其中，有义序列如本文SEQ ID NO:8所示，以及反义序列如本文SEQ ID NO:9所示。在其他特定的实施方式中，反义寡核苷酸剂是被设计为靶向KRAS G12D序列的siRNA剂，其中，有义序列如本文SEQ ID NO:10所示，以及反义序列如本文SEQ ID NO:11所示。在仍其他的实施方式中，反义寡核苷酸剂是被设计为靶向KRAS G12C序列的siRNA剂，其中，有义序列如本文SEQ ID NO:12所示，以及反义序列如本文SEQ ID NO:13所示。

本文描述的组合物和方法用于通过使用反义寡核苷酸剂诸如RNAi剂来抑制和/或预防受试者中的区域性嗜神经侵袭(PNI)和/或疼痛。在特定的实施方式中，用于所述方法和组合物的RNAi剂为短(或小)干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微RNA。在其他实施方式中，用于所述组合物和方法的RNAi剂包括更长的多核苷酸分子，其在细胞内被加工以产生siRNA。特定的实例包括DsiRNA，其由RNase III类内切核糖核酸酶dicer切割成具有2-碱基的3'-突出端的21-23碱基双链体；UsiRNA，其是用非核苷酸非环单体修饰的双链体siRNA，称为未锁的核苷碱基类似物(UNA)，其中去除了核糖的两个相邻碳原子之间的键，并且其可以被设计为经由Dicer酶进入RNAi途径或直接转化为RISC；自递送RNA(sdRNA)，诸如RXi Therapeutics的

以及抑制polyA尾部添加的前体mRNA成熟步骤的剂，诸如U1接头(Integrated DNA Technologies(IDT)Inc)。

在某些实施方式中，RNAi剂的长度在25-30个核苷酸(nt)，诸如25-27nt和19-25-nt之间。在其他实施方式中，RNAi剂为19nt长。在其他实施方式中，有义链和/或反义链进一步包括1-6-nt 3'-突出端。在特定实施方式中，RNAi剂与其靶序列100％互补。在其他实施方式中，RNAi剂仅是部分互补的，具有与其靶序列不同的1、2、3或更多个核苷酸。在其他实施方式中，存在二碱基3'突出端。在更特定的实施方式中，有义链和反义链各自进一步包括2-nt 3'-突出端。在仍进一步的实施方式中，3'突出端由连续的脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸制成，使得2核苷酸的3'突出端是dTdT(例如在如本文SEQ ID NO 8-13所示的siRNA序列中)。在其他实施方式中，用于所述方法和组合物的siRNA具有19+2突出端设计，即有义和反义的19个碱基配对核苷酸和在每一条链的3'端处的两个未配对核苷酸。在某些实施方式中，如本文所示例的，突出端各自为dTdT。

在其他实施方式中，所述RNAi剂的一个或多个核苷酸由2'-OMe或2'-F修饰。在特定实施方式中，在所述siRNA的一条或两条链中进行此类修饰。所述修饰的序列可以在每一条链的3'端处具有突出端(在dsRNA RNAi剂的情况下)下使用，或者在其他实施方式中在每一条链的3'端处不具有突出端下使用。在某些实施方式中，突出端各自由两个未配对的核苷酸组成。在更特定的实施方式中，如本文所示例的，突出端各自为dTdT(2个脱氧胸腺嘧啶核苷残基)。

在其他实施方式中，独立于或附加于上文描述的修饰，可以对所述RNAi剂进行化学修饰。在特定的实施方式中，修饰是主链或连接(linkage)修饰。在另一实施方式中，修饰是核苷碱基修饰。在进一步的实施方式中，修饰是糖修饰。在更特定的实施方式中，包括上文描述的核苷酸修饰的修饰选自下表1中出现的修饰。在其他实施方式中，修饰选自锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)主链。其他修饰描述于美国专利申请公开No.2011/0195123中。

表1–RNAi剂修饰

在其他实施方式中，所述RNAi剂可以缀合至胆固醇、细胞穿透肽或α-生育酚-维生素E。在某些实施方式中，其中，RNAi剂为双链的，胆固醇可以缀合至有义链的3'端。在其他实施方式中，胆固醇可以缀合至有义链的5'端。在某些实施方式中，在发夹形分子的情况下，胆固醇可以缀合至环。美国专利申请公开No.2011/0195123中描述了缀合分子的这些和进一步的实例。

在某些实施方式中，RNAi剂经由共价连接或经由非共价复合与细胞穿透肽(CPP)关联，细胞穿透肽也称为蛋白转导结构域(PTD)，其可以促进将分子货物递送至细胞的细胞质。CPP的非限制性实例包括HIV-1Tat(NCBI基因ID：155871)或其包括序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:14)的片段；pAntp(penetratin)(NCBI基因ID：40835)；Isl-1(NCBI基因ID：3670)；Transportan,Pooga等人)，MPG(GALFLGFLGAAGSTMGA；SEQ ID NO：15)；以及Pep-1(KETWWETWWTEW；SEQ ID NO:16)。这些和其他CPP的序列和用途是本领域技术人员已知的。

在其他实施方式中，所述RNAi剂可以与以下阳离子分子复合，诸如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、精胺、PEI(聚乙烯亚胺)、PEI-PLA聚合物或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

