CN114126710A - 含有孕酮的eva分段式阴道内环 - Google Patents

Abstract

本文公开含有孕酮的EVA分段式阴道内环，其可用于预防宫颈缩短受试者的早产或治疗黄体期缺乏或作为黄体期支持。

Description

含有孕酮的EVA分段式阴道内环

相关申请

本申请要求于2019年3月29日提交的美国第62/826,978号和于2019年5月3日提交的美国第62/843,288号的优先权。其公开内容通过引用并入本文，包括附图。

技术领域

本发明涉及阴道内环领域，特别是分段式乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)阴道内环，及其用于治疗、改善或预防早产和用于辅助生殖技术(ART)的用途。

背景技术

早产(定义为在完成妊娠的37周之前出生)是每年新生儿死亡的主要原因，每年造成100多万例死亡，其占每年400万例新生儿死亡和每年320万例死产的27％[1]。最近，美国疾病控制与预防中心总结了对降低早产和婴儿死亡率的新治疗策略的需求[2,3]。在全球范围内，世界卫生组织报告说，每年有1500万例早产儿。数据还表明，大多数国家的早产率正在上升，并且早产是5岁以下儿童死亡的第二大原因，仅次于肺炎[4]。

妊娠中期的短宫颈是预测新生儿早产的最可靠指标。早产儿在生命的各个阶段都有更大的罹患慢性和危及生命的疾病的风险。在婴儿期，这些疾病包括呼吸窘迫综合征、坏死性小肠结肠炎、脑室内出血、早产儿视网膜病变和脓毒病。在幼儿期，他们出现发育迟缓、行为和学习问题以及哮喘的风险增加。在成年期，早产儿患动脉高血压、糖尿病、心血管疾病和中风的风险增加[16-19]。十多年的证据支持阴道给药P来预防在妊娠中期具有短宫颈的妇女早产[8,20,9,21,22]，然而仍然没有FDA批准的孕酮产品用于该适应症。

孕酮(P)是一种天然存在的类固醇，主要由卵巢和胎盘分泌。妊娠期间，P有助于子宫生长[5,6]。在许多哺乳动物物种中，P在子宫静止(即，预防分娩)中起直接作用，并且分娩开始之前P血浆浓度降低。P在人类分娩开始时的作用不那么明显[7]。尽管P活性的错误调节导致宫颈缩短和早产(PTB)的确切机制尚不清楚，但有证据表明直接向宫颈递送补充的天然P以延长妊娠期的治疗效果。Fonesca等人证明在宫颈长度为≤15mm的女性中每日阴道给药200mg微粉化P胶囊

可使妊娠期<34周的PTB率降低44％[8]。DeFranco等人报告了类似的发现[9]。每日给药微粉化P凝胶

可降低正常宫颈长度在10至20mm之间的女性的PTB发生率[10]。此外，P与呼吸窘迫综合征的发病率显著降低相关联。Crinone和Prometrium不适合用于女性预防早产的治疗。合成孕酮产品17-α-己酸羟孕酮酯(17-OHPC，

)用于降低具有单胎自然早产史的单胎妊娠女性的早产风险；然而，Makena不能有效预防短宫颈长度(SCL)的单胎孕妇的早产[11,12]。

尽管已发表的证据、医疗指南和共识声明建议使用阴道P预防SCL和单胎妊娠女性的早产，但关于P的最佳制剂和剂量的数据很少。尚未直接比较来自凝胶和胶囊产品的P的系统吸收。

阴道孕酮在体外受精中用作黄体期支持物也在研究中，尽管剂量、时间、给药途径、开始治疗的时间和使用持续时间尚未确定(参见Lockwood等人(2014)，《生育与不孕(Fertility and Sterility)》，102(1)：112-119。

已经有许多IVR制剂被设计成在较长时间段内释放P。一种早期的P-释放性IVR的实例是产后哺乳期妇女用于节育的硅胶储液器装置[27]。这些IVR被设计成每天释放约5mg，持续90天。最近，在几个南美国家开发和商业化了另一种硅胶IVR(

Grunenthal实验室)。Progering每天释放约10mg的P，持续90天[28-30]。阴道环释放P也被研究用于在体外受精期间的黄体支持[31-35]，尽管这些药物目前尚未被监管机构批准使用。

