CN110691586A

CN110691586A - 用于癌症免疫疗法的组合物和方法

Info

Publication number: CN110691586A
Application number: CN201880034165.7A
Authority: CN
Inventors: 拉谢尔·马勒卡·加拜; 谢伊·罗特科夫; 阿莫茨·希米
Original assignee: Siland Co Ltd
Current assignee: Siland Co Ltd; Silenseed Ltd
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2020-01-14
Also published as: WO2018216014A1; EP3630060A1; US20200115712A1; JP2020520961A

Abstract

本文提供了用于改善癌症免疫疗法的治疗，并且特别是在实体瘤中。所描述的治疗包括持续释放寡核苷酸试剂，任选地与免疫治疗剂一起。还公开了用所描述的治疗来治疗癌症的方法。

Description

用于癌症免疫疗法的组合物和方法

相关申请的交叉引用

要求于2017年5月24日提交的美国临时专利申请No.62/510,281的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及用于改善癌症免疫疗法，并且特别是实体瘤中的癌症免疫疗法的治疗。所描述的治疗包括持续释放一种或多种化学治疗剂，包括寡核苷酸，包括RNA干扰剂。还公开了使用所描述的治疗来治疗癌症的方法，该方法另外地包括给药免疫治疗剂。

背景技术

癌症的免疫疗法，也称为免疫肿瘤学(IO)，利用免疫系统来治疗癌症。IO剂使用不同的方法，包括检查点阻断、嵌合抗原受体T细胞、疫苗接种等。在某些实体瘤中，检查点阻断，例如阻断CTLA-4和PD-1/PD-L1检查点的试剂，已显示出显著的临床反应。然而，许多患者对这种疗法没有反应。特别是，患有胰腺癌的患者，胰腺癌是美国第四最常见的癌症相关死亡的原因，在一些临床研究中显示没有(或非常有限的)反应(Royal 2010，Brahmer2012，Feig 2013，Javle 2016)。IO抵抗的原因尚不完全清楚，但显然与细胞毒性T细胞向实体瘤的有限浸润有关。尽管发现免疫细胞占胰腺肿瘤细胞质量的高达50％，免疫抑制调节T(T reg)细胞和髓样来源的抑制性细胞(MDSC)占主导地位，但几乎没有任何细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润肿瘤(Clark 2007)。已经提出，存在一个临界浓度，该临界浓度以下，包括CD8+ T细胞的白细胞的细胞溶解活性是无效的。此外，胰腺肿瘤中的血管功能障碍代表免疫疗法药物的全身性递送的另一主要障碍(Feig2012)。因此，持续需要改进针对癌症治疗的免疫疗法，并且特别是针对实体瘤的免疫疗法治疗。特别地，迫切需要促进包括CD8+和CD4+的T细胞以及NK和NKT细胞向肿瘤核心的浸润。

发明内容

本文提供了用于调理受试者中的实体瘤以进行免疫疗法治疗的组合物。所描述的组合物包括包含化学治疗剂的聚合物药物递送装置，化学治疗剂在递送到实体瘤和/或周围的微环境后调理实体瘤以进行免疫疗法治疗。

本文还提供了用于治疗实体瘤的组合物，其包括包含化学治疗剂的聚合物药物递送装置；以及免疫疗法组合物。

应当理解的是，所描述的组合物可以全部用于制备用于调理肿瘤和/或肿瘤微环境以进行免疫疗法的药物和/或用于治疗肿瘤的药物。

同样，所描述的组合物可以用于调理肿瘤和/或肿瘤微环境以进行免疫疗法的方法和/或治疗实体瘤的方法。

通过参考附图进行的以下详细描述，前述和其他目的、特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1A-1C示出了先前公布的siG12D-LODER对胰腺肿瘤中空隙体积的影响。影响在显微镜下示出(图1A)并定量(底部子图)。

图1D是条形图，示出了先前公布的siAR-LODER、siBMI1-LODER和siHSP90-LODER对前列腺肿瘤中坏死的影响，并且因此对空隙体积的影响。

图2A-2C示出了siG12D转染对TNF-α(图2A)、IFN-β(图2B)和IP-10(图2C)的胰腺肿瘤细胞表达的影响。

图3A-3D示出了siG12D转染对IFN-α(图3A)、IL-8(图3B)、IL1-RA(图3C)和MCP-1(图3D)表达的PBMC表达的影响。还示出了每种情况的阳性和阴性对照。

图4A-4B示出了体内siG12D-LODER在肿瘤组织中诱导IFNβ。图4A：5μg siG12D-LODER剂量主要增加了肿瘤周围IFNβ的表达。图4B：15μg siG12D-LODER剂量增加了整个肿瘤中IFNβ的表达。

图5A-5C示出了在治疗的和未治疗的样品之间对CD4染色(识别CD4+T细胞)的比较。使用PerkinElmer/Indica Labs的HALO^TM对细胞进行计数。图5A：在siG12D-LODER治疗的肿瘤中距LODER边缘不同的距离处计数对CD4染色呈阳性的细胞。图5B：在未治疗的肿瘤中，在距肿瘤中心不同距离处计数CD4-阳性细胞。这是通过计数LODER边缘/肿瘤中心周围0.5mm宽的同心环内的阳性染色的细胞来完成的。计数每个同心环内的所有细胞，并计算阳性染色的细胞浓度。结果显示，在siG12D-LODER治疗后，肿瘤中部中CD4+ T细胞的浓度更高了。图5C示出了siG12D-LODER对肿瘤内T细胞浓度和分布的定量的影响。

所描述的序列的简要说明

本文所提供的核酸序列使用37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写来表示。每个核酸序列仅显示一条链，但是互补链应理解为包括在对所显示链的任何引用中。序列表以名称为2142 10 2seq list_ST25的ASCII文本文件提交，该文件创建于2018年5月23日，大约6KB，其通过引用并入本文。在随附的序列表中：

SEQ ID NO:1是靶向KRAS G12D的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:2是靶向KRAS G12D的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:3是靶向雄激素受体(AR)的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:4是靶向雄激素受体(AR)的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:5是靶向BMI1的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:6是靶向BMI1的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:7是靶向HSP90的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:8是靶向HSP90的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:9是靶向KRAS G12D的2-O-met修饰的siRNA的反义链。

SEQ ID NO:10是靶向KRAS G12D的2-O-met修饰的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:11是细胞穿透肽Tat。

SEQ ID NO:12是细胞穿透肽MPG。

SEQ ID NO:13是细胞穿透肽Pep-1。

SEQ ID NO:14是靶向萤光素酶的siRNA的有义链。

SEQ ID NO:15是靶向萤光素酶的siRNA的反义链。

具体实施方式

I.术语

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一种”，“一个”和“所述”包括复数指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或(or)”旨在包括“和(and)”。术语“包含/含有(comprises)”意为“包括(includes)”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。另外，所有材料、方法和实例都是说明性的，而不是限制性的。

给药：通过所选择的途径将组合物引入受试者中。活性化合物或组合物的给药可以通过本领域技术人员已知的任何途径。给药可以是局部的或全身性的。局部给药的实例包括但不限于表面(topical)给药、肿瘤内给药、皮下给药、肌内给药、鞘内给药、眼内给药、局部眼科给药或通过吸入给药向鼻粘膜或肺给药。另外，局部给药包括通常用于全身给药的给药途径，例如通过将血管内给药引导至供应特定器官的动脉。因此，在特定的实施方式中，当这种给药针对供应特定器官的脉管系统时，局部给药包括动脉内给药和静脉内给药。局部给药还包括将活性化合物和试剂掺入可植入装置或构建体(诸如本文所描述的药物递送装置)中，其在延长的时间间隔内释放活性试剂和化合物以获得持续的治疗效果。可植入装置通过本领域已知的任何插入手段“植入”到组织或组织环境中，该组织或组织环境是指定治疗的区域。

全身性给药包括设计成经由循环系统在全身广泛分布活性化合物或组合物的任何给药途径。因此，全身性给药包括但不限于动脉内和静脉内给药。当这种给药用于通过循环系统在全身吸收和分布时，全身性给药还包括但不限于表面给药、皮下给药、肌内给药或通过吸入给药。

改变的表达：受试者中或来自受试者的生物样品中的生物分子(例如RNA(mRNA、miRNA等)或蛋白质)的表达偏离了在受试者中或来自受试者的生物样品中的相同生物分子对于与分子相关的生物条件具有正常的或未改变的特征的情况下的表达。正常表达可以在对照、人群标准和其他类似的表达的基线测量中找到。生物分子的改变的表达可能与疾病诸如癌症有关。与之相关的术语包括增加的发展疾病的风险以及疾病本身。表达可以以增加或减少的方式改变。RNA或蛋白质表达的直接改变可能与对病理状况相关分子的直接作用或对此类分子的间接作用所产生的治疗益处相关(例如，其中改变的表达会导致影响病理相关分子的下游表达的变化)。

抗体：蛋白质(或蛋白质复合物)，其包括本质上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一个或多个多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元通常是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条轻链(约25kD)和一条重链(约50-70kD)。每条链的N端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

如本文所用，术语抗体包括完整的免疫球蛋白以及通过用各种肽酶或基因工程人工抗体消化产生的许多充分表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)’₂——Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与V_H-C_H 1连接的轻链。F(ab)’₂可以在温和的条件下被还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’₂二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分的铰链区的Fab(参见，Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.,1993)。尽管根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是应该理解的是，Fab’片段可以通过化学或利用重组DNA方法从头合成。因此，本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。