在特定实施方式中，RNAi剂配制用于全身递送，在其他实施方式中，RNAi剂配制用于局部递送至治疗的区域，诸如在实体瘤的肿瘤床中和周围。用于全身和局部递送药物剂的一般方法和制剂在上文中有提及并且是本领域公知的。

在所述方法的特定实施方式中，将反义寡核苷酸剂诸如所述RNAi剂在生物聚合物组合物中提供至受试者。用于局部递送反义寡核苷酸的一种这样的生物聚合物组合物是包括反义寡核苷酸剂的可生物降解的药物递送装置(DDD或LODER)。将这种DDD植入实体瘤或周围的肿瘤床中，使得其反义有效载荷被释放到肿瘤或周围区域。在其他特定的实施方式中，可以将递送所述反义寡核苷酸剂的DDD植入肿瘤或肿瘤床外部，条件是它影响例如靶器官并提供区域性作用。

所述组合物的和用于所述方法的DDD通常由可生物降解的聚合物基质；和至少一种寡核苷酸剂诸如RNAi剂组成，其中RNAi剂被并入到生物可降解的聚合物基质中。

所述DDD可以是圆柱体、球体或适用于植入物(即，可以植入在受试者中)的任何其他形状。在特定的实施方式中，DDD是“毫米级”的。即，最小直径为至少0.3mm的装置。在某些实施方式中，尺寸(直径，在球体或圆柱体的情况下；以及高度和/或宽度或长度，在圆柱体、盒状结构、立方体或具有平坦壁的其他形状的情况下)中的每一个在0.3-10mm之间，包括端点值。在其他实施方式中，每个尺寸在0.5-8mm之间，包括端点值。在仍其他实施方式中，每个尺寸在0.8-5.2mm之间，包括端点值，1-4mm之间，包括端点值，1-3.5mm之间，包括端点值，1-3mm之间，包括端点值，或1-2.5mm之间，包括端点值。

在特定的实施方式中，装置是圆柱体，具有0.8mm的直径。在其他优选的实施方式中，圆柱体具有5.5mm的长度。在其他实施方式中，圆柱体具有约0.8mm的直径和5.5mm的长度。在其他实施方式中，所述方法和组合物的DDD具有18号(18-gauge)针的直径。

在其他实施方式中，装置的体积在0.1mm³至1000mm³之间、0.2mm³至500mm³之间、0.5mm³至300mm³之间、0.8mm³至250mm³之间、1mm³至200mm³之间、2mm³至150mm³之间、3mm³至100mm³或5mm³至50mm³之间。

在特定的实施方式中，DDD具有0.8mm的直径和5.5mm的长度，包含25％w/w siRNA，即约650μg的siRNA。

在其他实施方式中，剂:聚合物负载比w/w大于1:100。在更优选的实施方式中，负载大于1:20。在更优选的实施方式中，负载大于1:9。在仍更优选的实施方式中，负载大于1:3。

DDD由聚合物组成，其中寡核苷酸剂诸如siRNA，释放机制包括聚合物的本体侵蚀和寡核苷酸剂的扩散两者；或在一些实施方式中，使用不可降解的或缓慢降解的聚合物，其中主要释放机制是扩散并且DDD包括表面侵蚀和/或本体侵蚀，并且在一些实施方式中，DDD的外部部分起膜的作用，并且它的内部部分起药物储库的作用，内部部分实际上是分开的并且在长时间内(例如约一周至约几个月)不受周围环境的影响。任选地，也可以使用具有不同释放机制的具有或不具有多种赋形剂的不同聚合物的组合。在总药物释放时期的相当长的一段时间里，在表面处的浓度梯度优选是恒定的，并因此扩散速率是有效恒定的(称为“零模式”扩散)。术语“恒定”是指扩散速率维持在大于治疗有效性的下限阈值，但其仍然可以任选地具有初始突释和/或波动的特点，例如增加和减少到一定程度。在其他实施方式中，存在小于药物总量的10％的初始突释，其可以被认为可忽略不计。在其他实施方式中，存在药物总量的约20％的初始突释。在其他实施方式中，该设计使得能够存在药物总量的30％或更多的初始强突释。扩散速率优选地保持延长的时期，并且可以认为其恒定到一定水平以优化治疗有效时期，例如有效沉默时期。

在特定的实施方式中，DDD以受控方式释放所述寡核苷酸剂诸如RNAi剂，其将根据包括但不限于以下的因素而变化：DDD的组成聚合物、添加剂和表面与体积比率。例如，降低表面与体积比率将增加RNAi剂释放时间的持续时间。

将本文所述的DDD设计为具有特定的药物释放谱。一个相关参数是已经释放95％活性剂(例如反义寡核苷酸剂)的时间点。在一些实施方式中，DDD在体内释放95％的活性剂，例如在人前列腺或胰腺肿瘤中，在3-24个月(包括端点值)之间的时间段内，例如3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24个月以及其之间的任何持续时间，例如3-12、2-24、2-15或3-10个月(包括端点值)。另一相关参数是已经释放90％的活性剂的时间点；这可以是任何上述时间范围。