因此，对于因SCL而有早产风险的女性开发P释放IVR环以及用于ART的需求尚未得到满足。

发明内容

本文描述了基于EVA的分段式阴道内环(IVR)，其设计用于在2至14天内每天释放约4至约12mg的孕酮(P)。

在一些实施例中，P的释放速率在4mg/天至约12mg/天的范围内，其包括落在4mg/天至约12mg/天之间的范围。例如，但不限于，约5mg/天至约12mg/天、约6mg/天至约8mg/天、约4mg/天至约7mg/天、约10mg/天至约12mg/天等。在一些实施例中，P的释放速率的量是在4mg/天至约12mg/天范围内的单个值，例如，约5mg/天、约7mg/天、约9mg/天等。

本公开的一方面是乙烯-乙酸-乙烯酯(EVA)阴道内环(IVR)，其中环含有至少两个片段/纤维，其中一个片段含有孕酮(P)或P等效物。在该方面的实施例中，环的直径为约57mm，横截面直径为约5mm。

在一个实施例中，EVA环在插入的第1天后释放约4mg/天的P。

在另一实施例中，EVA环在插入的第1天后释放约8mg/天的P。

在另一实施例中，EVA环在插入的第1天后释放约12mg/天的P。

在EVA环的又一个方面，含有P的EVA片段使用EVA(约28％乙酸乙烯酯含量)制备，其最终载药量为约27％w/w。

在EVA环的一些实施例中，包含P的EVA片段的长度为约74.5mm至约156.0mm或约74.5mm至约148.5mm。

在EVA环的一些实施例中，包含P的EVA片段的长度选自约74.5mm、约148.5mm和约156.0mm的尺寸。

在一些实施例中，EVA环的P释放速率在约2天至约14天的时间段内为约4mg/天、约8mg/天或约12mg/天。

在EVA环的一些实施例中，4mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约20.5±2.2；第2至14天为约3.8±1.3，并且在第14天为约2.3±1.5。

在EVA环的一些实施例中，8mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约38.4±3.3；第2至14天为约7.4±2.4，并且在第14天为约4.7±1.9。

在EVA环的一些实施例中，12mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约60.5±2.5；第2至14天为约11.5±2.8，并且在第14天为约7.3±3.8。

在EVA环的一些实施例中，4mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约969±145。

在4mg/天P EVA环的一些实施例中，AUC_0-336h pg h/ml为约153,000±38,900。

在4mg/天P EVA环的一些实施例中，C_AVG(pg/ml)为约455±116。

在4mg/天P EVA环的一些实施例中，T_max(h)为约12。

在8mg/天P EVA环的一些实施例中，C_max(pg/ml)为约1,820±469。

在8mg/天P EVA环的一些实施例中，AUC_0-336h为229,000±40,700。

在8mg/天P EVA环的一些实施例中，C_AVG为约682±121。

在8mg/天P EVA环的一些实施例中，T_max为约2。

在12mg/天P EVA环的一些实施例中，C_max(pg/ml)为约2,520±432。

在12mg/天P EVA环的一些实施例中，AUC_0-336h(pgh/ml)为约350,000±73,900。

在12mg/天P EVA环的一些实施例中，C_AVG(pg/ml)为约1,040±220。

在12mg/天P EVA环的一些实施例中，T_max(h)为约4。

在本公开的一方面，所公开的EVA环用于预防其中被治疗的受试者宫颈缩短的早产。

在本公开的另一方面，所公开的EVA环用于治疗或改善黄体期缺乏或作为黄体期支持。

在本公开的另一方面，EVA环用于为接受辅助生殖治疗的女性提供黄体期支持的孕酮。

在一些实施例中，所公开的EVA环用于治疗或改善与低卵泡刺激素(FSH)水平、改变的FSH/促黄体激素(LH)比率或异常的FSH和LH脉动性相关联的黄体期缺乏。

在一些实施例中，黄体期缺乏是由异常FSH或LH脉动性引起的，其是由下丘脑性闭经、甲状腺和催乳激素紊乱、肥胖症和多囊卵巢综合征(PCOS)以及IVF周期的受控卵巢刺激(COS)引起的。

在一些实施例中，所公开的环用于在尚未达到绝经期但由于体内缺乏孕酮而没有月经期的女性中引起月经期，或用于在接受雌激素替代疗法的绝经后女性中防止子宫内膜过度生长。

附图说明

图1示出了用于制备本文描述的分段式EVA环的示意图。

图2.P从IVR的体外释放(4mg/d、8mg/d和12mg/d)。数据为平均值±SD(n＝6)。

图3.每天给予一次Crinone 8％凝胶(90mg P)和Prometrium 200mg胶囊后第14天P的血浆浓度－时间曲线。数据为平均值±SD(n＝3)。

图4.单次给药IVR后，以4mg/d、8mg/d和12mg/d释放P从第0天至第14天的P的血浆浓度－时间曲线。数据为平均值±SD(n＝5)。

具体实施方式

本文公开了递送相对恒定剂量的P的14天分段式IVR。本文描述的IVR由EVA组成，并且被配制成基质装置。本文公开的IVR可用于治疗(例如，治愈、抑制)、改善和/或预防(例如，延迟或预防早产的发作、复发或再发)，并且还可用作体外受精中的黄体期支持。