在本公开内容的方法、组合物和系统中使用的抗体可以是单克隆或多克隆的。仅举例来说，单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-497，1975)或其衍生方法由鼠杂交瘤制备。用于单克隆抗体制备的详细程序在Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHL,New York,1988)中描述。

单链抗体(scFv)是一种基因工程分子，包含一个或多个抗体的V_H和V_L结构域，通过合适的多肽接头连接成基因融合的单链分子(参见，例如，Bird et al.,Science,242:423-426,1988；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5879-5883,1988)。双抗体是二价的双特异性抗体，其中，V_H和V_L结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并且生成两个抗原结合位点(参见，例如Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:6444-6448,1993；Poljak et al.,Structure,2:1121-1123,1994)。可以将一个或多个CDR共价地或非共价地掺入到分子中以使所得分子为免疫粘附素。免疫粘附素可以将CDR(一个或多个)作为较大的多肽链的一部分掺入，其可以将CDR(一个或多个)共价地连接到另一条多肽链，或者可以非共价地掺入CDR(一个或多个)。CDR允许免疫粘附素特异性结合至感兴趣的特定抗原。嵌合抗体是含有来自一个抗体的一个或多个区域和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区域的抗体。

抗体可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。

中和抗体或抑制性抗体是抑制靶标——通常是多肽——的至少一种活性的抗体，诸如通过阻断多肽与其正常结合的配体的结合，或通过破坏或以其他方式干扰多肽与第二多肽的蛋白质-蛋白质相互作用。活化抗体是增加多肽活性的抗体。抗体可以作为靶蛋白质活性的模拟物或作为靶蛋白质活性的阻断剂起作用，并在其中获得治疗效果。

反义抑制剂：指一种寡聚化合物，该寡聚化合物和与其杂交的靶核酸分子的区域至少部分互补。如本文所用，对靶核酸分子“特异”的反义抑制剂(也称为“反义化合物”)是与靶核酸分子特异性杂交并调节其表达的抑制剂。如本文所用，“靶”核酸是反义化合物被设计成与其特异性杂交并调节其表达的核酸分子。反义化合物的非限制性实例包括引物、探针、反义寡核苷酸、反义吗啉代、RNA干扰(RNAi)试剂，诸如小(或短)干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小(或短)发夹RNA(shRNA)和核酶。这样，这些化合物可以作为单链、双链、环状、支链或发夹状化合物引入，并且可以含有结构元件，诸如内部或末端的凸起(bulge)或环。双链反义化合物可以是杂交形成双链化合物的两条链，或者是具有足够的自互补性以允许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。

癌症：瘤形成的产物是瘤(肿瘤或癌症)，其是由于过度的细胞分裂导致的组织异常生长。瘤形成是增生性病症的一个实例。“癌细胞”是瘤的细胞，例如从肿瘤分离的细胞或细胞系。

实体瘤诸如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏(Ewing’s)肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌(诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯氏(Wilms’s)肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在特定的实施方式中，通过所描述的组合物和方法靶向治疗的癌症是非原发性肿瘤的转移。

血液肿瘤的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin’s)病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛性和高级形式)、多发性骨髓瘤、华氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和骨髓增生异常。

检查点抑制剂或检查点抑制抗体：一种试剂，特别是能够破坏导致T细胞活化之后的T细胞抑制的信号级联的抗体(或抗体样分子)，其作为本领域已知的免疫检查点机制的一部分。检查点抑制剂或检查点抑制抗体的非限制性实例包括针对CTLA-4(UniprotP16410)、PD-1(Uniprot Q15116)、PD-L1(Uniprot Q9NZQ7)和B7H3(CD276；UniprotQ5ZPR3)的抗体。

在本说明书的上下文中，检查点激动剂或检查点激动剂抗体包括但不限于能够参与导致T细胞活化的信号级联的抗体(或抗体样分子)，其作为本领域已知的免疫检查点机制的一部分。已知的刺激T细胞活化的受体的非限制性实例包括CD122和CD137(4-1BB；Uniprot Q07011)。术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体包括针对CD137的激动剂抗体。

在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(ipilimumab)(Yervoy；CASNo.477202-00-9)。

在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)与其受体PD-L1相互作用的抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自临床上可用的抗体药物纳武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb；CAS No 946414-94-4)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)(Merck Inc.；CASNo.1374853-91-4)、联合利妥昔单抗(pidilizumab)(CAS No.1036730-42-3)、阿特珠单抗(atezolizumab)(Roche AG；CAS No.1380723-44-3)和阿维鲁单抗(Avelumab)(Merck KGaA；CAS No.1537032-82-8)。

化学治疗剂：在治疗以异常细胞生长或增生为特征的疾病中具有治疗作用的抗癌剂。这样的疾病包括癌症、自身免疫疾病以及以增生性生长为特征的疾病，诸如牛皮癣。本领域技术人员可以容易地识别化学治疗剂(例如，参见Slapak and Kufe,Principles ofCancer Therapy,Chapter 86inHarrison's Principles of Internal Medicine,14thedition；Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17in Abeloff,Clinical Oncology 2^nd ed.,

2000Churchill Livingstone,Inc；Baltzer L,Berkery R(eds):Oncology PocketGuide to Chemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer DS,KnobfMF,Durivage HJ(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。化学治疗剂的非限制性实例包括ICL-诱导剂，诸如美法仑(Alkeran^TM)、环磷酰胺(Cytoxan^TM)、顺铂(Platinol^TM)和白消安(Busilvex^TM、Myleran^TM)。化学治疗剂包括小分子、核酸、肽和基于抗体的治疗剂；所有这些的实例在本领域中是已知的。增强受试者的免疫系统针对异物(诸如肿瘤，包括实体瘤)的活性的免疫调节剂是化学治疗剂的其他实例。

药物递送装置(DDD)：将治疗剂(诸如反义抑制剂或化学治疗剂)提供给受试者的装置。DDD的非限制性实例包括药物洗脱植入物和支架。本文描述了LODER植入物，其在特定实例中与RNAi试剂一起使用，并且是说明性的DDD。

有效量的化合物：足以在被治疗的受试者中获得期望效果的化合物的量。在治疗过程期间，有效量的化合物可以以单剂量或几个剂量给药，例如每天。然而，化合物的有效量将取决于所用化合物、所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及化合物的给药方式。

免疫疗法/癌症免疫疗法：调节(激活或抑制)免疫系统活性以治疗疾病的治疗性治疗。如本文所用，免疫疗法与癌症免疫疗法同义地使用，其更具体地指免疫疗法治疗的目标是癌细胞和/或肿瘤的靶向、抑制和/或消除。免疫治疗剂的非限制性实例包括检查点抑制剂和活化剂、抗体、天然和工程化免疫细胞，诸如G-CSF淋巴细胞，以及工程化用于适应性细胞转移的T细胞。

可注射组合物：药学上可接受的流体组合物，其包括至少一种活性成分，例如核酸，包括RNAi试剂、肽或抗体。活性成分通常溶解或悬浮在生理学上可接受的载体中，并且该组合物可以另外地包括少量的一种或多种无毒辅助物质，诸如乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等。可用于与本公开的组合物一起使用的此类可注射组合物是常规的；适当的制剂是本领域熟知的。

增加敏感性：增加靶细胞、组织或器官对给定治疗的敏感性。增加的敏感性尤其可以通过更大的治疗效果、更大的治疗效率等来测量。如本文所述，可以通过用将化学治疗剂递送至肿瘤或周围肿瘤床的药物递送装置预先或同时给药来增加实体瘤对癌症免疫治疗剂的效果的敏感性。

局部药物洗脱R(Local Drug EluteR)(LODER)：毫米级药物递送可插入装置(DDD)或植入物，其由掺进给定药物的聚合物组成。药物诸如但不限于RNAi试剂、小分子、肽或抗体，会在一段时间内释放到周围环境中，该时间根据LODER组合物而变化。例如，在特定的实施方式中，LODER可以在数小时、数天、数周以及甚至数月的时间内释放药物。除了聚合物和药物之外，LODER还可以含有改变(修饰)与LODER制造和/或体内内部环境有关的疏水性和/或pH的试剂。

微小RNA(miRNA)：通常18-24个核苷酸长的短的单链RNA分子。由转录的非编码DNA的较长前体分子在细胞中内源产生的miRNA可以抑制翻译，或可以通过与靶核酸的互补或近互补杂交来直接切割靶mRNA(Boyd,Lab Invest.,88:569-578,2008)。如本文所用，“微小RNA序列”包括成熟的miRNA序列和前体序列两者。如本文所用，微小RNA“种子序列”是短序列，通常约七个核苷酸长，其与靶核酸完全互补。

瘤形成、恶性肿瘤、癌症和肿瘤：瘤是由于过度细胞分裂导致的组织或细胞的异常生长。瘤的生长可以产生肿瘤。个体中肿瘤的数量是“肿瘤负荷”，其可以测量为肿瘤的数量、体积或重量。不转移的肿瘤称为“良性”。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤称为“恶性”。恶性肿瘤也称为“癌”。

药物试剂：当适当地给药于受试者或细胞时能够诱导期望的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。温育包括将靶标暴露于试剂足够的时间以使试剂与细胞相互作用。接触包括将以固体或液体形式的试剂与细胞一起温育，诸如使肿瘤与所述以悬浮液形式的或作为掺入药物递送装置中的siRNA接触。