另一相关参数是在给定时间点释放的寡核苷酸剂的百分比。例如，在一些实施方式中，诸如在DDD释放RNAi剂的那些实施方式中，包括RNAi剂在内的80-99％在植入后3个月释放。在其他实施方式中，80-99％的活性剂在植入后2、4、6、9、12或24个月释放。替代地或另外，在一些实施方式中，在植入后的前3周期间从DDD释放不超过30-50％的RNAi剂。在某些实施方式中，在从植入开始的1个月的时间段内从DDD释放小于5％的RNAi剂。在其他实施方式中，在从植入开始的1个月的时间段内从DDD释放小于10％的RNAi剂。

延迟释放DDD与所述寡核苷酸剂一起使用。如本文所用，“延迟释放”是指在前2个月内不会释放超过10％的剂的DDD(不考虑有时发生的最高达20％的初始突释)。在其他实施方式中，DDD在前3个月内不会释放超过其药物负载的10％。在特定实施方式中，包含1％海藻糖的DDD呈现出延迟释放。

在其他实施方式中，DDD用不包含药物的缓慢降解的聚合物包覆(通过浸渍、喷涂或本领域技术人员已知的任何其他方法)。本文描述了缓慢降解的聚合物的各种实施方式，其中每一种都可以用于生成延迟释放DDD。在一些实施方式中，包覆物包含直链单糖；二糖；环状单糖，环状二糖。在其他实施方式中，包覆物包含选自乳糖、蔗糖、右旋糖酐和羟乙基淀粉的添加剂。在又其他实施方式中，包覆物包含甘露醇。替代地，包覆物可以包含海藻糖。在仍其他实施方式中，包覆物不包含糖。

DDD包含可生物降解的聚合物基质，其中并入了寡核苷酸(例如RNAi)剂。在特定的实施方式中，基质由聚(乳酸)(PLA)组成。在其他实施方式中，可生物降解的基质由聚(乙醇酸)(PGA)组成。在仍其他实施方式中，可生物降解的基质包括PLA和PGA的共聚物，称为聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)。

各种比率的PLA:PGA的PLGA基质是公知的，并且是可商购的。同样，用于制备并入RNAi剂的这种基质的方法在本领域是公知的。示例性的方法(包括涉及LODER的示例性方法)描述于美国专利申请公开No.2011/0195123中。在特定实施方式中，PLGA共聚物中的PLA:PGA比率在95:5至5:95之间，以及更特别地在25:75至75:25之间。在其他实施方式中，该比率在50:50至75:25之间，意指DDD中的共聚物的量包括50-75％之间的PLA和25-50％之间的PGA。在其他实施方式中，PLA:PGA比率在25:75至50:50之间、35:65至75:25之间、45:55至75:25之间、55:45至75:25之间、65:35至75:25之间、75:25至35:65之间、75:25至45:55之间、75:25至55:45之间或75:25至65:25之间。在其他实施方式中，PLA:PGA比率在80:20至90:10之间，包括端点值。在其他实施方式中，PLA/PGA比率大于75:25、在75:25至85:15之间或在75:25至95:5之间。替代地，该比率小于25:75、在25:75至15:85之间或在25:75至5:95之间。在一些实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比率在80:20至90:10之间，包括端点值，例如80:20、82:18、84:16、86:14、88:12或90:10。在其他实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比率大于75:25，例如76:24、78:22、80:20、82:18、84:16、86:14、88:12、90:10、92:8、94:6、96:4或98:2。在又其它实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比率小于25:75，包括端点值，例如24:76、22:78、20:80、18:82、16:84或14:86、12:88、10:90、8:92、6:94、4:96或2:98。

在其他实施方式中，可生物降解的聚合物基质由PEG(聚(乙二醇))组成，其可以为DDD的大部分或与本文所述的任何其他聚合物组合使用。

可以用于所述DDD的其他聚合物包括三嵌段PLA-PCL-PLA，其中PCL表示聚己内酯；聚(D,L-丙交酯)(DL-PLA)，聚(D,L-乙交酯)；或聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)。Makadia andSiegel,2011中尤其描述了设计包含PLA、PGA、PEG和/或PCL的可生物降解的受控药物递送载体以具有特定的释放谱。

在一些实施方式中，用于所述DDD的聚合物具有大于5千道尔顿(kDa)的分子量(MW)。在其他实施方式中，MW大于50kDa。在其他实施方式中，MW大于7kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa、70kDa、100kDa、150kDa或大于200kDa。在其他实施方式中，MW在5-100kDa之间、7-80kDa之间、10-60kDa、20-50kDa或25-50kDa之间。在特定的实例中，用包含具有高PLA:PGA比率诸如90:10和高于50KDa的MW(分子量)的PLGA共聚物的DDD可以获得延长的缓释(大约6个月)。通过使用PLA可以获得类似的作用。

在其他实施方式中，可生物降解的基质进一步包含一种或多种添加剂，用于多种目的，包括调节亲水-疏水相互作用；使药物分散，消除聚集；在高温或低温储存条件下保存药物；以及促进在植入物中生成影响药物从基质扩散的腔。