与其它EVA环系统相比，本文描述的分段式环的优点在于，可以在EVA浓度为约27％至约36％的狭窄范围内优化分段的负载。这个范围，在约28％的乙酸乙烯酯含量中，确保了一个稳定的体系，避免了处于完全分散在聚合物中的药物和分散在聚合物中的结晶药物颗粒之间的转变点或其周围。本文描述的EVA环系统的第二个优点是能够通过片段长度的变化轻松地改变释放速率。因此，为剂量范围研究的临床用品的制备是很简单的。

在本文描述的本发明的一些方面中，在提供数值范围的情况下，应当理解，在所述范围的上限与下限之间的每一中间值到下限单位的十分之一(除非上下文另有明确规定)以及所述范围内的任何其它所陈述或中间值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，但受所述范围内的任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之一或两者的范围也包括在本发明中。例如，27％至36％的范围将包括27％至29％，或27％至33％，或33％至35％等。此类范围还将包括该范围内的单个点，例如28％、29％、30％等。

本文公开的IVR被设计为在约2天至约14天的时间段内具有约4mg/天、约8mg/天和约12mg/天的P释放速率，或约4mg/天至约12mg/天的P释放范围。

在一些实施例中，4mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约20.5±2.2；第2至14天为约3.8±1.3，并且在第14天为约2.3±1.5。

在一些实施例中，8mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约38.4±3.3；第2至14天为约7.4±2.4，并且在第14天为约4.7±1.9。

在一些实施例中，12mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约60.5±2.5；第2至14天为约11.5±2.8，并且在第14天为约7.3±3.8。

在一些实施例中，4mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约969±145。AUC_0-336h pgh/ml为约153,000±38,900。C_AVG(pg/ml)为约455±116且T_max(h)为约12。

在一些实施例中，8mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约1,820±469。AUC_0-336h(pgh/ml)为约229,000±40,700。C_AVG为约682±121。T_max(h)为约2。

在一些实施例中，12mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约2,520±432。AUC_0-336h(pgh/ml)为约350,000±73,900。C_AVG(pg/ml)为约1,040±220。T_max(h)为约4。

所公开的IVR通过图1中描述的方法并且以类似于先前描述的方式制备[13]。所有环制造均在QPharma(瑞典马尔默)进行。该方法包括混配粒料、挤出纤维，然后通过热焊接连接纤维。使用Turbula混合器(型号T10B，具有17升不锈钢混合容器，Glenn Mills，新泽西州克里夫顿)完成共混。然后使用双螺杆挤出机(Pharma 11双螺杆热熔挤出机，具有Pharma11重力进料器)通过热熔挤出将所得共混物混配，并进料到Pharma 11空气冷却输送机上，随后使用Pharma 11Vericut Pelletizor造粒机(德国德赖艾希的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))造粒。使用25mm单螺杆挤出机(德国埃伯斯贝格的DrCollin)通过热熔挤出将粒料形成纤维。使用Dr Collin在线切割站切割所得纤维。使用Automationspartner单站实验室焊接机(瑞典

)焊接切割的纤维(或片段)。

在一些实施例中，本文公开的IVR的含有孕酮的片段在约74.5mm至约156.0mm的范围内。在一些实施例中，片段在约74.5mm至约148.5mm的范围内。在一些实施例中，本文公开的IVR的片段为约74.5mm、约148.5mm或约156mm。在一些实施例中，片段含有约5mg至约10mg孕酮或孕酮类似物。在一些实施例中，片段含有约27w/w孕酮。

在一些实施例中，IVR的直径为约57mm，横截面直径为约5mm。

本文公开的阴道内环被设计成在第2天至第14天每天释放约4、8或12mg的P。将本文评价的环，包括安慰剂IVR，给药予未接受药物治疗的卵巢切除的雌性多塞特杂交绵羊14天，然后将其取出，再给药新的P-释放IVR 14天。为了进行比较，一组接受Crinone 8％凝胶(约90mg的P)，第二组接受Prometrium(200mg的P)胶囊，每日一次，阴道内给药。收集的数据包括P的血浆药代动力学和子宫、宫颈和阴道的显微镜评估。