调理(治疗靶标)：准备或预处理靶标组织、器官或细胞，以进行另外的治疗，从而调理治疗可改善另外的治疗的功效。功效的改善可以通过多种方式识别；其非限制性实例包括需要较小的治疗剂量以达到相同或改善的效果，或用标准剂量的功效是相对不采用调理的治疗的改善。在特定的实施方式中，向实体瘤(或周围组织床)给药提供化学治疗剂的药物递送装置(诸如LODER)可以调理肿瘤以进行免疫疗法治疗。

预防或治疗疾病：预防疾病是指抑制疾病的发展，例如抑制患有冠状动脉疾病的人中心肌梗塞的发展，或抑制患有瘤的受试者中肿瘤的进展或转移。治疗是指在疾病或病理状况已经开始发展后减轻其体征或症状的治疗干预。在特定实例中，癌症的治疗可以包括抑制疾病的进展和/或预防疾病的复发。在另一实例中，治疗可以包括使肿瘤对另外的治疗(诸如免疫调节治疗)敏感或易感。

放射治疗(放射疗法)：通过将受试者或其组织暴露于放射性物质来治疗疾病(例如，癌症或其他过度增生性疾病或病症)。放射疗法是将电离辐射作为癌症治疗的一部分来控制恶性细胞的医学用途。放射疗法可以用于治愈性或辅助性癌症治疗。在无法治愈的情况下，它被用作姑息治疗，且目的是为了局部疾病控制或症状缓解。

RNA干扰(RNA沉默；RNAi)：一种基因沉默机制，其中特异性分子(诸如双链RNA(dsRNA))触发同源mRNA(也称为靶标RNA)的降解。双链RNA可以是或被加工成小(或短)的干扰RNA(siRNA)，其作为在RNA诱导的沉默复合物(RISC)中切割同源mRNA的指导。然后，靶标RNA的残余部分也可以充当siRNA；因此引起级联效应。RNAi试剂包括可以直接用作siRNA、被加工成siRNA或产生siRNA的任何核酸，例如被转录以产生RNA的DNA，而该RNA又被加工成siRNA。

有义/反义链：含有RNA转录序列(从5'到3'方向读取)的dsDNA链是有义链，并且也称为“正向”链。用作细胞RNA聚合酶的模板的相反的反向互补链是反义链，并且也称为“反向”链。同样地，在dsRNA分子中，“有义”链对应于靶基因编码序列，并且反义链对应于其反向互补序列。

小干扰RNA：合成的或天然产生的小双链RNA(dsRNA)，其可以在无脊椎动物和脊椎动物物种中诱导基因特异性的表达抑制。这些RNA适用于干扰或抑制靶基因的表达，并且包括约15至约40个核苷酸的双链RNA，其在每条链上含有具有0至约5个核苷酸的长度的3'和/或5'悬突，其中，双链RNA的序列与需要干扰或抑制表达的靶基因的编码区的一部分基本相同。双链RNA可以由互补的ssRNA形成或者由形成发夹的单链RNA形成或者由来自DNA载体的表达形成。

小分子(抑制剂)：通常分子量小于1000道尔顿，或在一些实施方式中小于约500道尔顿的分子，在特定的实施方式中，其能够在某种可测量的程度上抑制某些靶标分子的活性。

受试者：包括脊椎动物生物的活的多细胞生物，脊椎动物生物是包括人类和非人类哺乳动物的一类。

易感疾病或病症的受试者：能够、倾向于或容易发展疾病或病症的受试者。可以理解的是，已经患有疾病或表现出疾病或病症的症状的受试者被认为是“易感的”，因为他们已经发展了疾病或病症。

靶序列：靶序列是ssDNA、dsDNA或RNA的一部分，其在与治疗有效的寡核苷酸杂交后，引起对靶标的表达的抑制。

治疗有效量：足以在被治疗的受试者中获得期望效果的化合物的量。在治疗过程期间，有效量的化合物可以以单剂量或多个剂量给药，例如每天。然而，有效量将取决于所应用的化合物、所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及该化合物的给药方式。

肿瘤床：实体瘤周围的组织。

II.几种实施方式的概述

本文提供用于调理受试者中的实体瘤以进行免疫疗法治疗的组合物。所描述的组合物包括包含化学治疗剂的聚合物药物递送装置，化学治疗剂在递送到实体瘤和/或周围的微环境后调理实体瘤以进行免疫疗法治疗。

在特定的实施方式中，聚合物药物递送装置包括生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物基质，其包括选自由以下组成的组的聚合物：聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)和聚己内酯(PCL)。

在某些特定的实施方式中，化学治疗剂是核酸、肽、小分子、抗体或其片段或其组合。例如，核酸可以是单链RNA或双链RNA干扰(RNAi)试剂，在某些实施方式中，其是本文中称为KRAS siG12D的siRNA。

在其他特定实施方式中，其中，聚合物药物递送装置(DDD)是局部药物洗脱R(LODER)，其包括75-90％的PLGA(85:15)、5-15％的甘露醇和0.1-0.5％的碳酸氢钠。

在另外的实施方式中，所描述的组合物还包括免疫疗法组合物，诸如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。在特定的示例性实施方式中，PD-1抑制剂是帕博利珠单抗(Keytruda)或纳武单抗(Opdivo)或其生物类似物；PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Durvalumab)(Imfinzi)或其生物类似物；并且CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)或其生物类似物。

在特定的实施方式中，聚合物药物递送装置包括生物相容性聚合物基质，该基质包括选自由以下组成的组的聚合物：聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)和聚己内酯(PCL)。

在某些特定的实施方式中，化学治疗剂是核酸、肽、小分子、抗体或其片段，或它们的组合。例如，核酸可以是单链RNA或双链RNA干扰(RNAi)试剂，在某些实施方式中，其是本文中称为KRAS siG12D的siRNA。

在特定的实施方式中，所描述的组合物用于治疗是胰腺肿瘤的实体瘤。

在另外的实施方式中，所描述的组合物还包括免疫疗法组合物，诸如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。在特定的示例性实施方式中，PD-1抑制剂是帕博利珠单抗(Keytruda)或纳武单抗(Opdivo)或其生物类似物；PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Imfinzi)或其生物类似物；并且CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)或其生物类似物。

还描述了所述组合物用于制备用于所指示治疗的药物的用途，以及按照指示通过向有需要的受试者给药以使用所述组合物进行治疗的方法。

III.用于增强癌症免疫疗法的药物递送装置

本文描述的观察结果是，通过聚合物递送装置(包括可生物降解的聚合物递送装置)递送到实体瘤的化学治疗剂将诱导肿瘤中以及特别是肿瘤微环境中的物理变化。本文描述的这种变化也称为“调理”肿瘤和/或肿瘤微环境。这些变化包括但不限于间质流体压力(IFP)中和“空隙体积”(未被细胞占据的体积)中的变化，例如在Shemi et al,2015中描述的，细胞因子和趋化因子水平以及包括新抗原呈现的生物学反应的变化。肿瘤微环境中的这种变化在本文中被描述为使肿瘤和肿瘤微环境可以被特异性和非特异性免疫系统试剂(例如，CD8T细胞、NKT细胞、细胞因子等)浸润。这些观察结果表明，通过这种组合物的化学治疗剂的这种递送将调理实体瘤以进行免疫疗法治疗。

鉴于这些观察，本文描述了用于调理实体瘤以进行免疫疗法治疗的方法和组合物。在所描述的方法中，将包括化学治疗剂的可生物降解的药物递送装置(DDD或LODER)植入实体瘤或周围肿瘤床中，从而使其化学治疗有效负荷被释放到肿瘤或周围区域。

DDD通常由可生物降解的聚合物基质以及至少一种化学治疗剂(诸如RNAi试剂)组成，其中，化学治疗剂被掺入可生物降解的聚合物基质中。

所描述的DDD可以是柱体、球体或适用于植入物(即可以被植入受试者内)的任何其他形状。在特定实施方式中，DDD是“毫米级”的。即，最小直径为至少0.3mm的装置。在某些实施方式中，每个尺寸(在球体或柱体的情况下为直径；以及在柱体、箱状结构、立方体或其他具有平坦壁的形状的情况下为高度和/或宽度或长度)在0.3-10mm(含端值)之间。在其他实施方式中，每个尺寸在0.5-8mm(含端值)之间。在其他实施方式中，每个尺寸在0.8-5.2mm(含端值)之间，在1-4mm(含端值)之间，在1-3.5mm(含端值)之间，在1-3mm(含端值)之间，或者在1-2.5mm(含端值)之间。

在特定的实施方式中，该装置是具有0.8mm直径的柱体。在其他优选实施方式中，柱体具有5.5mm的长度。在其他实施方式中，柱体具有约0.8mm的直径和5.5mm的长度。在其他实施方式中，所描述的方法和组合物的DDD具有18号针头的直径。

在其他实施方式中，装置的体积在0.1mm³至1000mm³之间，在0.2mm³至500mm³之间，在0.5mm³至300mm³之间，在0.8mm³至250mm³之间，在1mm³至200mm³之间，在2mm³至150mm³之间，在3mm³至100mm³之间，或在5mm³至50mm³之间。