亲水-疏水相互作用在亲水性活性物质诸如siRNA被并入疏水性聚合物中的情况下可引起活性物质聚集，在生产期间或随后当将装置植入受试者体内并经受例如水解时导致聚集。降低这种相互作用的此类添加剂的非限制性实例为开放单糖，例如甘露醇；二糖诸如海藻糖；山梨糖醇；和其他环状单糖诸如葡萄糖、果糖、半乳糖，以及二糖诸如蔗糖，或任何其他冷冻保护剂。这些添加剂还在一些实施方式中随着水分子被代替通过与生物分子形成氢键来发挥作用，使得生物材料能够保持其原有的生理结构和功能。当为手性时，上述添加剂可以是D-对映异构体、L-对映异构体或外消旋混合物的形式。此类添加剂的额外的非限制性实例是乳糖、蔗糖、右旋糖酐和羟乙基淀粉。

在特定实施方式中，DDD具有1％至15％之间的甘露醇，诸如1％、1.5％、2％、2.5％、5％、7.5％、10％或12.5％和15％，或上述之间的任何量。

在其他特定的实施方式中，DDD具有小于5％的海藻糖，例如在不同的实施方式中0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％，可以很容易地测试其在RNAi剂释放中的作用。

在其他实施方式中，可生物降解的基质包括添加剂，用于在植入后保护剂诸如RNAi剂免受低pH的影响。DDD植入物内部的微环境趋向于酸性。当递送RNAi剂时，pH应当优选保持大于阈值。例如，包括PLGA的聚合物和包括RNAi药物的寡核苷酸可能会在pH<3下降解。因此，在更特定的实施方式中，诸如当DDD向实体瘤或肿瘤床提供RNAi剂时，这种pH调节(即pH改变)添加剂可以选自碳酸氢盐和碳酸盐，例如碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化镁。在特定的实例中，包括0.05％至约5％之间诸如约1％的浓度的碳酸氢钠。在其他实例中，包括小于1％的碳酸氢钠(或其他pH调节剂)，包括0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.4％和0.2％或甚至更少。在仍其他实例中，包括2％、3％、4％、5％或者1％至5％之间的任何增量的碳酸氢钠(或其他pH调节剂)。

所描述的DDD可以包含至少10μg的RNAi剂，诸如siRNA。在其他实施方式中，该量在每装置10-2000μg siRNA之间，包括每装置300-1700μg siRNA之间、每装置300-1100μgsiRNA之间或每装置400-900μg siRNA之间。在特定的实施方式中，除了本文描述的RNAi剂之外或作为本文描述的RNAi剂的替代，其他治疗剂可以并入所述DDD中并通过所述DDD递送。此类剂的非限制性实例包括靶向其他癌症相关基因的额外的RNAi剂；小分子化疗剂；以及其他生物免疫治疗剂，诸如但不限于免疫调节细胞因子和单克隆抗体。

应当理解，在给定的治疗中可以植入多个DDD。在作为批次(单次剂量)给药的所有DDD中的RNAi剂的量可以为至少4μg，例如至少5μg、至少6μg、至少7μg、至少8μg、至少10μg、至少12μg或至少15μg。在仍其他实施方式中，每剂量存在的RNAi剂的量在2-10μg之间，包括端点值，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10μg。

在又其他实施方式中，作为批次给药的所有DDD递送0.008-0.065mg/kg/月的剂量，包括端点值，例如0.008mg/kg/月、0.01mg/kg/月、0.015mg/kg/月、0.02mg/kg/月、0.03mg/kg/月、0.05mg/kg/月或0.065mg/kg/月。

在某些实施方式中，所述DDD的药物百分比为至少20％。在另一实施方式中，药物百分比为至少30％，例如30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在另一实施方式中，药物百分比在8-30％之间，包括端点值，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、26％、28％或30％。

如所述，可以考虑各种各样的DDD，采用各种量的聚合物、RNAi剂和任选的添加剂。此类DDD的特定非限制性实例如下。

在特定的实施方式中，DDD(LODER)包含64-76％PLGA(具有的PLA:PGA比率为90:10)；16-27％RNAi剂；和5-12％甘露醇，具有或不具有0.05％-1.5％碳酸氢钠。在其他特定的实施方式中，DDD可以为80-85％PLGA(具有的PLA:PGA比率为85:15)；10-12％siRNA；7.5-10％甘露醇；和0.1-0.3％碳酸氢钠。

在仍其他实施方式中，所述DDD包含海藻糖而不是甘露醇。在还其他实施方式中，DDD包含海藻糖和甘露醇两者。在更特定的实施方式中，DDD可以包含70-91.2％PLGA；8-30％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以包含75-91.2％PLGA；8-25％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在仍其他实施方式中，DDD可以包含80-91.2％PLGA；8-20％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在又其他实施方式中，DDD可以包含85-91.2％PLGA；8-15％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在额外的实施方式中，DDD可以包含88-91.2％PLGA；8-12％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在又其他实施方式中，DDD可以包含89-91％PLGA；8-10％siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％碳酸氢钠。在仍其他实施方式中，DDD可以包含约90％PLGA 85:15、约9％siG12D、约1％海藻糖和约0.2％NaHCO₃。在任何上述DDD制剂中，siRNA可以被替代的寡核苷酸剂诸如替代的核酸替换。