P在14天测试期间的释放速率的特征在于第1天、第2天至第14天的速率和第14天的速率。表1示出了以这种方式从不同P-释放IVR收集的数据。P从第2天到第14天的释放速率接近4mg/d(3.8±1.3mg/d)、8mg/d(7.4±3.3mg/d)或12mg/d(11.5±2.8mg/d)的目标释放速率。体外释放曲线是典型的基质型递送系统，其具有相对快速的药物释放，随后是较慢释放的时期，这可以在图2中看到。

表1. 4mg/d、8mg/d和12mg/d的P IVR的释放速率(mg/d)

测试时间点	4mg/d IVR(mg/d)	8mg/d IVR(mg/d)	12mg/d IVR(mg/d)
				0至24小时	20.5±2.2<sup>a</sup>	38.4±3.3	60.5±2.5
第2至14天	3.8±1.3	7.4±2.4	11.5±2.8
				第14天	2.3±1.5	4.7±1.9	7.3±3.8

所有数据均为平均值±SD(n＝6)

在给药IVR之后，每日阴道环检查证实IVR保持在原位直到在第15天和第29天取出。除了第5组(8mg/d)中的一只动物在第16天被明显地驱逐出去且无法定位外，所有环均在适当的时间内留在原位。因此，在第16天，在该动物体内插入新环。另外，在第21天，在被褥中发现来自第6组(12mg/d)中一只动物的环。目视检查环是否损坏，用温水清洗，干燥并重新插入。

第1组和第2组的P的血浆浓度与时间曲线表明在稳态给药间隔期间稍微快速的吸收过程(T_max为2小时)和10倍浓度范围的一级消除(图3)。表2总结了每日一次阴道给药的Crinone 8％凝胶和Prometrium 200mg胶囊的第14天的PK参数。尽管与Prometrium相比(90mg与200mg)，Crinone 8％凝胶的给药量约为一半，但C_max和AUC_0–24h明显更高，表明从Crinone的吸收率和程度更大。

表2.来自Crinone 8％凝胶(90mg)和Prometrium 200mg胶囊的PK参数

^a基于60kg的绵羊，90mg剂量的P为约1.5mg/kg

^b基于60kg的绵羊，200mg剂量的P为约3.3mg/kg

^cC_AVG＝AUC_0-24h/24h

^d中值(最小值－最大值)，仅在实际采集间隔时报告中值

4、8和12mg/d IVR组的浓度随时间的变化(图4)通常示为持续释放曲线。这表明缓慢释放和吸收过程，是延长的14天曲线中的速率决定步骤。表3示出了在第1天给药后和随后14天的PK参数。通常，来自三种不同IVR的PK参数随着释放速率的增加而增加。虽然没有直接的可比性，但12mg/d IVR的PK参数与Crinone 8％阴道凝胶的PK参数最为相似。在第29天取出IVR(给药第二个环)后，分析环中的残留P。通过将在绵羊中使用14天后在环中测量的P量与在体外溶解下在14天内释放的累积量相加，然后除以通过测定测量的含量来计算释放量。这样做表明，所有环均在质量平衡的±10％范围内。体外溶解和体内释放之间也存在一致性。例如，8mg/d IVR的初始平均负载为14mg P；在动物体内释放14天后，剩余P的平均残留量为387±34mg(n＝5)或在14天内释放130mg P。在体外，14天内P释放的累积量为139mg。对于以4和12mg/d释放P的IVR发现了类似的结果。

表3.阴道内环中P的药代动力学参数

^aC_AVG＝AUC_0-14d/14d

^b中值(最小值－最大值)，仅在实际收集间隔时报告中值

在治疗期间进行的动物评估没有发现异常的物理发现。在几只动物中观察到乳房增大(包括一些在接受研究治疗前乳房增大的动物)，但由于所有动物都有泌乳史，这些观察结果被认为与研究治疗无关。在第4周期间，观察到一只第2组的动物的外阴呈红色，这与阴道刺激结果相关(见下文)。分别在第3周和第3周和第4周在第4组的两只动物中观察到明显的阴道分泌物。在阴道内途径的研究中，排出物的发现很常见。