在特定的实施方式中，DDD具有0.8mm的直径和5.5mm的长度，含有25％w/w的siRNA，即约650μg的siRNA。

在其他实施方式中，w/w试剂:聚合物负载比高于1:100。在更优选的实施方式中，负载高于1:20。在更优选的实施方式中，负载高于1:9。在更优选的实施方式中，负载高于1:3。

DDD由聚合物组成，其中化学治疗剂(诸如siRNA)的释放机理包括聚合物的体积溶蚀和化学治疗剂的扩散两者；或者在一些实施方式中，使用不可降解或缓慢降解的聚合物，其中主要的释放机理是扩散，并且DDD包括表面溶蚀和/或体积溶蚀，并且在一些实施方式中，DDD的外部部分用作膜，并且其内部部分用作药物储存器，其实际上是分离的并且在较长时间内(例如，从约一周至约几个月)不受周围环境的影响。也可以任选地使用具有不同释放机理的具有或不具有几种赋形剂的不同聚合物的组合。表面处的浓度梯度优选在整个药物释放时期的重要时期是恒定的，并且因此，扩散速率实际上是恒定的(称为“零模式”扩散)。术语“恒定”是指扩散速率维持在治疗效果的较低阈值之上，但是仍可以任选地以初始爆发和/或波动为特征，例如增加和减少至一定程度。在其他实施方式中，初始爆发少于药物总量的10％，这可以被认为是可忽略的。在其他实施方式中，初始爆发为药物总量的约20％。在其他实施方式中，该设计能够实现药物总量的30％或更多的初始强爆发。优选长时间地这样维持扩散速率，并且可以认为其恒定到一定水平以优化治疗有效期，例如有效沉默期。

在特定的实施方式中，DDD以受控方式释放化学治疗剂，诸如RNAi试剂，其将根据包括但不限于DDD的组成聚合物、添加剂和表面积与体积比的因素而变化。例如，降低表面积与体积比将增加RNAi试剂释放时间的持续时间。

本文描述的DDD被设计为具有特定的药物释放曲线。一个相关参数是释放95％活性剂的时间点。在一些实施方式中，DDD在体内(例如在人体前列腺或胰腺肿瘤中)释放95％的活性剂经历3-24个月(含端值)之间的时间段，例如3、4、5、6、8、10、12、14、16、16、18、20、22或24个月以及在例如3-12、2-24、2-15或3-10个月(含端值)之间的任何持续时间。另一个相关参数是释放90％活性剂的时间点；其可以是任一上述时间范围。

另一相关参数是在给定时间点释放的化学治疗剂的百分比。例如，在一些实施方式中，诸如在其中DDD释放RNAi试剂的那些实施方式中，在植入后3个月释放了80％-99％(含端值)的RNAi试剂。在其他实施方式中，在植入后2、4、6、9、12或24个月释放了80-99％的活性剂。替代地或另外，在一些实施方式中，在植入后的前3周内从DDD中释放了不超过30-50％的RNAi试剂。在某些实施方式中，从植入开始的1个月的时间段内，从DDD释放了少于5％的RNAi试剂。在其他实施方式中，从植入开始的1个月的时间段内，从DDD释放了少于10％的RNAi试剂。

延迟释放的DDD与所描述的化学治疗剂一起使用。如本文所用，“延迟释放”是指在最初的2个月内释放不超过10％试剂的DDD(不计入有时会发生的最高达20％的初始爆发)。在其他实施方式中，DDD在前3个月内释放不超过其药物负荷的10％。在特定的实施方式中，含有1％海藻糖的DDD显示出延迟释放。

在其他实施方式中，使用不含药物的缓慢降解的聚合物涂覆DDD(通过浸涂、喷涂或本领域技术人员已知的任何其他方法)。本文描述了缓慢降解的聚合物的各种实施方式，每种实施方式都可以用于产生延迟释放的DDD。在一些实施方式中，涂层包含直链单糖；二糖；环状单糖，环状二糖。在其他实施方式中，涂层包含选自乳糖、蔗糖、葡聚糖和羟乙基淀粉的添加剂。在其他实施方式中，涂层包含甘露醇。替代地，涂层可以包含海藻糖。在其他实施方式中，涂层不包含糖。

DDD含有可生物降解的聚合物基质，在其中掺入了化学治疗剂(例如RNAi)。在特定的实施方式中，基质由聚(乳酸)(PLA)组成。在其他实施方式中，可生物降解的基质由聚(乙醇酸)(PGA)组成。在其他实施方式中，可生物降解的基质包括PLA和PGA的共聚物，称为聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)。

不同比例的PLA:PGA的PLGA基质是熟知的并且可以商购获得。同样地，用于制备掺有RNAi试剂的这样的基质的方法是本领域中熟知的。示例性方法描述于美国专利申请公开No.2011/0195123中。在特定的实施方式中，PLGA共聚物中的PLA:PGA比例在95:5至5:95之间，并且更特别地在25:75至75:25之间。在其他实施方式中，该比例在50:50至75:25之间，意味着DDD中共聚物的量包括50-75％之间的PLA和25-50％之间的PGA。在其他实施方式中，PLA:PGA比例在25:75至50:50之间，在35:65至75:25之间，在45:55至75:25之间，在55:45至75:25之间，在65:35至75:25之间，在75:25至35:65之间，在75:25至45:55之间，在75:25至55:45之间，或在75:25至65:25之间。在其他实施方式中，PLA:PGA比例在80:20至90:10(含端值)之间。在其他实施方式中，PLA/PGA比例大于75:25，在75:25至85:15之间，或在75:25至95:5之间。替代地，该比例小于25:75，在25:75至15:85之间，或在25:75至5:95之间。在一些实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比例在80:20至90:10(含端值)之间，例如80:20、82:18、84:16、86:14、88:12或90:10。在其他实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比例大于75:25，例如76:24、78:22、80:20、82:18、84:16、86:14、88:12、90:10、92:8、94:6、96:4或98:2。在其他实施方式中，共聚物具有的PLA:PGA比例小于25:75(含端值)，例如24:76、22:78、20:80、18:82、16:84或14:86、12:88、10:90、8:92、6:94、4:96或2:98。

在其他实施方式中，可生物降解的聚合物基质由PEG(聚(乙二醇))组成，其可以是DDD的大部分或与本文所描述的任何其他聚合物组合使用。

可以在所描述的DDD中使用的其他聚合物包括三嵌段PLA-PCL-PLA，其中，PCL表示聚己内酯；聚(D,L-丙交酯)(DL-PLA)，聚(D,L-乙交酯)；或聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)。Makadia and Siegel,2011中尤其描述了含有PLA、PGA、PEG和/或PCL的以具有特定释放曲线的可生物降解的受控药物递送载体的设计。

在一些实施方式中，在所描述的DDD中使用的聚合物具有的分子量(MW)大于5千道尔顿(kDa)。在其他实施方式中，MW大于50kDa。在其他实施方式中，MW大于7kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa、70kDa、100kDa、150kDa或大于200kDa。在其他实施方式中，MW在5-100kDa之间，在7-80kDa之间，在10-60kDa之间，在20-50kDa之间或在25-50kDa之间。在扩展的特定实例中，可以使用含有PLGA共聚物的DDD来实现缓慢释放(大约6个月)，该PLGA共聚物具有高的PLA:PGA比例，诸如90:10，并且MW(分子量)高于50KDa。通过使用PLA可以达到类似的效果。

在其他实施方式中，可生物降解的基质还包含用于各种目的的一种或多种添加剂，该目的包括调节亲水-疏水相互作用；使药物分散，消除聚集；在高温或低温储存条件下保存药物；以及促进在植入物中产生影响药物从基质扩散的空腔。

在亲水性活性物质(诸如siRNA)掺入到疏水性聚合物中的情况下，亲水-疏水相互作用可能导致活性物质聚集，因而在生产期间或随后将装置植入受试者体内并进行例如水解时导致聚集。减少这种相互作用的这样的添加剂的非限制性实例是开放的单糖，例如甘露醇；二糖，诸如海藻糖；山梨糖醇；以及其他环状单糖，诸如葡萄糖、果糖、半乳糖和二糖，诸如蔗糖或任何其他冷冻保护剂。在一些实施方式中，这些添加剂还通过在水分子被置换时与生物分子形成氢键而起作用，使得生物材料能够保留其固有的生理结构和功能。当呈手性时，上述添加剂可以是D-对映体、L-对映体或外消旋混合物的形式。另外，这样的添加剂的非限制性实例是乳糖、蔗糖、葡聚糖和羟乙基淀粉。

在特定的实施方式中，DDD具有1％至15％之间的甘露醇，诸如1％，1.5％、2％、2.5％、5％、7.5％、10％或12.5％和15％，或之间的任何量。

在其他特定的实施方式中，DDD具有小于5％的海藻糖，例如在不同的实施方式中为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％，可以很容易地测试其对RNAi试剂释放的影响。

在其他实施方式中，可生物降解的基质包括用于保护试剂(诸如RNAi试剂)免受植入后低pH影响的添加剂。DDD植入物内部中的微环境往往呈酸性。当递送RNAi试剂时，pH应优选维持在阈值以上。例如，包括PLGA的聚合物和包括RNAi药物的寡核苷酸可能在pH<3时降解。因此，在更具体的实施方式中，诸如当DDD是向实体瘤或肿瘤床提供RNAi试剂时，这种pH调节(即pH改变)添加剂可以选自碳酸氢盐和碳酸盐，例如碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化镁。在特定的实例中，包括的碳酸氢钠的浓度在0.05％至约5％之间，诸如约1％。在其他实例中，包括的碳酸氢钠(或其他pH调节剂)小于1％，包括0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.4％和0.2％或甚至更少。在其他实例中，包括的碳酸氢钠(或其他pH调节剂)为2％、3％、4％、5％或者1％至5％之间的任何增量。