在其他实施方式中，所述DDD可以被包覆。可以针对多种特征设计包覆物，包括在长期储存期间调节释放速率或防止蛋白粘性。包覆物在一些实施方式中包括用于形成基质的相同材料，例如具有或不具有添加剂或者具有不同比率的添加剂但不具有寡核苷酸剂(例如RNAi剂)的PLGA共聚物基质。在其他实施方式中，包覆物包括与用于形成基质的材料相似的材料(例如包含不同比率的相同构建单元，或包含相同聚合物但具有不同MW)，仅不具有RNAi剂。在其他实施方式中，包覆物包括用于形成基质的相同材料连同至少一种其他聚合物材料诸如PEG。在其他实施方式中，包覆物包括PLA。在仍其他实施方式中，包覆物包括PLGA共聚物，其中PLA:PGA的比率为至少80:20，例如80:20、82:18、84:16、85:15、86:14、88:12、90:10、92:8、94:6、96:4、98:2和99:1，并且具有的MW大于50KDa，例如60KDa、70KDa、80KDa、100KDa、120KDa、1500KDa或200KDa)。

在特定实施方式中，所述DDD还包含寡核苷酸剂复合的小颗粒，其分布在DDD的可生物降解的聚合物基质内。小颗粒包括“微粒”和“纳米颗粒”，微粒包括具有在800nm–5μm范围内大小的颗粒(也称为微球)。纳米颗粒包括4nm–800nm范围内大小的颗粒。(～4nm的尺寸下限代表了此处描述的较小颗粒，其在典型实施方式中不是球体，而是分子复合物，例如药物分子，诸如siRNA分子，其与聚合物复合或与额外的一个或多个分子缀合))。

在某些实施方式中，颗粒包括如本文所述的聚合物材料，其可以与基质中的聚合物材料不同或相同。

“不同”是指聚合物由与基质中的构建单元不同的构建单元制成，或甚至与基质中的聚合物共享至少一种构建单元但具有不同组成。例如，颗粒可以由PLA组成，而DDD的周围基质可以由PLGA组成。在另一实例中，颗粒和DDD基质中的聚合物之间的差异包括：聚合物包含特定对映异构体，而非给定构建单元的外消旋混合物(L-PLA与DL-PLA)，聚合物包含不同比率的相同构建单元(具有相同或不同的分子量(MW))，或者包含相同的构建单元但具有不同的MW(具有相同或不同的比率)。“相同”是指聚合物具有相同构建单元、以相同比率并且具有相同MW。

应当理解，由与DDD基质的组成聚合物“相同”的聚合物组成的颗粒可以包含与基质不同的额外的材料。在特定的实施方式中，颗粒中的聚合物与基质中的聚合物不同。

在仍其他实施方式中，小颗粒不包括聚合物基质。例如，颗粒可以是脂质体。其他实例包括含有与RNAi剂复合的DOTAP或PEI或其他阳离子分子的颗粒，如上文类似描述的。

在包括剂复合的小颗粒的DDD的特定实施方式中，将颗粒复合物，例如siRNA-DOTAP复合物溶解在氯仿中并并入较大的PLA颗粒中。然后将这样的颗粒悬浮在乙酸乙酯中并与PLGA混合以形成基质。

在特定的实例中，DDD基质和小颗粒两者都与RNAi剂复合。在其他实例中，DDD基质不与RNAi剂复合，但悬浮颗粒与RNAi剂复合。在其中DDD基质和颗粒两者均与RNAi剂复合的那些实施方式中，RNAi剂可以在基质和颗粒中相同，也可以在基质和颗粒中不同。

包含小颗粒的DDD的额外实例，包括组成成分、生产方法等，可以在美国专利公开No.2013/0122096中找到，其内容通过援引整体并入本文。

本文所述的方法和组合物用于抑制和/或预防癌症(例如实体瘤)的区域性PNI和相关疼痛。在特定实施方式中，癌症是前列腺癌。在其他非限制性实施方式中，癌症是其他癌症，诸如选自以下的癌症：胰腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、脑癌症、肝癌症、肾癌症、黑素瘤、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、胆管癌、宫颈癌、头颈癌症和膀胱癌。在更特定的实施方式中，癌症选自胰腺癌、胰腺导管腺癌、小细胞肺癌和结肠直肠癌症。

在特定实施方式中，将延迟释放和非延迟释放DDD的混合物植入受试者中。在一些实施方式中，提供延迟释放和非延迟释放DDD的组合使得能够在较长时间过程中释放显著的化疗剂(例如siRNA)，而无需重复的治疗干预。

在一些实施方式中，瘤内植入所述DDD。在其他实施方式中，将DDD植入肿瘤附近。在更特定的实施方式中，在界限清楚的实体瘤的情况下，在肿瘤体积内间隔放置多个装置。在又其他实施方式中，沿肿瘤内的针腔植入多个装置。在仍其他实施方式中，植入一个或多个装置，使得它们不与肿瘤的周界直接接触。替代地，在实体瘤界限不清的情况下，将装置插入据信包含肿瘤细胞的区域。

提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些实施例不应解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方式。

实施例

实施例1：siG12D在背根神经节模型中抑制胰腺癌症细胞的神经侵袭

一般来说，实体瘤转移的特征之一，以及尤其对于胰腺癌症，是嗜神经侵袭(PNI)的高发生率，其导致了癌症患者诸如胰腺癌症患者所经历的疼痛的产生。该实施例测试了靶向KRAS G12D和G12C突变的siRNA(siG12D和siG12C)对胰腺癌症细胞向神经元迁移的作用。