在治疗期的第1天至第29天进行的外部阴道刺激评估包括等级为0至4的红斑和水肿评估(表4)。对于给药最高IVR剂量(12mg/d)的动物，非常轻微的红斑和焦痂的发病率略有上升；然而，在治疗组中的五只动物中，只有两只受到刺激。在所有其它治疗组中，两次仅在一只动物或一次在两只动物中观察到非常轻微的红斑。在Crinone 8％凝胶和安慰剂以及12mg/d IVR治疗组中，在不超过一次/动物中观察到非常轻微的水肿。所有外部阴道刺激发现都是短暂的，并且在研究终止时不再存在。在IVR治疗组的首次插入后和Crinone 8％凝胶治疗组研究的前14天期间，最常观察到这些发现。

表4.外部和内部阴道刺激评分

^a在第1组至第3组中进行的观察结果总数：外部刺激＝87(n＝3)，且第4组至第6组为145(n＝5)

表4还总结了内部红斑和水肿评分的发病率计数。对于给药低剂量IVR(4mg/d)的动物，非常轻微和明确的红斑的发病率略有上升。在中等剂量(8mg/d)的IVR中，5只动物中有4只观察到非常轻微的红斑。高剂量IVR组(12mg/d)的发病率最低(5只动物中有2只)，其中一只动物观察到非常轻微的红斑，一只动物观察到明显的红斑。在所有其它治疗组中，在任何动物中均未观察到红斑。由于缺乏剂量反应和显微镜下的相关性，这些发现不被认为是IVR相关的。

IVR相关的显微镜观察表明，所有动物的子宫、宫颈和阴道普遍较小且无活性，这在表5中卵巢切除的动物中被认为是正常的特征。包括安慰剂对照组在内的所有动物的阴道内都有少量到轻度的单核细胞浸润，这往往伴随着少量到轻度的中性粒细胞浸润。包括安慰剂对照组在内的两只个体动物的阴道内存在最小的局灶性上皮变性。由于包括安慰剂IVR在内的不同组之间缺乏剂量反应和相似性，这些变化不被认为是IVR相关的。

根据Eckstein(表6)的方法对阴道刺激指数进行的评估显示所有治疗组中的刺激最小，其中在放置IVR的阴道颅部分的刺激分数通常最高。所有组中的中值评分均在最小刺激类别内(定义为1－4分)。

表5.给药安慰剂和活性IVR后子宫、宫颈和阴道(颅、中段和尿路)的组织学结果

表6.集体组平均IVR阴道刺激评分

应用：

本文公开的EVA环可用于在尚未达到绝经但由于体内缺乏孕酮而没有月经期的女性中引起月经期。

本文公开的EVA环可与作为辅助生殖技术(ART)的一部分的生育治疗一起用作黄体期支持。

本文公开的EVA环可用于防止接受雌激素替代疗法的绝经后妇女的子宫内膜过度生长。

本文公开的EVA环可用于治疗黄体期缺乏，如与低卵泡刺激素(FSH)水平、改变的卵泡FSH/促黄体激素(LH)比率和/或异常的FSH和LH脉动性相关联的黄体期缺乏，如功能性下丘脑性闭经、甲状腺和催乳素病症、肥胖症和多囊卵巢综合征(PCOS)和IVF周期的受控卵巢刺激(COS)期间[Palomaba等人，(2015)《卵巢研究期刊(J Ovarian Res.)》，8:77]。

实例

阴道内环

能够释放P的阴道内环以类似于先前所述的方式制备[13]。整个方法如图1所示。所有环制造均在QPharma(瑞典马尔默)进行。该方法包括混配粒料、挤出纤维，然后通过热焊接连接纤维。使用Turbula混合器(型号T10B，具有17升不锈钢混合容器，Glenn Mills，新泽西州克里夫顿)完成共混。然后使用双螺杆挤出机(Pharma 11双螺杆热熔挤出机，具有Pharma 11重力进料器)通过热熔挤出将所得共混物混配，并进料到Pharma 11空气冷却输送机上，随后使用Pharma 11Vericut Pelletizor造粒机(德国德赖艾希的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))造粒。使用25mm单螺杆挤出机(德国埃伯斯贝格的DrCollin)通过热熔挤出将粒料形成纤维。使用Dr Collin在线切割站切割所得纤维。使用Automationspartner单站实验室焊接机(瑞典

)焊接切割的纤维(或片段)。

通过使用不同长度和载药量的纤维制备能够以所需速率释放P的IVR(EP，微粉化，密歇根州卡拉马祖市的辉瑞公司(Pfizer,Inc.))。所有IVR的总直径为57mm，横截面直径为5mm。使用EVA(28％乙酸乙烯酯含量，