所描述的DDD可以含有至少10μg的RNAi试剂，诸如siRNA。在其他实施方式中，其量为每个装置10-2000μg之间的siRNA，包括每个装置300-1700μg之间的siRNA，每个装置300-1100μg之间的siRNA或每个装置400-900μg之间的siRNA。在特定的实施方式中，除了本文所描述的RNAi试剂之外或作为其替代，可以将其他治疗剂掺入所述DDD中并由所述DDD递送。这样的试剂的非限制性实例包括靶向其他癌症相关基因的另外的RNAi试剂；小分子化学治疗剂和其他生物免疫治疗剂，诸如但不限于免疫调节细胞因子和单克隆抗体。

应当理解的是，可以在给定治疗中植入多个DDD。在作为一个批次(单剂量)给药的所有DDD中RNAi试剂的量可以为至少4μg，例如至少5μg，至少6μg，至少7μg，至少8μg，至少10μg，至少12μg或至少15μg。在其他实施方式中，每个剂量存在的RNAi试剂的量在2-10μg(含端值)之间，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10μg。

在其他实施方式中，作为一个批次给药的所有DDD递送的剂量为0.008-0.065mg/kg/月(含端值)，例如0.008mg/kg/月、0.01mg/kg/月、0.015mg/kg/月、0.02mg/kg/月、0.03mg/kg/月、0.05mg/kg/月或0.065mg/kg/月。

在某些实施方式中，所描述的DDD的药物百分比为至少20％。在另一实施方式中，药物百分比为至少30％，例如30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在另一实施方式中，药物百分比在8％-30％(含端值)之间，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、26％、28％或30％。

如所描述的，可以考虑各种各样的DDD，采用各种量的聚合物、RNAi试剂和任选的添加剂。这样的DDD的特定非限制性实例如下。

在特定的实施方式中，DDD(LODER)含有64-76％的PLGA(其中，PLA:PGA的比例为90:10)；16-27％的RNAi试剂；和5-12％的甘露醇，含或不含.05％-1.5％的碳酸氢钠。在其他特定的实施方式中，DDD可以是80-85％的PLGA(PLA:PGA的比例为85:15)；10-12％的siRNA；7.5-10％的甘露醇和0.1-0.3％的碳酸氢钠；

在其他实施方式中，所描述的DDD含有海藻糖而不是甘露醇。在其他实施方式中，DDD包括海藻糖和甘露醇两者。在更具体的实施方式中，DDD可以含有70-91.2％的PLGA；8-30％的siRNA；0.6-1.5％的海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以含有75-91.2％的PLGA；8-25％的siRNA；0.6-1.5％的海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以含有80-91.2％的PLGA；；8-20％的siRNA；0.6-1.5％海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以含有85-91.2％的PLGA；8-15％的siRNA；0.6-1.5％的海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在另外的实施方式中，DDD可以含有88-91.2％的PLGA；8-12％的siRNA；0.6-1.5％的海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以含有89-91％的PLGA；8-10％的siRNA；0.6-1.5％的海藻糖；和0.1-0.4％的碳酸氢钠。在其他实施方式中，DDD可以含有约90％的PLGA 85:15，约9％的siG12D，约1％的海藻糖和约0.2％的NaHCO₃。在以上任何一种DDD制剂中，siRNA都可以被替代的化学治疗剂替换，诸如替代的核酸、小分子或基于肽的试剂(例如抗体)。

在其他实施方式中，所描述的DDD可以被涂覆。涂层可以被设计成用于多种特性，包括调节释放速率或防止长期存储期间的蛋白质粘着。在一些实施方式中，涂层包括用于形成基质的相同材料，例如具有或不具有添加剂或具有不同比例的添加剂但不具有化学治疗剂(例如RNAi试剂)的PLGA共聚物基质。在其他实施方式中，涂层包括与用于形成基质的材料相似的材料(例如，含有不同比例的相同结构单元，或含有相同的聚合物但具有不同的MW)，仅没有RNAi试剂。在其他实施方式中，涂层包括与用于形成基质的材料相同的材料，以及至少一种其他聚合物材料，诸如PEG。在其他实施方式中，涂层包括PLA。在其他实施方式中，涂层包括PLGA共聚物，其中，PLA:PGA的比例为至少80:20，例如80:20、82:18、84:16、85:15、86:14、88:12、90:10、92:8、94:6、96:4、98:2和99:1，且具有的MW大于50KDa，例如60KDa、70KDa、80KDa、100KDa、120KDa、1500KDa或200KDa。

在特定的实施方式中，所描述的DDD还含有化学治疗剂复合的小颗粒，其分布在DDD的可生物降解的聚合物基质内。小颗粒包括“微粒”和“纳米颗粒”。微粒包括尺寸在800nm–5μm范围内的颗粒(也称为微球)。纳米颗粒包括尺寸在4nm–800nm范围内的颗粒。(～4nm的较小尺寸代表本文描述的较小颗粒，在典型的实施方式中，它不是球体，而是分子复合物，例如与聚合物复合或与另外的分子(一个或多个)缀合的药物分子，诸如siRNA分子)。

在某些实施方式中，颗粒包括如本文所描述的聚合物材料，其可以与基质中的聚合物材料不同或相同。

“与......不同”是指聚合物由不同于基质中的结构单元组成或者甚至与基质中的聚合物共享至少一种结构单元，但具有不同的组成。例如，颗粒可以由PLA组成，而DDD周围的基质可以由PLGA组成。在另一实例中，颗粒中的聚合物与DDD基质之间的差异包括含有给定结构单元的特定对映体而不是其外消旋混合物的聚合物(L-PLA与DL-PLA)，含有不同比例的相同结构单元的聚合物(具有相同或不同的分子量(MW))，或含有相同的结构单元但具有不同的MW(具有相同或不同的比例)。“与……相同”是指聚合物具有相同结构单元、以相同的比例并具有相同的MW。

应当理解的是，由与DDD基质的构成聚合物“相同”的聚合物组成的颗粒可以含有不同于基质的另外的材料。在特定的实施方式中，颗粒中的聚合物与基质中的聚合物不同。

在其他实施方式中，小颗粒不包括聚合物基质。例如，颗粒可以是脂质体。其他实例包括包含DOTAP或PEI或与RNAi试剂复合的其他阳离子分子的颗粒，正如上文所描述的。

在包括试剂复合的小颗粒的DDD的特定实施方式中，将颗粒复合物(例如siRNA-DOTAP复合物)溶解于氯仿中并掺入较大的PLA颗粒中。然后将这些颗粒悬浮在乙酸乙酯中，并与PLGA混合以形成基质。

在特定的实例中，DDD基质和小颗粒两者均与RNAi试剂复合。在其他实例中，DDD基质不与RNAi试剂复合，但是悬浮的颗粒与RNAi试剂复合。在其中DDD基质和颗粒两者均与RNAi试剂复合的那些实施方式中，RNAi试剂在基质和颗粒中可以是相同的或在基质和颗粒中不同。

含有小颗粒的DDD的其他实例，包括组成成分、生产方法等，可以在美国专利公开No.2013/0122096中找到，其全部内容通过引用并入本文。

在特定的实施方式中，用于所述方法和组合物中的RNAi试剂是短(或小)干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微小RNA。在其他实施方式中，RNAi试剂包括在细胞内被加工以产生siRNA的较长的多核苷酸分子。特定的实例包括DsiRNA，其被RNase III类核糖核酸内切酶dicer切割成具有2-碱基的3'--悬突的21-23个碱基的双链体；UsiRNA是用非核苷酸无环单体修饰的双链siRNA，称为未锁定的核碱基类似物(UNA)，其中，核糖的两个相邻碳原子之间的键被除去，并且其可以设计成通过Dicer酶进入RNAi途径或直接进入RISC；自递送的RNA(sdRNA)，诸如Rxi疗法的

以及抑制聚腺苷酸(polyA)尾部添加的前体mRNA成熟步骤的试剂，诸如U1接合体(adaptor)(Integrated DNA Technologies(IDT)Inc)。

在某些实施方式中，RNAi试剂的长度在25-30个核苷酸(nt)之间，诸如25-27nt和19-25-nt。在其他实施方式中，RNAi试剂的长度为19nt。在其他实施方式中，有义链和/或反义链还包括1-6-nt的3'-悬突。在特定的实施方式中，RNAi试剂与其靶序列100％互补。在其他实施方式中，RNAi试剂仅部分互补，具有1、2、3或更多个与其靶序列不同的核苷酸。在其他实施方式中，存在两个碱基的3'-悬突。在更具体的实施方式中，有义链和反义链各自还包括2-nt的3'-悬突。在其他实施方式中，3’悬突由连续的脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸组成，使得2nt的3’悬突为dTdT。在其他实施方式中，在所描述的方法和组合物中使用的siRNA具有19+2悬突设计，即有义和反义的19个碱基配对的核苷酸以及在每条链的3'末端处的两个未配对的核苷酸。在某些实施方式中，如本文所举例说明的，悬突各自为dTdT。