方法

使用离体共培养模型来确定用靶向KRASG12C或KRASG12D的siRNA转染MIA PaCa-2细胞是否会导致向小鼠DRG(背根神经节)的降低的迁移。

用KRASG12C和KRASG12D siRNA转染后KRAS mRNA水平的分析

为了确定靶向KRASG12D或KRASG12C的siRNA的转染两者都在转录水平上下调KRAS的表达，将MIA PaCa-2细胞一式两份铺板在12孔板中，以70％汇合。次日，依照制造商的说明书，使用lipofectamine 3000(Invitrogen)，用指定浓度的KRASG12D特异性siRNA或KRASG12C特异性siRNA(分别为siG12D或siG12C)转染细胞。对于siG12D转染，将抗荧光素酶siRNA用作阴性对照。对于用siG12C的转染，使用来自Origene的非靶向siRNA。靶向KRASG12D的siRNA具有如本文SEQ ID NO:10(5’GUUGGAGCUGAUGGCGUAGdTdT 3’)所示的有义链和如本文SEQ ID NO:11(5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACdTdT-3’)所示的反义链。靶向KRASG12C的siRNA具有如本文SEQ ID NO:12(5-’GUUGGAGCUUGUGGCGUAGdTdT-3’)所示的有义链和如本文SEQ ID NO:13(5’-CUACGCCACAAGCUCCAACdTdT-3’)所示的反义链。转染后24小时，收集细胞并使用NucleoSpin RNA Plus试剂盒(MACHEREY-NAGEL)依照制造商的说明书纯化RNA。然后使用qScript cDNA Synthesis试剂盒(Quantabio)依照制造商的说明书将400ng的RNA转化为cDNA。然后我们通过delta delta ct法进行实时PCR以评价在用siRNA转染的细胞中KRAS转录物的相对量。将以下引物用于扩增KRAS转录物：正向：5′-GAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′(SEQ ID NO:17)。反向：5’-TTACTACTTGCTTCCTGTAGG-3’(SEQID NO:18)。将β-肌动蛋白用作管家基因内部对照：正向引物：5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3’(SEQ ID NO:19)，反向引物:5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'(SEQ ID NO:20)。

KRAS蛋白水平的分析

从用针对KRASG12C的siRNA或乱序对照siRNA转染的细胞制备细胞提取物，并在转染后48和72小时收集。使用抗KRAS抗体(Cell Signaling Technology Ras(27H5)兔mAB,cat#:S3339)通过标准蛋白质印迹分析评估KRAS蛋白水平。使用RIPA缓冲液制备蛋白提取物。通过Bradford试验定量蛋白浓度，并将等量负载到12％SDS-PAGE凝胶上，并然后转移至PVDF膜上。将ECL用于检测KRAS蛋白。我们使用管家基因β-肌动蛋白作为负载对照。

用于评估神经-癌症细胞相互作用的神经侵袭离体模型

Na’ara et al.；In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion:TheDorsal Root Ganglion Model.J Vis Exp.(110):e52990；2016中详细描述了离体试验技术。简而言之，使用CO₂安乐死杀死小鼠(C57BL/6J 2–4周龄)，并将其切除的DRG植入在降低的生长因子基底膜基质(Cultrex)中，邻近MIA PaCa-2细胞集落大约500μm处。将MIA PaCa-2细胞在转移到共培养板前48小时用指定的siRNA转染。培养物在包含10％FCS的RPMI-1640中在37℃和5％CO₂培养条件下生长。每天在显微镜下检查培养物，并评估神经侵袭。在植入后第13天，我们评估了每个治疗中显示向DRG侵袭的集落的百分比。在另一实验中，在植入后20天定性地观察PNI的程度。

结果

实验细胞系的选择

首先，我们检查了我们的内部KPC细胞系K989是否能够在DRG离体体系中向DRG迁移，如我们先前在人胰腺癌症细胞系MIA PaCa-2中观察到的。K989中的KRAS基因暴露出G12D突变，并且是在siG12D-LODER中对于siG12D siRNA的更合适的靶标。MIA PaCa-2细胞中的KRAS基因暴露出G12C置换。在我们的实验体系中，我们无法检测到K989细胞向DRG的迁移，并因此选择MIA PaCa-2用于本文讨论的其余实验。如下文和实施例2中描述的，siG12DsiRNA有效地敲低了KRAS G12C的表达，支持其在MIA PaCa-2细胞中用作特异性突变KRAS靶向剂。

siRNA转染后KRAS RNA转录物水平降低

我们用针对KRASG12D基因(siG12D)的siRNA(SEQ ID NO10和11)一式三份地转染MIA PaCa-2细胞。我们尝试了三种不同的浓度；1、100和400nM。我们发现KRAS转录物水平上的最大降低是在1nM siRNA的浓度下实现的。在此浓度下观察到模拟转染的细胞适度减少约60％在单独的实验中，我们转染了10nM的siG12D siRNA，并观察到转录物水平降低至模拟转染的细胞的～60％，类似于用1nM寡核苷酸观察到的作用(图1A和1B)。