加拿大布谢维尔的塞拉尼斯公司(Celanese Corporation)；或宾夕法尼亚州沃林顿的Polysciences公司)制备释放4mg/d和8mg/d的IVR，其最终载药量为27％w/w。为了制作4mg/d的环，含药片段长度为50mm，安慰剂片段长度为113.5mm。用100mm含药片段和63.5mm安慰剂片段制作8mg/d IVR。用载有36％P(w/w)的片段制备12mg/d IVR，其中含药片段为148.5mm和安慰剂片段为15mm。通过焊接74.0、74.5和15mm的三个无药物片段制备安慰剂IVR。每个IVR重约3g。

从IVR体外释放P

在进行绵羊研究之前，在体外测量P从三种IVR制剂中的释放速率以确定是否达到目标释放速率。使用200mL的0.5％十二烷基硫酸钠作为释放介质，在摇动器中在37℃下测试释放速率。在6小时、第1至4天、第7至11天、第14天、第15天、第18天、第21天、第22天、第25天和第28天进行取样(2mL)。使用经确认的反相液相色谱法使用UV检测测定P的浓度。使用的色谱柱是Phenomenex Luna C8(2)，150mm x 3.0mm，5μm。使用的保护柱是Phenomenex C8(4mm x 3mm)。流动相为含乙腈45％的纯化水(55％)，v/v。注射体积为10μL。在245nm下通过UV检测P。P的标准曲线范围为0.00625至0.25mg/mL。在这些浓度下，曲线是线性的(相关系数>0.997)。在每个溶解时间点测试六个IVR。

绵羊研究

本研究的目的是评估未经药物切除卵巢的雌性多塞特杂交绵羊体内P释放和IVR的PK和局部耐受性，并与阴道给药的Crinone 8％凝胶(1.125g或90mg P；新泽西帕西波尼的阿特维斯制药公司(Actavis Pharma))和Prometrium 200mg胶囊(佐治亚州玛丽埃塔的苏威制药公司(Solvay Pharmaceuticals))进行比较。还收集安慰剂IVR组的数据作为比较。

这项动物研究由美国实验动物护理认证协会(AAALAC)认证的合同研究组织机构(密歇根州马塔万市的一家查尔斯河公司MPI Research)进行。本研究按照美国食品药品监督管理局(FDA)良好实验室规范(GLP)条例和美国农业部(USDA)动物福利法案进行。从密歇根州卡帕克的Lauwers Lamb共收到27只未经过实验的雌性单胎多塞特杂交羊，收到时年龄约为15.5至19个月。通过植入的微芯片和单个耳标对动物进行识别。

在适应期间，每天观察动物的总体健康状况和任何疾病症状。对所有动物进行详细的临床检查，并在接收3天内和手术前再次记录体重。所有动物的隐孢子虫和贾第虫属物种均为阴性。在几乎所有动物的粪便样本中均检测到类圆线虫属(Strongyloides)和球虫属(Coccidia)。给动物单次给药芬苯达唑(fenbendazole)(口服10mg/kg)。随机分组时动物体重为57.5至77.0kg。

在计划给药前26至54天之间，所有动物都按照研究机构的标准操作程序进行了切除卵巢的手术。在给药前使动物恢复26至54天。在该恢复期间，每周进行体重测量和临床观察。根据无法检测到的内源性激素水平，所有动物均成功进行了卵巢切除手术。

在研究期间，每天两次观察所有动物的发病率、死亡率、受伤情况以及食物和水的供应情况。在研究期间每周对每只动物进行详细检查。这些观察结果包括对皮肤、皮毛、眼睛、耳朵、鼻子、口腔、胸部、腹部、外生殖器、四肢和足部、呼吸和循环影响、自主神经影响(如流涎)以及神经系统影响(包括震颤、抽搐、处理反应性和异常行为)的评估。

将动物随机分配至六个治疗组之一：第1组(n＝3)Crinone 8％凝胶；第2组(n＝3)Prometrium 200mg胶囊；第3组(n＝3)安慰剂IVR；第4组(n＝5)4mg/d IVR；第5组(n＝5)8mg/d IVR；或第6组(n＝5)12mg/d IVR。

IVR置于2至8℃下储存直至使用，并在给药前加热至室温30至120分钟；根据其标签，将Crinone 8％凝胶和Prometrium 200mg胶囊保持在室温下。在第1天和此后±2小时至第28天每天给药Crinone 8％凝胶和Prometrium 200mg胶囊。在第1天插入的所有IVR在第14天保持在原位；然后取出环，在第15天插入新环。第二个环保持在原位，直到第29天取出。阴道环插入作为清洁程序进行。在使用戴手套的手指以数字方式插入颅阴道之前，对IVR进行拍照。在治疗期间，每天对动物进行数字检查以确认IVR仍在原位。