在其他实施方式中，所描述的RNAi试剂的一个或多个核苷酸被2'-OMe或2'-F修饰。在特定的实施方式中，这种修饰在所描述的siRNA的一条或两条链中进行。所描述的修饰序列可以与每条链的3'末端处的悬突一起使用，或者在其他实施方式中在每条链的3'末端处没有悬突(在dsRNA RNAi试剂的情况下)。在某些实施方式中，每个悬突由两个未配对的核苷酸组成。在更具体的实施方式中，如本文所例示的，悬突各自为dTdT(2个脱氧胸腺嘧啶残基)。

在其他实施方式中，可以对所述RNAi试剂进行化学修饰，和上述修饰分开或除上述修饰之外。在特定的实施方式中，该修饰是骨架或连接修饰。在另一实施方式中，该修饰是核苷碱基修饰。在另一实施方式中，该修饰是糖修饰。在更具体的实施方式中，包括上述核苷酸修饰的修饰选自下表1中所示的修饰。在其他实施方式中，该修饰选自锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)骨架。其他修饰在美国专利申请公开No.2011/0195123中描述。

表1–RNAi试剂修饰

在其他实施方式中，所描述的RNAi试剂可以与胆固醇、细胞穿透肽或α-生育酚-维生素E缀合。在某些实施方式中，其中RNAi试剂是双链的，胆固醇可以缀合至有义链的3'末端。在其他实施方式中，胆固醇可以缀合至有义链的5'末端。在某些实施方式中，在发夹形分子的情况下，胆固醇可以缀合至环。缀合分子的这些和其他实例在美国专利申请公开No.2011/0195123中描述。

在某些实施方式中，RNAi试剂通过共价连接或通过非共价复合与细胞穿透肽(CPP)结合，细胞穿透肽也称为蛋白质转导域(PTD)，其可以促进分子货物递送到细胞的细胞质。CPP的非限制性实例包括HIV-1Tat(NCBI基因ID：155871)或其包括序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID No:11)的片段；pAntp(穿透肽(penetratin))(NCBI基因ID：40835)；Isl-1(NCBI基因ID：3670)；运输肽(Transportan)，Pooga et al)，MPG(GALFLGFLGAAGSTMGA[SEQ ID No:12)；和Pep-1(KETWWETWWTEW；SEQ ID No:13)。CPP对于本领域技术人员是已知的，并且尤其在Deshayes et al.中进行了描述。

在其他实施方式中，所描述的RNAi试剂可以与阳离子分子复合，诸如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]–N,N,N-三甲基铵)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、精胺、PEI(聚乙烯亚胺)、PEI-PLA聚合物或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

在特定的实施方式中，将RNAi试剂配制成用于全身递送，在其他实施方式中，将RNAi试剂配制成用于局部递送至治疗区域。

在其他实施方式中，在所描述的方法和组合物中利用替代的化学治疗(在本文中也称为“抗癌”)剂作为替代的或额外的RNAi试剂。

在更具体的实施方式中，化学治疗剂包括嘧啶类似物，其非限制性实施例为5-氮杂胞苷、5-杂氮-2'-脱氧胞苷、5-氟-尿嘧啶、5-氟-脱氧尿苷(氟尿苷)和5-氟脱氧尿苷单磷酸。在更具体的实施方式中，抗癌剂是核糖核苷二磷酸还原酶大亚基的抑制剂(EC1.17.4.1)，其非限制性实例是莫特沙芬钆(CHEBI：50161)；羟基脲；吉西他滨(gemcitabine)(2',2'-二氟脱氧胞苷)；艾西拉滨(Elacytarabine)(CP-4055；ara-C-5'反油酸酯)和CP-4126，(CO 1.01；吉西他滨-5'反油酸酯；Adema AD et al,Metabolism andaccumulation of the lipophilic deoxynucleoside analogs elacytarabine and CP-4126.Invest New Drugs.2011Oct 15)和WO2011062503中描述的那些，其内容通过引用并入本文。在甚至更具体的实施方式中，抗癌剂包括吉西他滨。在替代的实施方式中，抗癌剂是吉西他滨。在其他实施方式中，抗癌剂是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。在其他实施方式中，抗癌剂包括胸苷酸合酶抑制剂。在更具体的实施方式中，抗癌剂包括醛氢叶酸(亚叶酸；2-[[4-[(2-氨基-5-甲酰基-4-氧-1,6,7,8-四氢蝶呤-6-基)甲基氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸)。在其他实施方式中，抗癌剂包括伊立替康(irinotecan)。在其他实施方式中，抗癌剂包括奥沙利铂(oxaliplatin)。在其他实施方式中，抗癌剂包括FOLFIRIN(5-氟尿嘧啶、醛氢叶酸和伊立替康的组合)。在其他实施方式中，抗癌剂是FOLFIRINOX(5-氟尿嘧啶、醛氢叶酸、伊立替康和奥沙利铂的组合)，或FOLFIRINOX中四种试剂的子集的任何组合。在一种实施方式中，除DDD之外给药的试剂可以是改进的FOLFIRINOX，其如下给药：奥沙利铂(85mg/m²)-IV持续2小时，紧接着是伊立替康(180mg/m²)-IV持续90min。醛氢叶酸–400mg/m²，然后每两周氟尿嘧啶连续的IV输注2,400mg/m²(超过46小时)。在其他实施方式中，抗癌剂包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂。在更具体的实施方式中，抗癌剂是厄洛替尼(Erlotinib)。在特定的实施方式中，除DDD之外还给药抗癌剂，并且在给药抗癌剂的同时、之前或之后给药DDD。

本文所描述的方法和组合物用于调理癌症(例如实体瘤)以进行免疫疗法。在特定的实施方式中，癌症是前列腺癌。在其他非限制性实施方式中，癌症是另一种癌症，诸如选自胰腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、脑癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、胆系癌、宫颈癌和膀胱癌。在更具体的实施方式中，癌症选自胰腺癌、胰腺导管腺癌、小细胞肺癌和结直肠癌。

在特定的实施方式中，将延迟释放和非延迟释放的DDD的混合物植入受试者中。在一些实施方式中，提供延迟释放和非延迟释放的DDD的组合使得显著的化学治疗剂(例如siRNA)释放的时间进程更长，而不需要重复的治疗干预。

在一些实施方式中，将所描述的DDD植入瘤内。在其他实施方式中，将DDD植入到肿瘤附近。在更具体的实施方式中，在界限清楚的实体瘤的情况下，几个装置在肿瘤体积内间隔开。在其他实施方式中，将几个装置沿着肿瘤内的针腔植入。在其他实施方式中，植入一个或多个装置，使得它们不与肿瘤的周边直接接触。替代地，在实体瘤界限不清楚的情况下，将装置插入被认为含有肿瘤细胞的区域。

如本文所示，使用递送化学治疗剂的DDD将调理实体瘤以进行免疫疗法治疗。因此，在DDD植入的同时或之后，向受试者提供免疫疗法。

在特定的实施方式中，免疫疗法组合物包括免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1和CTLA4抑制剂。用于所描述的方法并与所描述的组合物一起使用的免疫治疗剂的非限制性实例包括纳武单抗

一种PD-1抗体；伊匹单抗

一种CTLA-4抗体；帕博利珠单抗(MK-3475)，一种PD-1抗体；由CStone Pharmaceuticals开发的抗体：CS1001(抗-PD-L1)、CS1002(抗-CTLA-4)和CS1003(抗-PD-1)；ZKAB001(抗-PD-L1，China Oncology Focus/Sorrento Therapeutics)；SHR-1210(抗-PD-1，上海恒瑞医药有限公司)；JS-001(抗-PD-1，上海君实生物科技有限公司)；IBI308(抗-PD-1，InnoventBiologics)；PLX3397，一种KIT、CSF1R和FLT3的酪氨酸激酶抑制剂；MGA271，一种靶向B7-H3的抗体；

一种溶瘤病毒，能够在带有激活的RAS途径的癌细胞中特异性复制；德瓦鲁单抗(MEDI4736)：一种PD-L1抗体+/-替西木单抗(Tremelimumab)，一种CTLA-4抗体；MGD009，一种B7-H3 x CD3 DART蛋白；RO70097890，一种CD40抗体；algenpantucel-L；患有晚期癌症的患者中的NY-ESO-1蛋白，其癌症表达NY-ESO-1；GVAX疫苗+/-纳武单抗；树突状细胞疫苗；TERT疫苗；IL-12疫苗；适应性细胞疗法，例如工程化为靶向特定抗原的T细胞；单克隆抗体疗法(除以上所列出的以外)；辅助免疫疗法；和细胞因子疗法。

以上和其他免疫治疗剂在线列出于cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/impacting-all-cancers/pancreatic-can cer。其他免疫治疗剂包括例如MPDL3280A，一种抗-PD-L1抗体，PF-05082566，一种抗-4-1BB/CD137抗体，以及Urelumab(BMS-663513)。其他免疫治疗剂包括SIRP-α拮抗剂：OSE-172(Boehringer Ingelheim andOSE Immunotherapeutics)CD47拮抗剂：Hu5F9-G4–(Forty Seven)、CC-90002(Celgene)、TTI-621和TTI-622(Trillium Therapeutics)。STING(干扰素基因的刺激物)激活剂：ADU-S100/MIW815(Aduro Biotech)和MK-1454(Merck)。同样地，免疫治疗剂列于Liu and Wu,2017。