当我们使用针对KRASG12C突变设计的siRNA(siG12C)(SEQ ID NO 12和13)时，我们发现KRAS转录物水平与模拟转染和乱序siRNA相比分别降低91％和85％(图1C和1D)。

siRNA转染后KRAS蛋白水平降低

通过蛋白质印迹分析用针对KRASG12C的siRNA(siG12C)或乱序对照siRNA一式三份转染的MIA PaCa-2细胞的提取物中的KRAS蛋白水平。将β-肌动蛋白用作负载对照。图2A和2C分别示出转染后48和72小时的细胞提取物的膜，用KRAS和β-肌动蛋白抗体探测。图2B和2D示出转染后48和72小时，β-肌动蛋白水平归一化后的KRAS信号强度。在转染后48小时(P<0.005)和转染后72小时(P<0.05)，在用KRASG12C siRNA转染的细胞的细胞提取物中归一化KRAS蛋白像素密度大约为用乱序siRNA转染的细胞中的一半。

KRAS沉默抑制神经——癌症细胞相互作用

将新鲜分离的背根神经节(DRG)置于培养皿的中间，并将来自相同治疗的四个MIAPaCa-2集落铺板在相对于DRG的12、3、6和9点钟位置(图3A)。细胞被培养基覆盖，并每日监测癌症细胞从主集落向DRG的迁移。铺板后13天的代表性图像如图3B所示。在第7天观察到乱序siRNA转染的细胞的第一次神经——癌症细胞相互作用。到第9天，我们还可以在用KRASG12C siRNA转染的细胞中看到神经突-癌症细胞相互作用。对于KRASG12D siRNA，我们可以在第12天观察到第一次相互作用。总体而言，在第14天(实验的最后一天)测量的每种治疗的总方向的相互作用速率，对于用乱序siRNA治疗的细胞为80％，对于用KRASG12CsiRNA治疗的细胞为40％，以及对于用KRASG12D siRNA治疗的细胞为17％。这些结果在图3C中示出。

在单独的实验中，将转化的PaCa-2细胞如上文所述铺板，并使其共培养20天。图4-6显示了在此时间段结束时拍摄的代表性图像。在图4中，在较低(顶部图)和较高(底部图)放大率下均可以清楚地看到从胰腺癌症细胞集落到DRG的PNI。相反，如图5和图6中示出，分别靶向KRASG12C和G12D的siRNA显著抑制PNI。在较低的放大率下(图5和图6两者中的顶部图)，没有看到连接MIA PaCa-2集落的迁移细胞。在较高的放大率下(底部图)，除了主MIAPaCa-2集落之外，只能观察到少数分散的细胞。

在siRNA转染后48小时测试细胞生存力，以验证siG12C和siG12D对PNI的抑制不是MIA PaCa-2细胞死亡的结果(数据未示出)。

讨论

在此实施例中，我们试图确定突变KRAS(在测试的细胞系MIA PaCa-2中的KRASG12C)的沉默是否会影响在体外细胞向DRG的迁移。我们使用了两种siRNA寡核苷酸；一种(siG12D)与siG12D-LODER的制剂相同，包含靶向在胰腺导管腺癌(PDAC)患者中最丰富的KRASG12D突变的siRNA。另一种(siG12C)特异性靶向在我们实验细胞系MIA PaCa-2中存在的突变KRASG12C。如预期，我们观察到KRASG12C寡核苷酸的更好的沉默。DRG迁移试验是三维离体分析，通常用于评估神经——癌症细胞相互作用。实验的结果表明，沉默突变的KRAS可以抑制神经元-癌症细胞相互作用和神经侵袭，由于我们观察到相互作用时间以及能够向DRG迁移的集落的速率两者均延迟。

实施例2：siG12D靶向多个KRASG12X突变等位基因

先前的实施例示出，靶向KRASG12D(siG12D)的siRNA也可以显著敲低携带KRASG12C突变的mRNA的表达。此实验重复并扩展了这一观察结果，证明了siG12D敲低多个突变等位基因的表达的能力。还示出了靶向野生型(WT)KRAS的siRNA类似地敲低几种突变KRAS等位基因的表达的能力。

方法

目的KRAS等位基因序列基于存储在NCBI(国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))数据库中的KRAS核苷酸序列(长度为567nt，编码从起始密码子到终止密码子的128aa)。

KRAS WT、G12D、G12C、G12V、G12R、G12S和G12A的核苷酸序列分别如本文SEQ ID NO1-7所示。靶向KRAS G12D的siRNA如实施例1中列出。靶向KRAS WT的siRNA具有如本文SEQID NO:8(5-’GUUGGAGCUGGUGGCGUAGdTdT-3’)所示的有义链和如本文SEQ ID NO:9(5’-CUACGCCACCAGCUCCAACdTdT-3’)所示的反义链。

使用包括1％Pen/Strep(ATCC CRL-1830，ATCC配制的Dulbecco's改良的Eagle's培养基，补充至包含10％FCS)的合适的培养基培养Hepa1-6细胞。此研究中使用的所有细胞类型均在37℃下，在具有5％CO2的气氛中，在加湿培养箱中培养。

将小鼠Hepa1-6细胞以20.000个细胞/孔的密度接种在白壁96孔组织培养板中，随后将细胞用目的siRNA连同七种不同的双-Glo报告基因质粒中的一种共转染。构建体基于包含R-Luc的3’-UTR情况下的KRAS(和衍生物)序列的来自Promega的psiCHECK-2载体(即KRAS WT、G12D、G12V、G12A、G12S、G12C和G12R的报告基因构建体)。根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen/Life Technologies)实施用siRNA和双-Glo报告基因构建体共转染细胞。