在第29天治疗结束后，从每只动物中取出IVR，拍照并储存在2至8℃下，然后返回进行残留P含量分析。每个IVR中的残留P如下进行。将每个IVR切成2至3个片段，然后置于200mL容量瓶中。将四氢呋喃(100mL，在37℃下)加入到含有环片段的每个烧瓶中，并以约180rpm的速度振荡2小时。在IVR溶解后，通过加入甲醇(90mL)使EVA沉淀。使所得溶液通过0.45μm过滤器。用45mL的乙腈/H2O(70:30)稀释滤液(5mL)。P的量使用经确认的HPLC方法使用220nm下的UV检测来测定。理论质量平衡通过将使用后存在于装置中的P的量与IVR释放的量(取自体外IVR的初始释放测试)相加并除以理论药物含量来计算。将给药后IVR中剩余的P的量确定为对IVR性能的总体检查，并且结果不旨在与PK结果相关。

药代动力学(PK)

采集所有动物的血液样本，用于测定血浆P浓度(如适用)；在采血前不对动物禁食。第1组至第6组的样本在卵巢切除术前第14天收集(以确认卵巢切除成功)。在第1组和第2组中，在给药前第14天和给药前第7天以及给药后1、2、4、8、12和24小时再次收集血浆。在第3组中，在给药前第1天和给药后1、4、336和672小时收集血浆。在第4、5和6组中，在IVR插入前(0小时)和给药后2、4、8、12、24、48、72、168、240、336小时(取出前)收集血浆。

将血液样本置于含有K₂-EDTA的试管中，并在样本收集的60分钟内在冷藏条件下离心。将所得血浆在样本收集的120分钟内在－60至－90℃下冷冻储存。将血浆样本在干冰上运输用于分析(科罗拉多州科泉市的Pyxant Labs,Inc.)。使用根据生物分析方法指南确认的液相色谱－质谱/质谱法分析血浆样本。P的标准曲线范围为0.1至20ng/mL。基于质控样本，P的准确度范围为96.5－98.0％。P的精密度(％CV)小于7.5％。定量下限(LLOQ)为0.1ng/mL，定量上限为20ng/mL。对于PK分析，低于LLOQ的浓度设置为零。

使用标准的非房室PK分析方法。通过梯形规则估算浓度－时间曲线下面积(AUC)值。给药Crinone 8％凝胶和Prometrium 200mg胶囊(AUC_0-24h/24h)或给药IVR(计算为AUC_0336h/336h)后测定C_avg(定义为整个给药间隔的平均血浆浓度，以AUC_TAU/给药间隔计算，其中TAU是稳态数据的给药间隔)。

耐受性：评估描述，评分量表

在给药所有供试品之前检查所有动物的外部阴道(外阴和前庭的外部可见部分)，并且在每日环检查或产品给药之前的第2至29天进行每日检查。观察外部阴道是否有明显的刺激迹象(即，红斑和水肿)和任何其它局部或全身效应症状。基于Draize量表[14]对刺激进行评分；红斑和水肿形成按0级(无)至4级(严重)分级。在第29天尸检时使用相同的量表对内部阴道的刺激进行评分(活体评估期间不可见的部分)；还记录了任何其它局部或全身效应症状。

尸检

在第29天，在外部阴道刺激评分和环移除后，对所有组中的动物实施安乐死。尸检时，对生殖器官和周围组织进行宏观检查，收集子宫、宫颈和阴道并将其固定在10％中性缓冲福尔马林中。由经过委员会认证的兽医病理学家(J.D.V)对常规处理的苏木精和曙红染色的载玻片进行生殖组织的显微镜检查。

基于Eckstein等人[15]描述的兔阴道刺激方法对阴道刺激进行评分。对于每只动物，分别对包括与宫颈相邻的部分(颅)、中间部分(中段)和尿道水平处的部分(尿路)在内的3个阴道区域的4个参数(上皮损伤、血管充血、水肿和白细胞浸润)进行评分，每个参数的评分为0(正常)至4(显著)。通过取每个部位所有4个参数的评分总和，除以动物数量，并从相似条件下的伴侣研究中减去安慰剂对照组的平均值，计算出每组的每个阴道区域的总阴道刺激评分。因此，总阴道刺激评分范围为0至最大值16。

统计分析

数据的统计分析限于计算描述性统计，包括平均值、标准差(SD)、每组和时间段的组大小(连续终点)，以及每组和时间段的中位数或事件计数(分类终点)。

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本文引用的所有参考文献通过引用并入。

应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，此类实施例当然可能有所不同。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