上述治疗方法可以与上述任何化学治疗剂的另外给药相关联或不关联。例如，单独的吉西他滨、吉西他滨+白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、厄洛替尼、FOLFIRINOX药物组合(氟尿嘧啶[5-FU]、醛氢叶酸、伊立替康和奥沙利铂)或该组合中的一种或几种。

在特定的实施方式中，将药物递送装置直接插入肿瘤中或周围的肿瘤床中，并且全身或局部地给药免疫治疗剂。在其他实施方式中，免疫治疗剂包括在DDD中，并因此被直接递送到肿瘤中或肿瘤的区域中。

在其他实施方式中，无论是通过单独的局部注射还是通过全身的给药方法(IV、IP、肌肉内或甚至口服方法)，均将免疫治疗剂与聚合物药物递送装置分开地给药至患者。

在特定的实施方式中，将聚合物药物递送装置以单次给药插入肿瘤中/肿瘤床中，然后在1、2、3、4、5、6周或1、2、3、4、5、6个月或最长达36个月或更长的进程中多次给药免疫治疗剂。

在另外的实施方式中，除了所述免疫治疗剂之外或代替所述免疫治疗剂，本文描述的治疗还可以包括全身给药的传统/标准护理化学治疗剂。

在其他实施方式中，所描述的方法包括向患者施用放射疗法。在一些实施方式中，在给药DDD之后，诸如在给药DDD之后最长达10天，向患者施用放射。替代地，在给药DDD的同时向患者施用放射。在其他实施方式中，在给药DDD之前向患者施用放射。在其他实施方式中，在正在施用放射期间给药DDD。

提供以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的具体特征或实施方式。

实施例

实施例1：递送siRNA的LODER增加肿瘤坏死和空隙体积

siG12D-LODER是含有靶向突变的KRAS的siRNA的毫米级聚合物试剂。它通过超声引导的内窥镜插入(非注射)到肿瘤中并连续释放siRNA至少四个月。突变的KRAS在超过90％的胰腺癌患者群体中占主导地位，但到目前为止，KRAS已被认为是使用经典小分子方法“无成药性的”靶标。siG12D-LODER已在临床前动物模型、标准动物毒理学方案以及1/2a阶段临床研究中进行了研究(分别为Zorde-Khvalevsky 2013和Shemi 2015；Ramot 2016；Golan 2015)。在临床前模型中，我们已经观察到KRAS-G12D的特异性沉默与细胞凋亡和坏死之间的相关性。这些影响持续数月。

在本文描述的实验中研究了siG12D-LODER对肿瘤微环境的另外的影响，即肿瘤空隙体积(未被细胞占据的体积)的变化。

通过将在100μL PBS中的10⁶个对数生长期的活Panc 02细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠中来建立肿瘤异种移植物。将细胞注射到小鼠的侧腹。当肿瘤达到80mm³的平均体积时，在麻醉下将含有5μg siG12D、siLuc的LODER或空白LODER植入肿瘤中。

LODER(在本文中也称为DDD)是嵌有药物物质的光滑、微型、棒状聚合物(PLGA基质)管。用于植入小鼠的siG12D-LODER的长度为～2.5-3mm，并且直径为～0.9mm。如本文所述，已对几种LODER制剂进行了类似效果的测试。当前和以下实施例中示出的实验使用的LODER包括约80-85％的PLGA(85:15)；约10-12％的siRNA，如所示；约5-10％％的甘露醇和约0.1-1％的碳酸氢钠。

以下序列用于本文所述的实验中。在以下序列中，大写字母表示RNA碱基，并且强调的粗体大写字母表示DNA碱基。所有核苷酸之间的键都是磷酸二酯。

siG12D序列：

有义：5’-GUU GGA GCU GAU GGC GUA GTT-3’(SEQ ID NO:1)

反义：5’-CUA CGC CAU CAG CUC CAA CTT-3’(SEQ ID NO:2)

siLuc序列：

有义：5’-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT(SEQ ID NO:14)

反义：5’-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT(SEQ ID NO:15)

在治疗后的不同时间点处死小鼠，并且肿瘤用福尔马林固定并包埋石蜡(FFPE)。为了进行组织学分析，将组织切成5μm切片，用苏木精和伊红(H&E)染色。H&E染色允许检测细胞和组织结构。

插入siG12D-LODER后约一周，我们观察到了肿瘤微环境的变化，“空隙体积”从视野的～0％增加至～10％(见图1A-图1C)。空隙体积的增加表示局部肿瘤环境的开放(Shemiet al 2015)。

递送siRNA的LODER的坏死效应不是细胞型或siRNA特异性效应。如图1D所示(改编自US 2017/0283803)，LODER递送的siRNA用于靶向雄激素受体基因(siAR-LODER；SEQ IDNO 3和4)、BMI1基因(siBMI1-LODER；SEQ ID NO 5和6)，并且热休克蛋白90基因(siHSP90-LODER；SEQ ID NO 7和8)也诱导增加的肿瘤坏死。

实施例2：siRNA转染和siRNA-LODER的非特异性免疫刺激作用

除了特异性基因沉默和/或翻译阻滞药物之外，包括反义、微小RNA、dsRNA和siRNA在内的寡核苷酸也可以引发非特异性免疫刺激。事实上，在临床前研究中，siG12D转染(体外)和siG12D-LODER(体内)提高了肿瘤抑制细胞因子(包括IFNα、IFNβ和TNF)的水平。

为了研究siG12D诱导先天性免疫应答的潜力，将PANC-1细胞用siG12D或siG12D-8'(2-O-met–修饰的siRNA，SEQ ID NO 9和10用于对比)进行转染或温育。用聚(I:C)温育用作阳性对照。使用可商购的PCR引物，通过实时PCR对TNF-α和IFN-β诱导进行评估(图2A-图2B)。

这些结果表明，用siG12D转染的PANC-1细胞，siG12D将诱导TNF-α和IFN-β的表达。

为了确定siG12D诱导的IFN-β是否被分泌并以自分泌方式诱导下游信号传导，使用ELISA试验对转染了siG12D的PANC-1(KRAS G12D突变)和BxPc3(KRAS wt)细胞进行IP10细胞因子的分泌的评估。PANC-1细胞在未处理的细胞和siG12D转染的细胞之间显示出明显的差异，在siG12D转染的PANC-1细胞中的应答与聚(I:C)阳性对照中的应答处于相同范围。在非KRAS突变的胰腺癌细胞系BxPc3细胞中也观察到了响应siG12D的IP-10分泌。与PANC-1细胞中的应答相似，在BxPc3中，经siG12D和聚(I:C)处理的细胞也显示出相似的应答，尽管与在PANC-1细胞中观察到的结果相比程度较小(图2C)。

还在人外周血单核细胞(PBMC)中研究了通过siG12D的细胞因子诱导。新鲜的人PBMC是通过Ficoll梯度离心从三个不同(匿名)健康供体的血沉棕黄层(离心血液、富集白细胞并去除红细胞)中制备的。使用两种不同的转染反应(Dotap和Geneporter-2)以3种不同的浓度转染siG12D。使用了阳性和阴性对照。人PBMC包括表达所有TLR的混合白细胞群(单核细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)。转染后24小时，通过多重ELISA分析细胞培养上清液中细胞因子表达。

发现siG12D在剂量反应中诱导了IFN-α、IL1-RA、IL-8和MCP-1的水平，在50nM的剂量下观察到几乎可以忽略不计的效果。在所有水平下观察到的应答均比阳性对照siRNA(25mer平末端)弱(图3)。

除了上述体外实验外，还进行了体内实验以评估由siG12D-LODER诱导先天免疫系统的潜力。通过将处于对数生长期的10⁶个活Panc 02细胞(在150μL PBS中)皮下注射到C57BL/6小鼠的腹侧中建立了肿瘤异种移植物。当测量到肿瘤的平均体积为80mm³时，根据体积将小鼠分成相等的组。在麻醉下将siG12D-LODER或空白LODER植入肿瘤中(一个LODER/肿瘤)。用于植入小鼠中的LODER与上文实施例1中所描述的类型相同。通过卡尺测量来追踪肿瘤生长。为了探索在用siG12D-LODER治疗后肿瘤组织中IFN-β诱导的模式，我们检测了周围肿瘤组织中IFN-β的相对水平随着距LODER边界的径向距离的变化。将肿瘤用福尔马林固定并石蜡包埋(FFPE)，切片，并从玻片上刮下组织用于RNA纯化。基因表达通过RT-PCR定量。在距LODER 1、2、3、4和5mm径向距离的宽度为1mm的同心环中径向刮除肿瘤组织切片。结果表明，siG12D-LODER以5μg的低siG12D剂量主要在肿瘤边界中诱导IFN-β，这表明在组织中，巨噬细胞参与了免疫诱导。在用15μgsiG12D/LODER的高剂量治疗的肿瘤中，在整个肿瘤中均观察到了IFN-β的诱导(图4)。

实施例3：在体内siG12D-LODER对T细胞浸润到肿瘤中的影响

实施例1描述了siG12D-LODER如何增加肿瘤坏死和空隙体积。该实施例证实了siG12D-LODER的这种作用还增强了同基因的原位胰腺癌模型中肿瘤内T细胞的浸润和分布。因此，该实施例表明，递送siRNA的LODER可以调理(即增强其功效)实体瘤中的免疫疗法。