用以下siRNA浓度进行剂量反应实验：10、2.5、0.625、0.156、0.039、0.0098、0.0024、0.0006、0.00015和0.000038nM。使用适当的阳性和阴性对照。对于每个siRNA和对照，平行转染至少四个孔，并从每个孔收集个体数据点。

根据制造商的说明书进行双-Glo荧光素酶试验。使用1420发光计数器(WALLACVICTOR Light,Perkin Elmer,Rodgau-Jügesheim，德国)在底物的存在下在黑暗中在孵育后读取发光。对于具有KRAS siRNA治疗的细胞的每个孔，相对于在模拟或阴性对照siRNA治疗的细胞中的平均R-Luc/F-Luc活性，将R-Luc活性归一化为F-Luc活性。换言之，任何siRNA的活性都表示为相对于对照孔中的平均R-Luc活性(归一化为F-Luc活性)，治疗的细胞中的R-Luc活性百分比(归一化为F-Luc活性)。

结果

在剂量反应设置中，用三种目的siRNA(靶向KRAS WT、KRAS G12D和F-Luc)连同每一个双-Glo报告基因质粒转染Hepa1-6细胞。siRNA的最终浓度为10nM，经过九个4倍稀释步骤下降至3.8E-05nM。所有数据均一式四份地生成，细胞在转染后再次孵育24小时，随后进行双-Glo荧光素酶试验。这些分析的总结结果如表2所示。如表中所示，siG12D可以有效地靶向试验的KRAS突变等位基因的表达，从63.8％(G12S)至95.8％(G12D)的变化幅度。尽管显著，但siG12D针对G12C等位基因的敲低活性相对温和(表达降低65％)。然而，如实施例1所示，此靶向活性能够有效地抑制携带G12C的MIA PaCa-2细胞集落的的PNI。

除了siG12D针对所有测试的突变等位基因的敲低功效外，表2还示出靶向WT KRAS的siRNA能够有效地敲低突变等位基因表达。

表2：针对突变等位基因的KRAS siRNA的敲低活性

鉴于公开的发明的原理可应用于许多可能的实施方式，应当认识到所示实施方式仅为本发明优选的实施例，并且不应视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求这些权利要求的范围和精神内的所有内容都作为我们的发明。

序列表

<110> 思兰斯德有限责任公司(Silenseed Ltd.)

<120> 用于降低嗜神经侵袭和疼痛的组合物和方法

<130> PPI21172712IL

<150> US 62/849,166

<151> 2019-05-17

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 3

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 4

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctcgtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 6

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 7

<211> 567

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgctggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 8

guuggagcug guggcguagt t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 9

cuacgccacc agcuccaact t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 10

guuggagcug auggcguagt t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 11

cuacgccauc agcuccaact t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 12

guuggagcuu guggcguagt t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> DNA

<222> (20)..(21)

<400> 13

cuacgccaca agcuccaact t 21

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人免疫缺陷病毒

<400> 14

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp

1 5 10

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

gaggcctgct gaaaatgact g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 18

ttactacttg cttcctgtag g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 19

aaatctggca ccacaccttc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

ggggtgttga aggtctcaaa 20

Claims (17)

1.一种组合物，所述组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRASG12A，所述组合物用于抑制受试者中与实体瘤相关的区域性嗜神经侵袭或疼痛。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述实体瘤为选自由胰腺癌症、肺癌症和结直肠癌症组成的组的癌症。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中，所述反义寡核苷酸剂是RNA干扰(RNAi)剂。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述RNAi剂是双链RNAi剂。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述RNAi剂包括具有如本文SEQ ID NO:10所示的有义链和如本文SEQ ID NO:11所示的反义链的siRNA。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物在生物聚合物药物递送装置中提供至所述受试者。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述生物聚合物药物递送装置是局部药物洗脱器(LODER)。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物抑制与所述实体瘤相关的嗜神经侵袭。

9.一种用于降低实体瘤的区域性嗜神经侵袭的方法，所述方法包括：

向受试者给药治疗有效量的组合物，所述组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述实体瘤为选自由胰腺癌症、肺癌症和结直肠癌症组成的组的癌症。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸剂是RNA干扰(RNAi)剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述RNAi剂是双链RNAi剂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述RNAi剂包括具有如本文SEQ ID NO:10所示的有义链和如本文SEQ ID NO:11所示的反义链的siRNA。

14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中，在生物聚合物药物递送装置中向所述受试者给药所述组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述生物聚合物药物递送装置是局部药物洗脱器(LODER)。

16.一种用于降低与实体瘤的区域性嗜神经侵袭相关的疼痛的方法，所述方法包括：

向受试者给药治疗有效量的组合物，所述组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRAS G12A。

17.一种组合物，所述组合物包括靶向选自由以下组成的组的至少一种KRAS突变等位基因的反义寡核苷酸剂：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12S和KRASG12A，所述组合物用于制备用于抑制受试者中与实体瘤相关的区域性嗜神经侵袭或疼痛的药物。

Images