Claims (32)

1.一种乙烯-乙酸-乙烯酯(EVA)阴道内环(IVR)，其中所述环含有至少两个片段/纤维，其中一个片段含有孕酮(P)或P等效物。

2.根据权利要求1所述的EVA环，其进一步包含其中所述EVA环在插入的第1天后释放约4mg/天至约12mg/天的P。

3.根据权利要求2所述的EVA环，其中所述EVA环在插入的第1天后释放约4mg/天的P。

4.根据权利要求1所述的EVA环，其中所述EVA环在插入的第1天后释放约8mg/天的P。

5.根据权利要求1所述的EVA环，其中所述EVA环在插入的第1天后释放约12mg/天的P。

6.根据权利要求1至5所述的EVA环，其中含有P的EVA片段使用EVA(约28％乙酸乙烯酯含量)制备，其最终载药量为约27％w/w。

7.根据权利要求1至6所述的EVA环，其中所述含有P的EVA片段的长度为约74.5mm至约156.0mm。

8.根据权利要求7所述的EVA环，其中所述含有P的EVA片段的长度为约74.5mm至约148.5mm。

9.根据权利要求7所述的EVA环，其中所述含有P的EVA片段选自由约74.5mm、约148.5mm和约156.0mm组成的组。

10.根据权利要求1至9所述的EVA环，其中所述环的直径为约57mm，横截面直径为约5mm。

11.根据权利要求2所述的EVA环，其中P的释放速率在约2天至约14天的时间段内为约4mg/天、约8mg/天或约12mg/天。

12.根据权利要求11所述的EVA环，其中4mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约20.5±2.2；第2至14天为约3.8±1.3，并且在第14天为约2.3±1.5。

13.根据权利要求11所述的EVA环，其中8mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约38.4±3.3；第2至14天为约7.4±2.4，并且在第14天为约4.7±1.9。

14.根据权利要求11所述的EVA环，其中12mg/天孕酮分段式IVR的释放速率在0至24小时内为约60.5±2.5；第2至14天为约11.5±2.8，并且在第14天为约7.3±3.8。

15.根据权利要求3所述的EVA环，其进一步包含其中所述4mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约969±145。

16.根据权利要求15所述的EVA环，其进一步包含其中AUC_0-336h pg h/ml为约153,000±38,900。

17.根据权利要求16所述的EVA环，其进一步包含其中C_AVG(pg/ml)为约455±116。

18.根据权利要求17所述的EVA环，其进一步包含其中T_max(h)为约12。

19.根据权利要求4所述的EVA环，其进一步包含其中所述8mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约1,820±469。

20.根据权利要求19所述的EVA环，其进一步包含其中所述AUC_0-336h为229,000±40,700。

21.根据权利要求20所述的EVA环，其进一步包含其中所述C_AVG为约682±121。

22.根据权利要求21所述的EVA环，其进一步包含其中所述T_max为约2。

23.根据权利要求5所述的EVA环，其进一步包含其中所述12mg/天孕酮分段式IVR的C_max(pg/ml)为约2,520±432。

24.根据权利要求23所述的EVA环，其进一步包含其中所述AUC_0-336h(pg h/ml)为约350,000±73,900。

25.根据权利要求24所述的EVA环，其进一步包含其中所述C_AVG(pg/ml)为约1,040±220。

26.根据权利要求25所述的EVA环，其进一步包含其中所述T_max(h)为约4。

27.根据权利要求1至26所述的EVA环，其中所述环用于预防其中被治疗的受试者宫颈缩短的早产。

28.根据权利要求1至26所述的EVA环，其中所述环用于治疗或改善黄体期缺乏或作为黄体期支持。

29.根据权利要求28所述的EVA环，其中所述黄体期支持与辅助生殖技术一起使用。

30.根据权利要求29所述的EVA环，其中所述黄体期缺乏与低卵泡刺激素(FSH)水平、改变的FSH/促黄体激素(LH)比率或异常FSH和LH脉动性相关联。

31.根据权利要求30所述的EVA环，其中所述异常FSH和LH脉动性是由下丘脑性闭经、甲状腺和催乳素紊乱、肥胖症和多囊卵巢综合征(PCOS)以及IVF周期的受控卵巢刺激(COS)引起的。

32.根据权利要求1至25所述的EVA环，其中所述环用于在尚未达到绝经但由于体内缺乏孕酮而没有月经期的女性中引起月经期，或用于在接受雌激素替代疗法的绝经后女性中防止子宫内膜过度生长。

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