在原位植入之前，将来自Pdx1-Cre；LSL-KRAS^(G12D)/+；P53^-/-转基因小鼠的胰腺肿瘤同种异体移植物皮下维持在C57BL/6小鼠中。当种子肿瘤的体积达到700～1000mm³时，收集肿瘤并将其切成直径约4mm的片。将siG12D-LODER插入用于治疗组的每个肿瘤片中。植入的siG12D-LODER具有与上述实施例1中描述的LODER相似的特点，但直径为～0.8mm。对于未经治疗的组，对肿瘤片进行假手术。将有或没有LODER的肿瘤片缝入C57BL/6小鼠的胰腺中。接种肿瘤两周后，处死小鼠，并取出肿瘤用于组织学分析。图5A-图5C示出了在治疗的样品和未治疗的样品之间对CD4染色(识别CD4+T细胞)的比较。在siG12D-LODER治疗的肿瘤中，在距LODER边缘的不同距离处计数了对CD4染色呈阳性的细胞。在未治疗的肿瘤中，在距肿瘤中心不同距离处计数了CD4-阳性细胞。这是通过计数LODER边缘/肿瘤中心周围宽度为0.5mm的同心环内阳性染色的细胞来完成的。对每个同心环内的所有细胞进行计数，并计算阳性染色的细胞浓度。在治疗的和未治疗的样品中，阳性染色的细胞分别在图5A和图5B中示出。图5C中显示的量化和比较结果显示，siG12D-LODER治疗后肿瘤中部的CD4+ T细胞浓度更高。

实施例4：在体内siG12D-LODER对T细胞浸润到肿瘤中的影响

该实施例将证明siG12D-LODER对同基因的皮下肿瘤模型中肿瘤内T细胞的浸润和分布的影响。

该实验将测试siG12D-LODER对免疫细胞浸润到实体瘤(T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)中的影响，以及其他免疫相关的影响。CT26小鼠结肠癌细胞系通常用于药物开发，并且也已经用于几种批准的免疫肿瘤学药物(伊匹单抗(Yervoy)、纳武单抗(Opdivo)、阿特珠单抗(Tecentriq))的开发。

CT26细胞是KRAS G12D突变的，并且先前已显示在体外通过Silenseed受到siG12D治疗的影响(细胞存活率降低)。因此，CT26细胞系可以用作良好模型来测试siG12D-LODER治疗对实体瘤中免疫细胞浸润的影响。

将CT26细胞皮下注射到Balb/c小鼠的右侧腹中。当肿瘤达到～80mm³(通过卡尺测量为～5.5-6mm的直径)的最小尺寸时，将小鼠分为具有相似平均肿瘤尺寸的组用于以下治疗：(1)未经治疗(6只小鼠)；(2)空白LODER(6只小鼠)；以及(3)siG12D-LODER(12μg)(6只小鼠)。所使用的LODER具有与上述相同的特点，具有～0.8mm的直径。

LODER植入后一周，处死小鼠并取肿瘤用于以下分析：肿瘤尺寸和组织学。为了进行组织学分析，将肿瘤切成两半。将以这样的方式切割植入LODER的肿瘤，使得切口的平面将穿过LODER。组织和细胞结构将通过标准H&E染色来进行观察。免疫组织化学染色将用于检测KRAS/KRAS G12D、CD3、CD4、CD8、FoxP3、F4/80、CD335和IFNg。

预期与之前的实施例一样，来自siG12D-LODER治疗的肿瘤的样品将显示出比未治疗的肿瘤更大量的免疫细胞浸润。

实施例5：在体外siG12D对T细胞和NK细胞的浸润的影响

该实施例将证明在多腔室细胞迁移模型中，siG12D对T细胞和NK细胞迁移至肿瘤培养物中的影响。

将PANC-1细胞接种至80％汇合，并在第二天，使用Lipofectamine 2000转染：siG12D、聚(I:C)，以及模拟转染，

转染后一天，将细胞分离、计数并接种到孔径为8μm的跨孔(Transwell)板的下部腔室中，并生长至汇合。每个板的上部腔室负载有Jurkat T细胞或CD8+T细胞或NK细胞(将2×10⁵Jurkat细胞负载到6孔跨孔板中(Del Galdo andJimenez 2007)。

然后将跨孔板温育3小时或6小时；并在每个时间点拍摄下部腔室(在200×放大倍率下，6个随机视野)。

已经迁移到下部腔室中的Jurkat和/或CD8+T细胞和/或NK细胞通过比色试验来计数或评估。每个实验将一式三份进行。

实施例6：免疫疗法+/-siG12D-LODER的临床研究

该实施例将示出免疫疗法与超声引导的内窥镜给药siG12D-LODER的结合的效果。

在该研究中，将向胰腺癌患者提供免疫治疗剂(例如纳武单抗、伊匹单抗或帕博利珠单抗)，和有或者没有另外的化学治疗剂(FOLFIRINOX、吉西他滨+/-白蛋白结合型紫杉醇)。将对患者进行为期两年的随访以测量肿瘤总体反应率(ORR)，作为主要终点并用于无进展生存率(PFS)和总体生存率。

有许多可能的实施方式用于安排每种药物类型的给药。例如，药物可以作为佐剂或新佐剂提供。在一种实施方式中，首先(例如在筛选之后)提供siG12D-LODER，然后一-两周后给药IO试剂，以及有/没有化学疗法。

在另一实施方式中，患者已经在接受IO或化学疗法或组合的全身治疗，并且另外提供了siG12D-LODER。

患者分期不限于特定阶段。例如，局部晚期胰腺癌(LAPC，III期)可以成为目标人群。然而，在另一实施方式中，可以包括IV(转移的)期。在另一实施方式中，从I到IV的所有阶段可以被包括在纳入标准中。

用于人类临床的siG12D-LODER长度为5.5±1.0mm，并且具有0.80±0.04mm的直径，具有与上述相同的PLGA基质，其中siG12D嵌入聚合物基质中。

患者的年龄和性别不受限制。在一种实施方式中，18岁至76岁的年龄范围满足纳入标准。

每种药物的剂量不受限制。在一种实施方式中，患者每3个月接受6次LODER的给药(每次给药～2000μg的siG12D)。

参考文献

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鉴于许多可能的实施方式可以应用本公开的发明原理，应当认识到，所示出的实施方式仅是本发明的优选实例，而不应视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们主张所有落入这些权利要求的范围和精神内的内容都是我们的发明。

序列表

<110> 思兰斯德有限责任公司（Silenseed Ltd）

<120> 用于癌症免疫疗法的组合物和方法

<130> PN19042727P

<150> US 62/510281

<151> 2017-05-24

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> DNA

<400> 8

uccuccaucg guuggucuut t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> 2'-O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> DNA

<400> 9

guuggagcug auggcguagt t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> O-甲基修饰的残基

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> DNA

<400> 10

cuacgccauc agcuccaact t 21

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 11

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 12

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 13

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp

1 5 10

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> DNA

<400> 14

cuuacgcuga guacuucgat t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> DNA

<400> 15

ucgaaguacu cagcguaagt t 21

Claims

1.一种用于调理受试者中的实体瘤以进行免疫疗法治疗的组合物，所述组合物包括：

包含化学治疗剂的聚合物药物递送装置，

其中，所述化学治疗剂递送至所述受试者调理所述实体瘤以进行所述免疫疗法治疗。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述聚合物药物递送装置包括生物相容性聚合物基质，所述生物相容性聚合物基质包括选自由以下组成的组的聚合物：聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)和聚己内酯(PCL)，含有或不含有包括冷冻保护剂的添加剂。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述化学治疗剂是核酸、肽、小分子、抗体或其片段，或其组合。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述核酸包括单链RNA或双链RNA干扰(RNAi)试剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述RNAi试剂是KRAS siG12D。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述聚合物药物递送装置是包括75-90％的PLGA(85:15)；5-15％的甘露醇和0.1-0.5％的碳酸氢钠的LODER。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，还包括免疫疗法组合物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述免疫疗法组合物选自由PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂组成的组。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述PD-1抑制剂是帕博利珠单抗(Keytruda)或纳武单抗(Opdivo)或其生物类似物，其中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Imfinzi)或其生物类似物；并且其中，所述CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)或其生物类似物。

10.一种用于治疗实体瘤的组合物，所述组合物包括：

包含化学治疗剂的聚合物药物递送装置；以及

免疫疗法组合物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述聚合物药物递送装置包括生物相容性聚合物基质，所述生物相容性聚合物基质包括选自由以下组成的组的聚合物：聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)和聚己内酯(PCL))，含有或不含有包括冷冻保护剂的添加剂。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的组合物，其中，所述化学治疗剂是核酸、肽、小分子、抗体或其片段，或其组合。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述核酸包括单链RNA或双链RNA干扰(RNAi)试剂。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述RNAi试剂是KRAS siG12D。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的组合物，其中，所述聚合物药物递送装置是包括75-90％的PLGA(85:15)；5-15％的甘露醇和0.1-0.5％的碳酸氢钠的LODER。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的组合物，其中，所述实体瘤是胰腺肿瘤。

17.根据权利要求11-16所述的组合物，其中，所述免疫疗法组合物是PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂中的至少一种。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述PD-1抑制剂是帕博利珠单抗(Keytruda)或纳武单抗(Opdivo)或其生物类似物；其中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Imfinzi)或其生物类似物；并且其中，所述CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)或其生物类似物。